專利名稱：一種攜分子佐劑的融合蛋白避孕疫苗及其制備方法
技術領域：
本發明屬生物制藥領域，涉及一種與分子佐劑交聯的避孕疫苗，具體涉及一種與分子佐劑C3d3交聯的hCGβ-C3d3融合蛋白避孕疫苗。
背景技術：
人絨毛膜促性腺激素(hCG)是由胎盤合體滋養細胞分泌的一種糖蛋白激素，其主要的生理功能是延長黃體壽命，使之增大成為妊娠黃體，增加甾體激素的分泌以維持妊娠。hCG是妊娠期暫時出現的一種特異性激素，已有研究證實，中和hCG的生物學活性可以在不干擾其它生殖生物學功能的情況下中止妊娠，因此hCG成為避孕疫苗設計中理想的靶抗原。基于hCG結構中β亞基的特異性，以hCGβ為基礎的合成肽疫苗已經進入了II期臨床實驗。實驗結果顯示，hCGβ避孕疫苗具有可喜的應用前景，但免疫效果個體之間的差異性和目前僅有的80％的避孕效果距臨床應用相距甚遠。因此，如何顯著增強其具有抗生育作用的體液免疫效應，減弱有可能導致生殖系自身免疫損傷的細胞免疫效應已成為hCGβ避孕疫苗的研究目標。以往研究中，為打破機體對hCGβ小分子自身抗原的免疫耐受，大多采用白喉類毒素(DT)或破傷風類毒素(TT)作為載體增強其免疫原性，但DT和TT卻存在著載體介導的表位抑制效應。
在哺乳動物免疫系統中，C3d是補體C3的最后裂解產物之一，它與B細胞和濾泡樹突狀細胞(FDC)上的受體(CR2，CD21)的相互作用于正常體液免疫應答的誘導和維持至關重要。1996年Dempsy首次報道C3d是一個能顯著增強體液免疫效力的分子佐劑，將C3d與抗原融合形成的C3d-抗原復合物能使抗原的免疫原性增強1000～10000倍。Thomas D.Green等報道把膜結合形式的三個拷貝C3d(mC3d3)與流感病毒血凝素(HA)相聯形成的mHA-C3d3 DNA疫苗和MitchellJA等把分泌形式的三個拷貝C3d(sC3d3)與麻疹病毒血凝素(H)相聯形成的sH-C3d3 DNA疫苗在保護性免疫的出現、抗體親和力的成熟和中和滴度方面都明顯強于HA和H。最近他們采用了相似的方法將I型人類免疫缺陷病毒包膜表面蛋白(HIV-lgp120)融合到C3d3的羧基端，驗證了C3d3增強體液免疫效應的能力。對于hCGβ避孕疫苗而言，決定其避孕效果的是體液免疫效力，而非細胞免疫。細胞免疫不僅沒有中和hCGβ生物學活性的能力，在一定程度上還存在著導致生殖系靶細胞自身免疫損傷的危險。因此，用基因工程技術研制hCGβ避孕疫苗，并顯著增強其具有抗生育作用的Th2型及體液免疫效應，減弱Th1型及CTL效應是hCGβ避孕疫苗的研究目標。
以往的研究，利用基因工程技術構建了hCGβ與3個拷貝C3d分子的真核表達質粒pcDNA3-hCGβ-C3d3，所得到的融合蛋白經鑒定證實既具有CD21分子結合活性，也具有hCGβ抗原性。在以上研究基礎上，將hCGβ-C3d3cDNA構建入表達效率更高的真核載體pCMV4，通過對BALB/c小鼠的基因免疫，顯示分子佐劑C3d3使hCGβ的免疫原性增強了200多倍，并實現了免疫效應從Th1型細胞免疫向Th2型體液免疫偏倚。由于基因疫苗在宿主細胞中的表達限制和基因疫苗在與宿主細胞基因組整合過程中，有可能激活原癌基因或破壞抑癌基因，理論上存在著致癌的危險性。因此，體外表達、純化hCGβ-C3d3融合蛋白，制備基因工程疫苗，并針對此融合蛋白研究hCGβ-C3d3疫苗的免疫效應、抗生育效果及其作用機理將更為合理、安全。
發明內容
