肺癌的抗原蛋白及其編碼基因和治療性肺癌疫苗的制備方法
【專利摘要】本發明提供了一種肺癌的抗原蛋白及其編碼基因和治療性肺癌疫苗的制備方法，首先選用的MUC1多肽表位靶點，該靶點是正常細胞沒有的，只有癌癥細胞和癌前期細胞特異表達，具有很好的安全性。其次選擇的佐劑Cs直接和MNR通過基因融合重組表達偶聯，增加了MNR蛋白的免疫原性。
【專利說明】
肺癌的抗原蛋白及其編碼基因和治療性肺癌疫苗的制備方法
技術領域
[0001] 本發明涉及一種肺癌的抗原蛋白及其編碼基因和治療性肺癌疫苗的制備方法。
【背景技術】
[0002] 我國每年的新發癌癥病人約有250萬，因癌癥而死亡的人數約為140萬。未來空氣、 水質污染、環境破壞可能進一步提高癌癥的發病率和病死率。從病種看，居全國惡性腫瘤發 病第一位的是肺癌，其次為胃癌、結直腸癌、肝癌和食管癌，居全國死亡第一位的仍是肺癌， 其次為肝癌、胃癌、食管癌和結直腸癌。
[0003] 癌癥治療藥物的研究是當今國際上的研究熱點。癌癥治療除了手術、化療、放療 外，生物免疫治療近年來發展迅速，細胞治療、抗體治療和疫苗治療形成三足鼎立之勢，大 有圍癌癥而殲滅之可能。疫苗治療癌癥應用方便，效果顯著，深受廣大患者歡迎。接種腫瘤 疫苗是免疫治療方法中的一種，其原理是利用腫瘤細胞或腫瘤抗原物質誘導機體產生特異 性細胞免疫和體液免疫反應，即激活患者自身的免疫系統，來增強機體的抗癌能力，進而阻 止腫瘤的生長、擴散和復發，最終達到控制甚至清除腫瘤的目的。腫瘤不是外來的，而是自 體細胞發生的，因此機體對它的反應不如對細菌、病毒的反應那樣強烈，以致早期癥狀不明 顯，發現的時候腫瘤往往已經到了晚期階段，腫瘤細胞發生了轉移，所有的治療方法都無法 達到治愈的目的。而接種腫瘤疫苗則可以在腫瘤發生的早期就可以高效、特異地清除腫瘤， 而且不良反應小。此外，腫瘤疫苗治療也可與手術治療、放療及化疔相結合，在綜合治療腫 瘤中占有重要地位。
[0004] 腫瘤疫苗來源于自體或異體腫瘤細胞或其粗提取物，帶有腫瘤特異性抗原或腫瘤 相關抗原。它可通過激發特異性免疫功能來攻擊腫瘤細胞，克服腫瘤產物所引起的免疫抑 制狀態，增強腫瘤相關抗原的免疫原性，提高自身免疫力來消滅腫瘤。腫瘤特異性抗原的免 疫治療可以啟動以腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞反應為主的抗腫瘤效應，有效打擊腫瘤， 防止轉移、復發且不傷及正常組織，其抗腫瘤特異性和免疫記憶性是其他方法所不能比擬 的，具有療效高、特異性強、不良反應小等優點。根據腫瘤疫苗的具體用途，可分為兩種:一 種是預防性疫苗，如用與某些特殊腫瘤發生有關的基因或抗原制備疫苗，接種于具有遺傳 易感性的健康人群，進而可以控制腫瘤的發生。另一種是治療性疫苗，它以腫瘤相關抗原為 基礎。
[0005] 免疫系統對惡性細胞的免疫監控失敗時出現癌癥，癌細胞局部或全身出現免疫抑 制狀態。細胞惡化過程中出現遺傳和表觀遺傳的改變，合成一些突變的蛋白或改變一些基 因的表達水平;癌變細胞基因組不穩，更易累積遺傳改變，增加了潛在的抗原；癌細胞細胞 內和微環境中的因素會促進癌細胞產生適應性反應、蛋白翻譯和降解發生改變，在細胞表 面出現免疫多肽組的改變，表達和正常細胞表達的質和量是不一樣的腫瘤相關抗原。