本發明的目的是提供一種攜分子佐劑的融合蛋白避孕疫苗，具體是一種高效、穩定、廉價的與分子佐劑C3d3交聯的hCGβ-C3d3融合蛋白避孕疫苗。本發明的另一目的是提供制備hCGβ-C3d3融合蛋白避孕疫苗的方法。
本發明通過下述技術方案實現。
本發明選用真核表達載體phCMV1(Gene Therapy System，Inc.)，分別構建帶有6個組氨酸(6His)純化標簽的hCGβ-C3d3融合蛋白和hCGβ蛋白的真核表達質粒phCMV1-6His-hCGβ-C3d3和phCMV1-6His-hCGβ。選用中國倉鼠卵巢(CHO)細胞作為表達宿主，在體外表達、鑒定、純化出hCGβ-C3d3融合蛋白和hCGβ蛋白。分別用hCGβ-C3d3融合蛋白、hCGβ蛋白和hCGβ蛋白加用弗氏佐劑免疫不同品系小鼠。檢測抗體水平、抗血清中和hCG生物學活性的能力和受試小鼠脾細胞分泌細胞因子的水平，證實分子佐劑C3d3增強hCGβ蛋白疫苗體液免疫效力和抗生育潛能的作用。
本發明方法包括下述步驟，1.構建分泌型真核表達質粒phCMV1-6His-hCGβ-C3d3和phCMV1-6His-hCGβ。
(1)phCMV1-6His-hCGβ構建策略(圖1)
采用PCR技術分別合成、擴增Hind III-Signal-6His-EcoR I片段和EcoR I-hCGβ(無信號肽及終止密碼子)-BamH I片段。連接兩片段后用Hind III和BamH I雙酶切片段Hind III-signal-6His-EcoR I-hCGβ(無信號肽及終止密碼子)-BamH I和pBS-hCGβ，連接得pBS-signal-6His-hCGβ。Hind III和Not I雙酶切phCMV1和pBS-signal-6His-hCGβ，連接得phCMV1-signal-6His-hCGβ。
(2)phCMV1-6His-hCGβ-C3d3構建策略(圖2)Bgl II和Xba I雙酶切pSG5-C3d3，BamH I和Xba I雙酶切pBS-signal-6His-hCGβ，連接得PBS-signal-6His-hCGβ-C3d3。Hind III和Not I雙酶切phCMV1和pBS-signal-6His-hCGβ-C3d3，連接得phCMV1-signal-6His-hCGβ-C3d3。
2.hCGβ-C3d3融合蛋白和hCGβ蛋白的表達、鑒定與純化。
(1)重組質粒轉染CHO細胞、抗性克隆篩選及無血清培養六孔板內CHO細胞95％匯合成片，用Lipofectamine2000分別介導phCMV1-6His-hCGβ-C3d3、phCMV1-6His-hCGβ、phCMV1、pcDNA3-hCGβ-C3d3和pcDNA3-hCGβ轉染CHO細胞。用含G418(800-1000ug/ml)的完全培養基篩選抗藥性克隆，含G418(300-400μg/ml)的培養液擴增陽性克隆。待陽性克隆95％匯合成片時換用CHO無血清培養基培養。
(2)陽性細胞克隆培養上清中hCGβ含量測定收集培養24、48和72小時的無血清培養上清，放免法測定hCGβ含量，選取高效表達hCGβ-C3d3融合蛋白的陽性克隆。反復3次凍存和復蘇hCGβ-C3d3融合蛋白的高效表達克隆，間隔時間為1個月，檢測95％匯片后無血清培養48h培養上清中hCGβ的含量。
(3)Western blotting鑒定表達產物收集高效表達重組蛋白的陽性克隆培養72h的無血清培養上清，凍干法濃縮20倍后行Western blot鑒定。一抗是小鼠抗人hCGβ單抗，二抗為偶聯HRP的兔抗小鼠IgG，用DAB底物顯色。
(4)Raji細胞免疫化學染色鑒定hCGβ-C3d融合蛋白Raji細胞膜上具有豐富的CD21分子(C3d受體)，把Raji細胞分別與不同的表達產物共孵育，涂片固定后以小鼠抗人hCGβ為一抗，ABC法檢測hCGβ，當hCGβ與C3d為融合蛋白時，才能使Raji細胞呈現陽性著色。收集phCMV1-6His-hCGβ-C3d3、phCMV1-6His-hCGβ和phCMV1陽性克隆24小時的無血清培養上清，分別與Raji細胞37℃孵育1小時，然后涂布在包被有多聚賴氨酸的載玻片上。一抗為以小鼠抗人hCGβ單抗，用anti-mouse IgG ABC試劑盒檢測。
(5)分離、純化hCGβ-C3d3融合蛋白和hCGβ蛋白hCGβ蛋白采用ProBond 6his resin在非變性條件下一步法純化獲得。根據Western blotting的結果，phCMV1-6His-hCGβ-C3d3的表達產物在用鎳柱純化的基礎上，加用Sephadex G150 column進行了凝膠過濾層析以分離出高分子量的hCGβ-C3d3融合蛋白。
3.動物免疫和免疫效應免疫對象分別選用6～8周齡以體液免疫效應為主的BALB/c小鼠和以細胞免疫效應為主的C57BL/6小鼠，分別用hCGβ-C3d3融合蛋白、單用hCGβ蛋白和hCGβ蛋白加用弗氏佐劑進行免疫。共免疫兩次，間隔4周。通過檢測血清中的抗體水平以驗證分子佐劑C3d3在個體差異較大的不同品系小鼠是否都能增強hCGβ蛋白抗原的免疫原性，并將C3d3的佐劑能力與弗氏佐劑進行比較。
4.hCGβ-C3d3融合蛋白疫苗介導免疫動物Th2型優勢效應hCGβ-C3d3融合蛋白、單用hCGβ和hCGβ加用弗氏完全佐劑免疫的BALB/c小鼠于末次免疫后3周脫頸處死，制備脾淋巴細胞懸液。體外用hCG刺激培養，培養48h后用ELISA法檢測培養上清中IFNγ、IL-2、IL-4和IL-10的分泌水平。
5.hCGβ-C3d3融合蛋白疫苗的抗生育潛能實驗hCGβ-C3d3融合蛋白、單用hCGβ和hCGβ加用弗氏完全佐劑免疫的BALB/c小鼠于末次免疫后3周摘除眼球取血，分離出血清-20℃貯存備用。檢測各免疫組小鼠血清抑制hCG刺激MLTC-1細胞分泌孕酮的作用和拮抗hCG誘導未成年小鼠子宮發育的作用。
本發明實驗結果表明，1.經酶切及測序證實構建分泌型真核表達質粒phCMV1-6His-hCGβ-C3d3和phCMV1-6His-hCGβ正確。
2.脂質體法介導各組質粒轉染CHO細胞成功。phCMV1-signal-6His-hCGβ和phCMV1-signal-6His-hCGβ-C3d3陽性克隆無血清培養24、48、72小時重組蛋白的表達量分別為1225、1129、1325mIU/ml/1×106cells和496、527、633mIU/ml/106cells(以hCGβ含量計算)。pcDNA3-hCGβ和pcDNA3-hCGβ-C3d3陽性克隆無血清培液中24、48、72h hCGβ含量分別為703、762、828mIU/ml/106cells和327、395、443mIU/ml/1×106cells。phCMV1表達hCGβ的效率比pcDNA3高1.6倍，表達hCGβ-C3d3融合蛋白的效率比pcDNA3高1.4倍。反復3次凍存和復蘇高效表達hCGβ-C3d3融合蛋白的陽性克隆，復蘇細胞95％匯片后無血清培養48h，培液中hCGβ的表達量分別為679、665和672mIU/ml/1×106cells。；Western blotting結果顯示phCMV1-6His-hCGβ-C3d3在CHO細胞中的表達產物有三條帶，分子量分別為128KD、96KD和62KD左右。phCMV1-6His-hCGβ在CHO細胞中的表達產物為24KD左右。