[0006] 利用腫瘤相關抗原誘發腫瘤特異的免疫反應具有重要價值，其原理是通過激活患 者自身免疫系統，利用腫瘤細胞或腫瘤抗原物質誘導機體的特異性細胞免疫和體液免疫反 應，增強機體的抗癌能力，阻止腫瘤的生長、擴散和復發，以達到清除或控制腫瘤的目的。一 種方法就是將純化或者重組的腫瘤相關抗原和佐劑一起注射，誘發體液免疫和細胞免疫。 細胞免疫在腫瘤殺傷中作用舉足輕重，常用的方法是聯合使用共刺激分子或免疫性化學治 療、放療和免疫監測點阻斷劑。臨床試驗中可采用注射一種或多種MHC(主要組織相容性抗 原）限制性腫瘤相關抗原來源表位多肽，這種表位可以和抗原遞呈細胞表面的MHC分子結 合，直接呈遞給T細胞。臨床試驗中可采用全長的腫瘤相關抗原、表位合成長多肽或糖化多 肽模擬體。表位合成長多肽在使用上不受病人MHC限制，它被DC等抗原遞呈細胞加工和呈遞 誘導免疫反應。糖化多肽模擬體可以用于血液病等腫瘤的治療。多肽癌癥疫苗一般加 Montanide ISA-51作為佐劑，皮下或腫瘤內注射，也可以聯合使用TLR激動劑Picibanil、 Hiltonol，或α-干擾素、白介素 -2、GM-CSF等細胞因子，或免疫刺激抗體如PD-1抗體如 nivolumab，或增加幫助信號的PADREs(pan_DR binding peptide epitopes)因子如α干擾 素，或細胞治療，或激素治療，或免疫源性化療或傳統化療。
[0007] 研究表明，有一種分子MUC1和腫瘤關系密切，已經成為腫瘤免疫治療的靶點。證據 來自于以下7個方面：（1)單克隆抗體研究發現，正常上皮細胞存在MUC1低表達，而癌癥時 (例如乳腺、卵巢和腎)MUC1高表達(增加100倍）；癌癥發生時MUC1存在于整個細胞表面，而 正常組織局限在分泌細胞的頂端表面。（2)已經發現MUC1在鼠中有很高的免疫原性，如通過 用人類癌癥細胞免疫鼠來制造單克隆抗體，幾乎所有的抗體都和高免疫原性VNTR (PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA)40-80反應，事實上是和這個區域中APDTR氨基酸反應。（3)癌細胞 表面糖類存在異常糖基化，形成新的糖表位(Tn，STn和TF)和肽表位的暴露（例如在VNTR的 ΑΡΟΤΚΡΑ)。^)已經證明從乳腺癌和胰腺癌病人的引流淋巴結中獲得的T細胞是以非MHC限 制性的方式識別MUC1癌細胞。（5)在乳腺癌病人中發現MHC限制的細胞毒性Τ淋巴細胞，從癌 癥病人身上獲得針對MUC1 VNTR區的抗體。（6)在頭/頸癌(舌、喉、咽和扁桃體的）、食管的鱗 狀細胞癌、膽囊癌、肝細胞癌、尿道癌、甲狀腺癌、子宮內膜癌、多發性骨髓瘤、急性骨髓性白 血病、急性/慢性淋巴細胞白血病、多毛細胞白血病、濾泡性淋巴瘤、漿細胞瘤和彌漫性大B 細胞淋巴瘤中也發現MUC1過表達。（7)MUC1表達在癌癥祖/干細胞。所有的這些特征形成了 腫瘤免疫研究中MUC1作為靶點研究的基礎。
[0008] 國外以MUC1的VNTR為基礎的肽結合或混合多種固有免疫系統的固有刺激物的疫 苗進行了I期臨床試驗。佐劑包括SB-AS2、不完全弗氏佐劑和鑰孔蟲戚血蘭素(KLH)等。兩個 非糖基化的VNTR劑型已經非常成功地進入III期臨床試驗。第一個是Stimu VaX(MerCk，NJ， USA)，它是一個25聚體的VNTR MUC1肽被脂質體包裹，并聯合一個Toll樣受體-4激動劑(月旨 質A)，現在在進行三個III期臨床試驗:兩個在非小細胞肺癌(NSCLC)，一個在雌激素受體陽 性的乳腺癌聯合激素治療。這些試驗中基于IIB期研究獲得令人鼓舞的結果，即證明了處于 IIIB階段NSCLC(限于局部的疾病）的一群病人，接受Stimuvax和最高標準護理的中位生存 期為30.6個月，而只接受最高標準護理的病人的中位生存期為13.3個月。最近一千多人的 III期肺癌治療試驗表明癌癥疫苗總體治療效果并不明顯，可能和入組的是晚期肺癌患者 有關系。