.Raji細胞免疫細胞化學分析顯示，phCMV1-6His-hCGβ-C3d3陽性克隆的培養上清都能使細胞膜呈陽性著色，phCMV1-6His-hCGβ和phCMV1陽性克隆的上清皆為陰性著色。
hCGβ蛋白用鎳柱在非變性條件下一步法純化獲得，純化產物具有較高的純度(8a)。phCMV1-6His-hCGβ-C3d3陽性克隆培清的鎳柱純化產物有3種，大小分別為128KD、96KD和62KD(8b)。根據分子量的差異，加用Sephadex G150 column進行凝膠過濾層析分離出128KD的hCGβ-C3d3融合蛋白，該融合蛋白具有較高的純度(8c)。
3.hCGβ-C3d3融合蛋白于初次免疫后2周開始產生抗體，4周時達峰值(1∶251)。加強免疫后一周抗體水平迅速升高，峰值可達1∶12589，高滴度的抗體水平(1∶6309)可持續至加強免疫后10周。hCGβ單獨免疫組在加強免疫后才見抗體生成，抗體滴度分別比hCGβ-C3d3融合蛋白免疫組低1995倍，在加強免疫后第8周已檢測不出抗體水平。hCGβ+CFA/IFA于初次免疫后第3周檢測到抗體生成，其初次和再次免疫后的抗體效價分別比hCGβ-C3d3融合蛋白組低10倍和32倍。
C57BL/6小鼠初次和再次免疫后抗-hCGβ抗體生成的總體水平分別比BALB/c小鼠低2.5倍和4倍。初次免疫后只有hCGβ-C3d3融合蛋白免疫組可檢測到抗體生成。加強免疫后hCGβ-C3d3融合蛋白免疫組的抗體滴度高達1∶3162，比hCGβ單獨免疫組高1259倍。hCGβ+CFA/IFA初次和再次免疫后的抗體效價分別比hCGβ-C3d3融合蛋白免疫組低10倍和20倍。
4.hCGβ-C3d3融合蛋白和hCGβ+CFA/IFA免疫組小鼠IL-4和IL-10分泌水平均顯著高于hCGβ免疫組(P＜0.05)，以hCGβ-C3d3融合蛋白最為明顯。以IL-4/IFNγ比值分析，hCGβ-C3d3融合蛋白免疫組為8.0，hCGβ+CFA/IFA免疫組為2.28，hCGβ免疫組為1.77。hCGβ-C3d3融合蛋白免疫動物顯示出明顯的Th2型優勢效應。
5.10IU的hCG刺激7h，1×105MLTC-1細胞可分泌孕酮560.33ng/ml。hCGβ-C3d3融合蛋白和hCGβ+CFA/IFA免疫組小鼠產生的抗血清均能明顯抑制hCG刺激MLTC-1細胞分泌孕酮的作用(P＜0.05)，分別使孕酮分泌量下降到44.06ng/ml和102ng/ml，但兩組間的中和能力無顯著性差異(P＞0.05)。而單用hCGβ免疫產生的抗血清對hCG的生物學活性則幾乎沒有影響(P＞0.05)。
從原液至1∶400稀釋的hCGβ-C3d3抗血清和1∶200稀釋的hCGβ+CFA/IFA抗血清均可顯著抑制hCG誘導的小鼠子宮增重(P＜0.05)，hCGβ抗血清只能在1∶50稀釋時具有抑制作用(P＜0.05)。正常鼠血清對hCG誘導的小鼠子宮增重沒有拮抗作用。
圖1.phCMV1-6his-hCGβ構建示意2.phCMV1-6his-hCGβ-C3d3構建示意圖.