通過分組發現以下規律:吸煙患者(n = 762)的治療效果好于非吸煙的患者，中位數 生存時間從20.6個月延長到32.1個月（p = 0.0058);女性患者(η = 269)的中位數生存時間 從20.6個月延長到36.8個月（ρ = 0.0370)，非腺癌患者(η = 496)的中位數生存時間從19.6 個月延長到29.6個月（ρ = 0.0435);同時合并化療的患者(η = 806)中位數生存時間從20.6 個月延長到30.8個月（ρ = 0.0175)的研究顯示，相對于化療后使用疫苗的患者，只有化療和 疫苗同時使用的患者受益。第二個是MUCU100聚體)聯合被氧化的甘露聚糖，它已經被使用 很多年，在臨床前、I期和II期試驗和III期試驗的研究中證明了有效性。總共31名絕經后的 乳腺癌II期病人在36周內被免疫了甘露聚糖-MUC1 9次，并且聯合他莫昔芬。安慰劑組15名 病人中有4名復發，而用氧化甘露聚糖-MUC1治療的16名病人中沒有發生復發(p = 0.0292)。 13位接受疫苗的患者中9位檢測到MUC1的抗體，10位接受疫苗的患者中4位檢測到MUC1特異 性T細胞反應。安慰劑組未出現MUC1特異性免疫反應。12-15年隨訪III期臨床研究表明：安 慰劑組的乳腺癌復發率為60% (6/15)，使用癌癥疫苗的患者乳腺癌復發率為12.5% (2/ 16)，壽命顯著延長，總體使用癌癥疫苗后無癌患者的百分比極顯著增加；病人從未出現疫 苗引起的毒性和自身免疫病，疫苗注射保證這些乳腺癌患者7年內無癌癥復發。
[0009] 臨床試驗還表明癌癥疫苗對6位胰腺癌患者都是安全的，其中1位患者病情穩定。 包含40位前列腺癌患者的II期臨床試驗表明，癌癥疫苗改善了 13位患者的PSA倍增時間，其 中10位PSA穩定了8個月。對11位卵巢癌患者的研究表明，癌癥疫苗可以誘導抗體的產生，是 安全的。包含37位腎細胞癌患者的II期臨床試驗表明，部分病人病情穩定時間達到6個月以 上。根據肝癌、結直腸癌、甲狀腺癌的抗原表達情況，癌癥疫苗可能適合這部分腫瘤患者的 治療。1例不能手術的復發胃癌患者使用使用抗原誘導DC細胞局部治療，30個月內未出現復 發。對15位多發性骨髓瘤患者的I/II期臨床試驗研究表明，應用癌癥疫苗的大部分患者病 情穩定(至少17.5~41.3個月），出現T細胞和B細胞的特異性免疫。I期臨床試驗研究表明， 肝臟轉移結直腸癌患者經肝轉移手術切除后使用表達GM-CSF的異種癌細胞疫苗，同時靜脈 低劑量給予環磷酰胺，患者產生抗MUC1的抗體，9位患者中6位存活時間超過3年，4位再無復 發。II期臨床研究發現，74位患者使用DC細胞治療和疫苗治療，結直腸癌患者的2年無復發 生存率相近(分別為47%和55%)，都好于非免疫組。39位晚期結腸腺瘤(結腸癌前病變)接 種癌癥疫苗后，17位產生抗MUC1的抗體和長期免疫記憶，而剩余未產生抗體的22位患者是 因為接種疫苗前血液中的髓系抑制細胞數量較多有關。對于急性骨髓性白血病等疾病，使 用免疫佐劑Montanide ISA-51可能是有害的。
[0010] 雖然治療性癌癥疫苗Stimuvax對病人的壽命延長沒有達到臨床期望，但是，對于 治療性癌癥疫苗的研究并未就此終止，我們設想通過改變治療性癌癥疫苗分子結構，增加 疫苗的免疫原性，從而為癌癥疫苗的臨床應用創造條件。

【發明內容】

[0011] 本發明的目的是提供一種肺癌的抗原蛋白及其編碼基因和治療性肺癌疫苗的制 備方法。
[0012]第一方面，本發明提供一種肺癌的抗原蛋白，包括如下(a)或⑻的蛋白質：
[0013] (a)由SEQ ID N0:1所示氨基酸序列組成的蛋白質，
[0014] (b)在(a)中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有相同功 能的由(a)衍生的蛋白質。