圖3酶切鑒定phCMV1-6His-hCGβ-C3d和phCMV1-6His-hCGβ圖4.陽性CHO克隆無血清培液中24、48和72h重組蛋白的表達量。(以hCGβ含量計算，mIU/ml/106cells)圖5.Western blotting分析phCMV1-6His-hCGβ-C3d3在CHO細胞中的表達產物圖6.Western blotting分析phCMV1-6His-hCGβ在CHO細胞中的表達產物圖7.Raji細胞免疫化學染色結果圖8.SDS-PAGE分析純化后的表達產物圖9.BALB/c小鼠初次和再次免疫后的hCGβ抗血清效價，↑所指為第二次免疫的時間。
圖10.C57BL/6小鼠初次和再次免疫后的hCGβ抗血清效價，↑所指為第二次免疫的時間圖11.各組小鼠脾細胞培養上清中Th1型(IFNγ、IL-2)和Th2型(IL-4、IL-10)細胞因子表達水平(X±SD)，*表示與其它各組相比，P＜0.05。
圖12.各組小鼠脾細胞培養上清中Th2型/Th1型(IL-4/IFNγ)細胞因子表達水平。
圖13.正常鼠血清和hCGβ免疫鼠血清比較圖14.不同稀釋度免疫鼠血清對未成年小鼠子宮增重的拮抗作用具體實施方式
實施例1.構建分泌型真核表達質粒phCMV1-6His-hCGβ-C3d3和phCMV1-6His-hCGβ。
phCMV1-signal-6His-hCGβ構建策略(圖2)以帶有信號肽的hCGβ為模板，設計下列2對引物5’-CCAAGCTT ATG GAGATG TTC CAG GGG-3’，5’-CGGAATTC CCA ATG ATG ATG ATG ATG ATG TGC CCATGT CCC GCC CAT-3’和5’-CGGAATTC TCC AAG GAG CCGCTT CGG-3’，5‘-CGGGATCC TTG TGG GAG GAT CGG-3’。以pBS-hCGβ為模板，用第一對引物擴增Hind III-Signal-6His-EcoR I片段。用第二對引物擴增EcoR I-hCGβ(無信號肽及終止密碼子)-BamH I片段。用Hind III和EcoR I雙酶切Hind III-Signal-6His-EcoR I片段，用EcoR I和BamH I雙酶切EcoR I-hCGβ(無信號肽及終止密碼子)-BamH I片段。連接得到Hind III-Signal-6His-EcoR I-hCGβ(無信號肽及終止密碼子)-BamH I。用第一對引物的上游引物和第二對引物的下游引物擴增片段Hind III-Signal-6His-EcoR I-hCGβ(無信號肽及終止密碼子)-BamH I。
Hind III和BamH I雙酶切片段Hind III-signal-6His-EcoR I-hCGβ(無信號肽及終止密碼子)-BamH I和pBS-hCGβ，連接得pBS-signal-6His-hCGβ。HindIII和Not I雙酶切phCMV1和pBS-signal-6His-hCGβ，連接得phCMV1-signal-6His-hCGβ。
phCMV1-signal-6His-hCGβ-C3d3構建策略(圖2)Bgl II和Xba I雙酶切pSG5-C3d3，BamH I和Xba I雙酶切pBS-signal-6His-hCGβ，連接得PBS-signal-6His-hCGβ-C3d3。Hind III和Not I雙酶切phCMV1和pBS-signal-6His-hCGβ-C3d3，連接得phCMV1-signal-6His-hCGβ-C3d3。
實施例2 hCGβ-C3d3融合蛋白和hCGβ蛋白的表達、鑒定與純化。
重組質粒轉染CHO細胞、抗性克隆篩選及無血清培養待六孔板內CHO細胞95％匯合成片時，用Lipofectamine2000分別介導phCMV1-6His-hCGβ-C3d3、phCMV1-6His-hCGβ、phCMV1、pcDNA3-hCGβ-C3d3和pcDNA3-hCGβ轉染CHO細胞，質粒和脂質體用量為1μg∶7μg。轉染后24小時用含G418(800ug/ml)的完全培養基篩選陽性克隆。每3天換一次液，維持篩選8天，直至抗藥性細胞克隆形成。分別挑選10個phCMV1-6His-hCGβ-C3d3和phCMV1-6His-hCGβ的陽性克隆，用含G418(300μg/ml)的培養液維持培養、擴增，待陽性克隆95％匯合成片時換用CHO無血清培養基培養。
陽性細胞克隆培養上清中hCGβ含量測定收集培養24、48和72小時的無血清培養上清，5000g，4℃離心5min，取上清-20℃保存，放免法測定hCGβ含量，選取高效表達hCGβ-C3d3融合蛋白的陽性克隆。反復3次凍存和復蘇hCGβ-C3d3融合蛋白的高效表達克隆，間隔時間為1個月，檢測95％匯片后無血清培養48h培養上清中hCGβ的含量。
Western blotting鑒定表達產物收集高效表達重組蛋白的陽性克隆培養72h的無血清培養上清，5000g，4℃離心5min，取上清-20℃保存。凍干法濃縮20倍，PBS 4℃透析24小時，其間換PBS三次，棄沉淀，取透析后的上清液做Western blotting。一抗是小鼠抗人hCGβ單抗，二抗為偶聯HRP的兔抗小鼠IgG，用DAB底物顯色。
Raji細胞免疫化學染色鑒定hCGβ-C3d融合蛋白Raji細胞膜上具有豐富的CD21分子(C3d受體)，把Raji細胞分別與不同的表達產物共孵育，涂片固定后以小鼠抗人hCGβ為一抗，ABC法檢測hCGβ，當hCGβ與C3d為融合蛋白時，才能使Raji細胞呈現陽性著色。收集phCMV1-6His-hCGβ-C3d3、phCMV1-6His-hCGβ和phCMV1陽性克隆24小時的無血清培養上清，5000g，4℃離心5min。各取150ul分別與Raji細胞37℃孵育1小時，然后涂布在包被有多聚賴氨酸的載玻片上，4％多聚甲醛固定20分鐘。一抗為以小鼠抗人hCGβ單抗，用anti-mouse IgG ABC試劑盒檢測。
分離、純化hCGβ-C3d3融合蛋白和hCGβ蛋白hCGβ蛋白采用ProBond 6hisresin在非變性條件下一步法純化獲得。步驟如下收集含hCGβ的無血清培液，5000g，4℃離心5min。凍干法濃縮10倍后PBS 4℃透析24小時，取透析后的上清上柱。按照ProBond 6his resin說明書采用非變性條件進行純化，最后用含250mM咪唑的洗脫液洗脫目的蛋白，洗脫液用含2mMTris，20mM NaCl，0.1％glycine，and 10nM EDTA的溶液透析去除咪唑和鎳離子。根據Western blotting的結果，phCMV1-6His-hCGβ-C3d3的表達產物在用鎳柱純化的基礎上，加用Sephadex G150 column進行了凝膠過濾層析以分離出高分子量的hCGβ-C3d3融合蛋白。凝膠過濾層析按照Pharmacia公司提供的操作在4℃進行。用TM緩沖液+0.1mol/L KCl洗滌、膨脹G150膠后均勻、無氣泡裝柱、壓柱，用相同的緩沖液平衡凝膠層析柱后上樣，用含0.05M磷酸鈉和0.15M氯化鈉的溶液(PH7.0)洗脫，流速為19cm/h(0.25ml/min)。分部收集洗脫液，每管500ul，分光光度計A280跟蹤洗脫蛋白峰。合并含有128KD的主峰蛋白溶液并用PBS 4℃透析過夜，取透析上清-20℃貯存。