[0015] 第二方面，本發明提供一種編碼第一方面中的抗原蛋白的編碼基因。
[0016] 在第二方面的第一種可能實現的方式中，所述DNA分子的上游和下游還分別包括 一個酶切位點，上游的酶切位點為Nde頂每切位點；下游的酶切位點為Nco頂每切位點。
[0017] 第三方面，本發明提供一種含有第二方面或第二方面的第一種可能實現方式所述 的編碼基因的重組表達載體。
[0018] 在第三方面的第一種可能實現的方式中，所述重組表達載體的出發載體為PMAL-p5X〇
[0019] 第四方面，本發明提供一種含有第三方面所述的重組表達載體的重組菌或轉基因 細胞系。
[0020] 第五方面，本發明提供一種治療性肺癌疫苗的制備方法，包括：
[0021] (1)用加有氨芐青霉素的培養基活化帶有第三方面所述重組表達載體的DH5a菌 株，然后加入IPTG誘導表達，離心收集細菌培養基；
[0022] (2)向細菌培養基加入硫酸銨水溶液沉淀后懸起進行親和純化和麥芽糖水溶液洗 脫，得到純化的蛋白質；
[0023] (3)對純化的蛋白質進行超濾濃縮，得到目的蛋白質；
[0024] (4)對目的蛋白質去毒處理，然后加入佐劑混合，得到治療性肺癌疫苗。
[0025] 在第五方面的第一種可能實現的方式中，步驟（2)中，硫酸銨的質量濃度為 26.3%-53.0%〇
[0026] 在第五方面的第二種可能實現的方式中，步驟（2)中，麥芽糖水溶液濃度為 10mmol/L〇
[0027] 在第五方面的第三種可能實現的方式中，所述佐劑為氫氧化鋁佐劑。
[0028] 本發明提供的一種肺癌的抗原蛋白及其編碼基因和治療性肺癌疫苗的制備方法， 首先選用的MUC1多肽表位靶點（為方便描述，命名為MNR)，該靶點是正常細胞沒有的，只有 癌癥細胞和癌前期細胞特異表達，具有很好的安全性。其次選擇的佐劑Cs直接和MNR通過基 因融合重組表達偶聯，增加了 MNR蛋白的免疫原性。然后，選擇臨床常用的鋁佐劑作為輔料， 增加疫苗的作用時間。最后獲得的癌癥疫苗通過肌肉注射，動物實驗表明具有很好的安全 性和有效性。
【附圖說明】
[0029] 圖1為本發明所提供的抗原蛋白在大腸桿菌中重組表達的電泳圖；
[0030] 圖2為本發明所提供的抗原蛋白從細菌培養基中純化的電泳圖；
[0031] 圖3為本發明所提供的抗原蛋白超濾濃縮后的電泳圖；
[0032] 圖4為MBP和本發明所提供的抗原蛋白從細菌培養基的純化對比電泳圖；
[0033] 圖5為本發明所提供的抗原蛋白的酶切鑒定電泳圖；
[0034]圖6為本發明所提供的抗原蛋白穿柱后的電泳圖；
[0035] 圖7為本發明所提供的抗原蛋白親和純化后的電泳圖；
[0036] 圖8為試驗例1結果不意圖；
[0037] 圖9為試驗例2中第一個試驗的結果示意圖；
[0038] 圖10為試驗例2中第二個試驗的結果示意圖；
【具體實施方式】
[0039] 為了使本技術領域的人員更好地理解本發明方案，下面結合附圖和【具體實施方式】 對本發明作進一步的詳細說明。
[0040] 實施例1
[0041] 抗原蛋白合成:使用Gene Designer軟件對編碼基因進行密碼子優化，并在基因上 游引入Ndel內切酶位點，下游引入Ncol內切酶位點，合成基因克隆入pUC57載體，氨芐抗性。 基因合成后用Ndel和Ncol內切酶雙酶切，連接入經過同樣酶切的pMAL-p5X質粒，并用DNA連 接酶連接，轉化到感受態DH5a細菌，用含有氨芐(AMP)的瓊脂培養板上篩選，挑選單克隆用 LB-AMP培養基培養，提取質粒酶切鑒定，然后進行測序鑒定。將含有編碼基因的pMAL-p5X質 粒(為方便描述，將該質粒命名為pMAL-p5X-MNR)的DH5a細菌用LB-AMP培養，待0D600nm達到 0.5加入終濃度為ImM的IPTG，誘導表達12h。同樣誘導表達帶有pMAL-p5X的DH5a細菌做為對 照。取誘導前后的菌液進行蛋白質電泳，考馬斯亮藍R250染色。DH5a-pMAL-p5X-MNR表達出 約65KD的蛋白質（如圖1右指箭頭所示），而對照細菌DH5a-pMAL-p5X表達出約48KD的蛋白質 (如圖1左指箭頭所示）。