實施例3.動物免疫和免疫效應免疫方法6～8周齡BALB/c小鼠(19～24g)和C57BL/6小鼠(20～25g)，各分為3組，每組5只。分別用hCGβ-C3d3融合蛋白、單用hCGβ和hCGβ加用弗氏佐劑免疫。于右側背部皮下注射免疫，共免疫兩次，間隔4周。免疫劑量分別為50pmol hCGβ-C3d3融合蛋白/100μl PBS，50pmol hCGβ/100μl PBS和50pmolhCGβ/50μl PBS+50μl CFA形成的完全乳劑。其中hCGβ+CFA免疫組再次免疫時換用hCGβ+IFA免疫。
第一次注射后7天開始采血，每周一次，共4次。第二次注射后7天開始采血，每周一次，共3次。于小鼠眼眶后靜脈叢采血，每次采血100～150μl，分離出血清20～25μl，-20℃貯存備用。
用間接ELISA法測定。以純化hCG抗原包被96孔酶標板，每孔0.5μg。封閉后加入系列稀釋(指數級稀釋)的抗血清37℃孵育1h。PBS洗3次后加入偶聯辣根過氧化物酶(HRP)的羊抗小鼠IgG(H+L)，37℃孵育30min，用H2O2-TMB系統顯色。于450nm測定樣品OD值。抗血清最高稀釋度呈陽性者(樣品OD值/PBS陰性對照OD值＞2.0)，其稀釋度的倒數即為抗血清效價。
于加強免疫后第3周，分別隨機選取3只hCGβ-C3d3融合蛋白、單用hCGβ和hCGβ加用弗氏佐劑免疫的BALB/c小鼠。摘除眼球取血，分離出血清-20℃貯存備用(用于下一步抗血清特性的研究)。其余小鼠繼續監測抗體水平至加強免疫后第10周。
實施例4.hCGβ-C3d3融合蛋白疫苗介導免疫動物Th2型優勢效應制備脾淋巴細胞懸液hCGβ-C3d3融合蛋白、單用hCGβ和hCGβ加用弗氏完全佐劑免疫的BALB/c小鼠于末次免疫后3周脫頸處死，無菌摘取脾臟，用10ml注射器針芯研磨，過400目尼龍網富集單個細胞。1500rpm離心3分鐘，去上清，每個脾臟加入5ml紅細胞裂解液(ACK)裂解紅細胞，PBS清洗細胞兩次。用RPMI1640完全培養液重懸細胞，調細胞濃度為1×107/ml。在24孔板中按2×106/50ul/孔加入脾細胞，然后在每孔中加入hCG抗原至終濃度100IU/ml，培養48h后用ELISA法檢測培養上清中IFNγ、IL-2、IL-4和IL-10的分泌水平。
培養上清中IFNγ、IL-2、IL-4和IL-10的測定將50μl培養上清加入到96孔酶標板，室溫孵育2h，洗板5次。加入100μlHRP標記的抗小鼠細胞因子抗體，室溫孵育2h，洗板5次。每孔加入100μl底物溶液，室溫避光孵育30min后加入100μl終止液終止反應，于450nm波長測OD值。
實施例5.hCGβ-C3d3融合蛋白疫苗的抗生育潛能分析抗血清制備hCGβ-C3d3融合蛋白、單用hCGβ和hCGβ加用弗氏完全佐劑免疫的BALB/c小鼠于末次免疫后3周摘除眼球取血，分離出血清-20℃貯存備用。抗血清使用前先經0.22μm濾膜過濾除菌。
hCGβ-C3d3免疫鼠血清拮抗hCG刺激MLTC-1細胞分泌孕酮的作用MLTC-1是一個小鼠睪丸間質Leydig腫瘤細胞系，其表面有hCG的受體，此受體結構與正常小鼠的Leydig細胞一致。在hCG作用下，MLTC-1細胞能分泌孕酮。為了檢測hCGβ-C3d3融合蛋白免疫BALB/c小鼠產生的抗血清是否具有中和hCG生物學活性的能力，在12孔板內每孔傳入1×105MLTC-1細胞，用1ml含10％小牛血清的RPMI1640培養。同時加入10IU hCG和100μl的正常鼠血清、hCGβ-C3d3抗血清、hCGβ抗血清和hCGβ+CFA/IFA抗血清共培養，7小時后取培養上清檢測孕酮含量。
hCGβ-C3d3免疫鼠血清對hCG誘導小鼠子宮增重的抑制效應3周齡雌性BALB/c小鼠，隨機分為3個大組，每大組內小鼠再隨機分為7個小組，每小組5只。均給予皮下注射hCG 4IU，同時腹腔內分別注射系列稀釋的正常鼠血清、hCGβ-C3d3免疫鼠血清、hCGβ免疫鼠血清和hCGβ+CFA/IFA免疫鼠血清，注射劑量為100μl。每天注射兩次，間隔8h，連續注射3d，第4d上午脫頸法處死小鼠，取子宮稱濕重，計算每克體重的子宮濕重(mg/g)。
本發明結果顯示無論是BALB/c小鼠還是C57BL/6小鼠，hCGβ-C3d3融合蛋白誘導產生抗hCGβ抗體的出現時間都明顯早于hCGβ+CFA/IFA免疫和hCGβ單獨免疫組。在BALB/c小鼠，初次和再次免疫結果顯示，C3d3使hCGβ的免疫原性增強了1995倍。與hCGβ-C3d3基因疫苗相比，hCGβ-C3d3融合蛋白疫苗的免疫原性有了明顯的提高。C3d3使hCGβ的免疫原性增強了1259倍。表明在個體差異很大的不同品系小鼠，C3d3均能增強機體對hCGβ的體液免疫應答能力。為解決hCGβ避孕疫苗免疫效果在個體之間的差異提供了理論依據。
檢測受試鼠脾細胞在體外hCG抗原再次刺激下分泌Th1型(IFNγ、IL-2)和Th2型(IL-4、IL-10)細胞因子結果表明，hCGβ-C3d3融合蛋白免疫鼠脾細胞IL-4和IL-10分泌水平明顯高于hCGβ免疫鼠，以IL-4最明顯。從IL-4與IFNγ的比值分析，hCGβ-C3d3融合蛋白免疫動物顯示出明顯的Th2型優勢效應。表明分子佐劑C3d3是通過誘導Th2型細胞因子優勢表達來實現其增強hCGβ蛋白抗原體液免疫效力。
本發明結果還顯示，hCGβ-C3d3融合蛋白免疫鼠血清具有很強的中和hCG生物學活性的作用，能明顯抑制hCG刺激MLTC-1細胞分泌孕酮的作用，也能有效拮抗hCG誘導的小鼠子宮增重作用。表明hCGβ-C3d3融合蛋白疫苗具有較強的抗生育潛能。
本發明結果顯示，對于hCGβ抗原而言，C3d3的佐劑能力強于弗氏佐劑。加之C3d是體內補體C3自身的一個裂解產物，克服了弗氏佐劑中的石蠟油對機體有毒性，和引起注射部位局部組織的潰爛和壞死的危險，是完全適合人類應用的新型分子佐劑。
權利要求
1.一種攜分子佐劑的融合蛋白避孕疫苗，其特征在于將分子佐劑C3d3與hCGβ通過基因克隆構建入真核表達質粒pCMV1制成，包括下述步驟1)構建分泌型真核表達質粒phCMV1-6His-hCGβ-C3d3和phCMV1-6His-hCGβ，2)表達、鑒定與純化hCGβ-C3d3融合蛋白和hCGβ蛋白，3)檢測hCGβ-C3d3融合蛋白免疫小鼠的體液免疫效應及抗血清特性。
2.根據權利要求1所述的攜分子佐劑的融合蛋白避孕疫苗，其特征在于所述的融合蛋白在氨基端加上6個組氨酸純化標簽。
全文摘要
本發明屬生物制藥領域，涉及一種與分子佐劑交聯的避孕疫苗，具體涉及一種與分子佐劑C3d3交聯的hCGβ－C3d3融合蛋白避孕疫苗。本發明選用真核表達載體phCMV1，分別構建帶有6個組氨酸純化標簽的hCGβ－C3d3融合蛋白和hCGβ蛋白的真核表達質粒phCMV1－6His－hCGβ－C3d3和phCMV1－6His－hCGβ。在體外表達、鑒定、純化出hCGβ－C3d3融合蛋白和hCGβ蛋白。分別加用弗氏佐劑免疫不同品系小鼠。經檢測抗體水平、抗血清中和hCG生物學活性的能力和脾細胞分泌細胞因子的水平，證實hCGβ－C3d3融合蛋白疫苗具有較強的抗生育潛能作用。
文檔編號A61K39/39GK1569227SQ20041001803
公開日2005年1月26日 申請日期2004年4月29日 優先權日2004年4月29日
發明者李大金, 王秀麗 申請人:復旦大學附屬婦產科醫院