[0042] 經檢測，抗原蛋白的一級結構如序列表SEQ ID NO: 1所示。其基因編碼序列如序列 表SEQ ID N0:2所示。
[0043] 實施例2
[0044] 抗原蛋白的衍生蛋白合成:使用Gene Designer軟件對編碼基因進行密碼子優化， 并在基因上游引入BamHI內切酶位點，下游引入EcoRI內切酶位點，合成基因克隆入pUC57載 體，氨芐抗性。基因合成后用BamHI和EcoRI內切酶雙酶切，連接入經過同樣酶切的pMAL-p5X 質粒，并用DNA連接酶連接，轉化到感受態DH5a細菌，用含有氨芐(AMP)的瓊脂培養板上篩 選，挑選單克隆用LB-AMP培養基培養，提取質粒酶切鑒定，然后進行測序鑒定。將含有編碼 基因的pMAL-p5X質粒的DH5a細菌用LB-AMP培養，待0D600nm達到0.5加入終濃度為ImM的 IPTG，誘導表達12h。取誘導前后的菌液進行蛋白質電泳，考馬斯亮藍R250染色。經檢測，抗 原蛋白的一級結構如序列表SEQ ID N0:3所示。其基因編碼序列如序列表SEQ ID N0:4所 不。
[0045] 實施例3
[0046] 抗原蛋白的衍生蛋白合成:使用Gene Designer軟件對編碼基因進行密碼子優化， 并在基因上游引入Ncol內切酶位點，下游引入EcoRI內切酶位點，合成基因克隆入pUC57載 體，氨芐抗性。基因合成后用Ncol和EcoRI內切酶雙酶切，連接入經過同樣酶切的pMAL-p5X 質粒，并用DNA連接酶連接，轉化到感受態DH5a細菌，用含有氨芐(AMP)的瓊脂培養板上篩 選，挑選單克隆用LB-AMP培養基培養，提取質粒酶切鑒定，然后進行測序鑒定。將含有編碼 基因的pMAL-p5X質粒的DH5a細菌用LB-AMP培養，待0D600nm達到0.5加入終濃度為ImM的 IPTG，誘導表達12h。取誘導前后的菌液進行蛋白質電泳，考馬斯亮藍R250染色。經檢測，抗 原蛋白的一級結構如序列表SEQ ID N0:5所示。其基因編碼序列如序列表SEQ ID N0:6所 不。
[0047] 實施例4 [0048] 1.抗原蛋白純化
[0049] 用加有氨芐青霉素的LB培養基培養活化帶有pMAL-p5X-MNR的DH5a菌株，轉接到加 有氨芐青霉素的大瓶LB培養基培養，待0D_ nm達到0.5加入終濃度為lmmol/L的IPTG，誘導表 達12h。離心收集細菌沉淀和培養基。
[0050] 細菌沉淀的處理：細菌沉淀用Tris緩沖液(配比為20mmol/L Tris-HCl，0.2mmol/ LNaCl，10mmol/U3-巰基乙醇，lmmol/L EDTA)懸起，超聲破碎lOmin，離心收集上清液，用微 孔濾膜過濾后上8柱床Tris緩沖液平衡的Amylose樹脂，用12柱床Tris緩沖液洗滌后，再用 含10mM麥芽糖的Tris緩沖液洗脫，獲得目的蛋白質。取洗脫的蛋白質變性后上聚丙烯酰胺 凝膠電泳，考馬斯亮藍R250染色。
[0051] 細菌培養基的處理:細菌培養基用硫酸銨沉淀后懸起上amylose樹脂，用10mm〇l/L 麥芽糖洗脫。用于細菌沉淀處理中同樣方法進行電泳和染色鑒定純化成分。采用Brandford 法測定蛋白濃度，將純化獲得的抗原蛋白加入到Mi 11 ipore超濾離心管(麗⑶10000)中， 4000Xg離心15min，蛋白質得以濃縮。對濃縮的蛋白質用同樣方法測定濃度，并稀釋20倍后 進行蛋白質電泳。細菌菌液經內壓式濾膜過濾除菌，濾液再經外壓式濾膜濃縮。濃縮液經過 10K濾膜透析2次，離心后上Amylose親和樹脂純化得到目的蛋白，然后用G250檢測后上SDS-PAGE分析。
[0052]對照細菌表達：用加有氨芐青霉素的LB培養基培養帶有pMAL_p5X的DH5a菌株，待 0D6mnm達到0.5加入終濃度為lmmol/L的IPTG，誘導表達12h。離心收集培養基，用硫酸銨沉淀 后懸起上mylose樹脂，10mM麥芽糖洗脫。電泳和染色鑒定純化成分。
[0053]結論：
[0054] (1)將細菌培養基用26.3%硫酸銨沉淀，可以得到分子量約為65KD的蛋白質；加大 硫酸銨的濃度到33.3 %和53.0 %，還可以沉淀相當量的分子量約為65KD的蛋白質。高于 53.0 %硫酸銨沉淀的蛋白質雜質較多。65KD的蛋白質能被Amy lose樹脂結合和10mmol/L麥 芽糖洗脫，得到濃度較高的蛋白質，其分子量和MUC1-N可變串聯重復MBP融合蛋白分子量理 論值64.9KD-致。（如圖2箭頭所示）
[0055] (2)純化的蛋白質經過10KD超濾管離心過濾后得以濃縮(見圖3箭頭所指），有少量 蛋白質漏出，漏出的蛋白質仍可結合Amy 1 〇se樹脂結合并被1 OmM麥芽糖洗脫。超濾濃縮的蛋 白質濃度達到5mg/ml。-20 °C保存一周后，蛋白質有部分降解。
[0056] (3)為了印證純化的蛋白質是帶有MNR基因的目的蛋白，我們將對照質粒（只含MBP 基因）轉化的DH5a進行誘導表達，并進行培養基的硫酸銨沉淀和Amylose樹脂純化。發現從 培養基純化的蛋白質分子量和MBP-致，比MNR-MBP分子量小。前者在硫酸銨濃度為50-67 % 的蛋白沉淀量大于20-50 %的蛋白沉淀量，后者硫酸銨濃度為20-50 %的蛋白沉淀量大于 50-67%的蛋白沉淀量，見圖4。
[0057] (4)蛋白質經過室溫3h處理后已經基本酶解，21h后已經完全酶解。得到分子量約 17KD的蛋白質，和MNR的分子量比較接近（160個氨基酸殘基，見圖5箭頭所指）。經過Q-Sepharose純化，穿柱液中得到17KD的蛋白質（見圖6箭頭所指）
[0058] (5)SDS-PAGE分析表明，細菌菌液經<200K型內壓式濾膜過濾后上清液含有目的 蛋白質，經CLW-002型外壓式濾膜后濃縮近3倍，經Amy lose親和樹脂純化得到濃度較高的目 的蛋白質，見圖7。
[0059] 2.目的蛋白（命名為MNR-MBP)去內毒素
[0060] 超濾濃縮后的MNR-MBP經過Tris緩沖液（20mmol/L Tris-HCl，0.2mol/LNaCl， 10mmol/U3-巰基乙醇，lmmol/L EDTA)平衡，用微孔濾膜過濾后上8柱床Tris緩沖液平衡的 Amylose樹脂，用12柱床Tris緩沖液洗滌后用含10mm〇l/L麥芽糖的Tris緩沖液洗脫，獲得目 的蛋白質MNR-MBP。用Q-sepharose穿柱去除內毒素，柱床1 · 6ml，用pH 7 · 4的Tris緩沖液平 衡后上樣，穿柱液過ο. 22μπι濾膜除菌，用Braford法測定蛋白質含量，用鱟試劑測定內毒素 含量，當內毒素含量低于500EU/mg為合格，若達不到合格標準再重復去除內毒素步驟直到 合格為止，稀釋目的蛋白MNR-MBP溶液到lmg/ml保存。
[0061] 實驗采用多種方式去除目的蛋白MNR-MBP的內毒素，其中包括硫酸銨沉淀二次、過 △11^1〇86樹脂后洗脫后再超濾、0(^71-86口1^1'〇86穿柱、( >)-86口1^1'〇86穿柱，只有超濾后過親 和柱加 Chsepharose穿柱純化能夠達到要求，內毒素的含量低于500Eu/mg。
[0062] 3.肺癌疫苗的制備
[0063] 于雙蒸水中加入1 % 明膠、5%鹿糖、0.65%的NaCl、0·9mg/ml的A1C13，用ION NaOH 調節pH到5.8。110°(：高壓蒸氣滅菌20min，冷卻后過0.22μπι濾膜，收集濾出液為氫氧化鋁佐 劑，4°C保存備用。取0.5ml氫氧化鋁佐劑加入0.5mg MNR-MBP目的蛋白，混合均勻成為肺癌 疫苗。該肺癌疫苗為透明、無臭、無味液體。在25 ± 0.5 °C時的pH為6.0~8.0。
[0064] 總體上，本發明肺癌疫苗制備過程如下：通過基因工程在宿主菌中表達MNR-MBP， 后經過多重純化、去毒、過濾除菌得到注射級別的MNR-MBP，經鱟試劑內毒素檢測達到要求。 合成路線:基因制備-質粒構建-重組表達-超濾純化-未和純化-去毒-過濾除菌-輔 料添加-成品包裝。工藝描述:注冊批量為12g/批，商業化大生產批次的擬定批量為750/ 批。以注冊批為代表的工藝描述如下：蛋白質粗品用Tris緩沖液(20mmol/L Tris-HCl，0.2M NaCl，lmmol/L EDTA)透析，用微孔濾膜過濾后上8柱床Tris緩沖液平衡的Amylose樹脂，用 12柱床Tris緩沖液洗滌后用含10mm 〇l/L麥芽糖的Tris緩沖液洗脫，獲得目的蛋白質。
[0065] 試驗例1 [0066]疫苗動物免疫實驗
[0067]取10只6-8周齡雄性Balb/C小鼠，分成實驗組和對照組。實驗組右前腿肌肉注射 100yL(50yg)疫苗（氫氧化鋁為佐劑，溶于20mmol/L Tris-HCl，0.2mol/L NaCl，lmmol/L EDTA，pH值為7.4)，對照組同樣部位注射100卩1^氫氧化鋁佐劑。每周兩次，共3次。免疫前和免 疫后2次眼眶取血用于抗體的檢測。ELISA檢測發現:疫苗免疫前Balb/C小鼠血清中不存在 MNR的抗體，7天后出現少量的針對在MNR的抗體，14天后出現約多的MNR的抗體，只注射免疫 佐劑沒有出現MNR的抗體，見圖8。
[0068] 試驗例2 [0069]疫苗的藥效學實驗
[0070] 2.1取49只6-8周齡雄性C57BL/6J小鼠，分成生理鹽水組(對照組）、50yg實驗組(本 發明疫苗），每組7只。每兩周注射1次，共3次。在第3次免疫后第4日，右側腋下注射1 X 106 (50yL)肺癌細胞，14天后測量小鼠腫瘤的體積。結果發現和對照組相比，50yg實驗組的腫瘤 極顯著變小，見圖9。
[0071] 2.2取28只6-8周齡雄性05781761小鼠，分成4組注射5(^8實驗組(本發明疫苗），每 組7只。每兩周注射1次，分別注射2、4、6、8次。在最后一次免疫后第4日，右側腋下注射IX 106 (50yL)肺癌細胞，14天后測量小鼠腫瘤的體積。結果發現免疫次數越多，腫瘤的體積越 小，見下圖10。
[0072] 2.3取10只6-8周齡雄性05781761小鼠，右側腋下注射1\106(5(^)黑色素瘤細 胞，第8天后測量小鼠腫瘤的體積。分成2組注射生理鹽水和50yg實驗組(本發明疫苗），每組 5只。每周注射2次，并在第12、14、16天測定腫瘤大小。結果發現腫瘤生長的第14天，本發明 疫苗注射抑制了黑色素瘤的生長，見表1。
[0073] 表1本發明疫苗注射抑制黑色素瘤的生長
[0074]
[0075] 試驗例3
[0076]疫苗動物毒理學試驗
[0077]取10只6-8周齡雄性Balb/C小鼠，分成實驗組和對照組。實驗組右前腿肌肉注射 100yL(50yg)本發明疫苗（氫氧化鋁為佐劑，溶于20mmol/L Tris-HCl，0.2mol/L NaCl， lmmol/L EDTA，pH值為7.4)，對照組同樣部位注射100yL氫氧化鋁佐劑。每周兩次，共3次。動 物接種疫苗后14天處死動物觀察動物未見心臟、肝臟、脾、肺、腎等臟器的器質性病變。 [0078]試驗例1-3為針對本發明抗原蛋白制得肺癌疫苗的試驗，經過同樣的試驗手段檢 測，發現實施例2和3提供的衍生蛋白制得的疫苗也具有相同的效果，在此不再贅述。
[0079]應用實施例1 [0080]疫苗臨床應用方法
[0081] 第一個療程一年，第1-4針間隔一周，第5-15針間隔1月。癌癥早期患者使用1年;癌 癥中期患者增加一療程，第16-27針間隔1月，癌癥早期患者使用2年。雙側上臂肌肉注射。
[0082] 以上對本發明所提供的一種肺癌的抗原蛋白及其編碼基因和治療性肺癌疫苗的 制備方法進行了詳細介紹。本文中應用了具體個例對本發明的原理及實施方式進行了闡 述，以上實施例的說明只是用于幫助理解本發明的核心思想。應當指出，對于本技術領域的 普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以對本發明進行若干改進和修飾， 這些改進和修飾也落入本發明權利要求的保護范圍內。
【主權項】
1. 一種肺癌的抗原蛋白，包括如下(a)或(b)的蛋白質： (a) 由SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列組成的蛋白質， (b) 在(a)中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有相同功能的 由（a)衍生的蛋白質。2. 編碼權利要求1所述抗原蛋白的編碼基因。3. 根據權利要求2所述的抗原蛋白的編碼基因，其特征在于，所述DNA分子的上游和下 游還分別包括一個酶切位點，上游的酶切位點為NdeI酶切位點；下游的酶切位點為NcoI酶 切位點。4. 含有權利要求2或3所述的編碼基因的重組表達載體。5. 根據權利要求4所述的重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體的出發載體為 pMAL-p5X。6. 含有權利要求5所述的重組表達載體的重組菌或轉基因細胞系。7. -種治療性肺癌疫苗的制備方法，包括： (1) 用加有氨芐青霉素的培養基活化帶有權利要求4所述重組表達載體的DH5a菌株，然 后加入IPTG誘導表達，離心收集細菌培養基； (2) 向細菌培養基加入硫酸銨水溶液沉淀后懸起進行親和純化和麥芽糖水溶液洗脫， 得到純化的蛋白質； (3) 對純化的蛋白質進行超濾濃縮，得到目的蛋白質； (4) 對目的蛋白質去毒處理，然后加入佐劑混合，得到治療性肺癌疫苗。8. 根據權利要求7所述的治療性肺癌疫苗的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，硫酸銨 水溶液的質量濃度為26.3%-53.0%。9. 根據權利要求7所述的治療性肺癌疫苗的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，麥芽糖 水溶液濃度為I Ommo I /L。10. 根據權利要求7所述的治療性肺癌疫苗的制備方法，其特征在于，所述佐劑為氫氧 化錯佐劑。
【文檔編號】C07K1/36GK105906699SQ201610284535
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月29日
【發明人】蔡炯
【申請人】中國醫學科學院北京協和醫院