專利名稱：預防和治療人丙型肝炎病毒感染的重組蛋白疫苗及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種基因工程領域，具體地涉及基因工程重組蛋白疫苗(下文有時也稱為“基因工程重組蛋白”)，特別是涉及一種預防和治療人丙型肝炎病毒感染的重組蛋白疫苗；這種重組蛋白的氨基酸序列；編碼這種重組蛋白疫苗的核苷酸序列(下文有時也稱為“基因”)；含有該核苷酸序列的表達載體；含有該表達載體的宿主細胞，以及該重組蛋白疫苗的制備方法；本發明還涉及該基因工程重組蛋白在制備用于預防和治療人丙型肝炎病毒感染的疫苗制品中的用途以及含有該基因工程重組蛋白的疫苗制品；用裝載丙型肝炎病毒特異性多肽的腫瘤細胞檢測丙型肝炎病毒特異性殺傷性T淋巴細胞的方法。
在世界范圍內，采用α-干擾素和病毒唑對病人進行聯合藥物是治療丙型肝炎病毒感染的唯一方法，其有效率最高只有40％[Jon Cohen.丙型肝炎的科學挑戰(The Scientific Challenge of Hepatitis C).科學(Science)，1999，28526-30]。
采用有效的疫苗控制和治療丙型肝炎病毒感染是預防和治療丙型肝炎病毒感染的理想途徑，在這方面，科學家一直在進行不懈的探索。迄今為止，在世界上尚未研制出有效的丙型肝炎丙型肝炎病毒疫苗。
對于一些病毒，例如A型流感病毒(influenza A)，乙型肝炎病毒(HBV)等，誘導中和抗體似乎足以抵御感染；但對另外許多病毒，必須產生有效的特異性殺傷性T淋巴細胞(CTL)反應才能清除病原體[IsabelleP.Hunziker，Rinaldo Zurbriggen，Reinhard Glueck et.al.展望對于一種針對丙型肝炎病毒的多肽疫苗(Perspectivestowards apeptide-based vaccine against hepatitis C virus)分子免疫(Molecular Immunology)2001 38，475-484]。近年的研究表明，CD8+殺傷性T淋巴細胞(CTL)也能有效地預防和清除HCV感染[Cooper S；EricksonAL；Adams EJ等，成功的抗丙型肝炎病毒的免疫反應的分析(Analysis ofa successful immune response against hepatitis C virus).免疫(Immunity)1999 Apr；10(4)439-449]。Cerny等的工作表明，HCV保守區域的HLA-A2.1結合表位可誘導丙型肝炎病毒特異性的CTL反應[Cerny A，McHutchison JG，Pasquinelli C等，對丙型肝炎病毒來源的含有結合基序的多肽的細胞毒性T淋巴細胞反應(Cytotoxic T lymphocyteresponse to hepatitis C virus-derived peptides containing thebinding motif.)臨床研究雜志(J Clin Invest)，1995，95521-530]。作為HCV保守區域的蛋白成分，核心蛋白含有若干不同MHC-I類分子限制的T細胞表位，根據這些表位的序列可能研制出對丙型肝炎病毒感染有預防和治療作用的疫苗，在研制的此類疫苗中有DNA疫苗、病毒載體疫苗和合成肽疫苗等。
研究表明，外源性的蛋白類抗原在免疫人體后，通常被抗原提呈細胞攝取、加工，進入MHC II類提呈途徑，能激發體液免疫反應(Heikema A，Agsteribbe E，Wilschut J，Huckriede A.通過胞內裝載gp96抗原肽產生基于熱休克蛋白的疫苗(Generation of heat shock protein-basedvaccines by intracellular loading of gp96 with antigenic peptides).免疫學通訊(Immunol Lett)1997 Jun 1；57(1-3)69-74)，但不能有效激活特異性的CTL的產生。因此，賦予HCV核心抗原以能特異性激活CTL的性質就成為研究以HCV核心抗原疫苗的一個技術關鍵。
熱休克蛋白(heat shock protein，下文有時簡稱為“HSP”)是存在于多種生物體內的一個分子伴侶蛋白質家族。在免疫應答的過程中，熱休克蛋白可表現如下三種基本的功能1、協助抗原性物質進入包括樹突狀細胞在內的抗原提呈細胞；2、在抗原提呈細胞中和加工處理的抗原物質相互作用使之進入MHC I類抗原提呈途徑，進而激活抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)；3、刺激樹突狀細胞表達協同刺激分子(如B7等)和分泌細胞因子(Suzue K，Zhou X，Eisen HN，Young RA.熱休克蛋白融合蛋白作為載體將抗原帶入主要組織相容性復合體I類分子提呈途徑(Heat shock fusion proteins as vehicles forantigen delivery into the major histocompatibility complex classI presentation pathway).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1997 Nov25；94(24)13146-13151)。
本發明的另一方面是提供這種重組蛋白的氨基酸序列。
本發明的另一方面是提供一種編碼這種重組蛋白的核苷酸序列。
本發明的另一方面是提供一種含有該核苷酸序列的表達載體。
本發明的另一方面是提供一種含有含有該表達載體的宿主細胞。
本發明的另一方面是提供一種制備該重組蛋白疫苗的方法。
本發明的另一方面涉及該基因工程重組蛋白在制備用于預防和治療丙型肝炎的疫苗制品中的用途。
本發明的另一方面涉及用裝載丙型肝炎病毒特異性多肽的腫瘤細胞檢測丙型肝炎病毒特異性殺傷性T淋巴細胞的方法。
本發明的又一方面涉及含有該基因工程重組蛋白的疫苗制品。
因此，正是本發明人經過長期的大量的研究，解決了現有技術中的技術難題，首次開拓性地將卡介苗熱休克蛋白65與多表位HCV核心抗原相連形成了全新的基因工程重組蛋白，從而賦予HCV核心抗原以能特異性激活CTL的性質，實現了對丙型肝炎的有效的預防和治療。
另外，需要指出的是，在本申請的上下文的公開內容的基礎上，本發明的其它具有實質性特點的方面及其創造性的有益效果對本領域的普通技術人員來說是顯而易見的。
附圖簡要說明

圖1是描述本發明的重組蛋白疫苗的制備過程流程圖解。
圖2是以卡介苗基因組為模板用熱休克蛋白65(HSP65)特異性引物進行PCR所得到的PCR產物的電泳圖，其中泳道1為DNA marker，泳道2箭頭所示為PCR產物。
圖3所示的是為合成單拷貝多表位HCV核心抗原基因而進行的第一輪PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳照片，其中箭頭所示為PCR產物。
圖4所示的是為合成單拷貝多表位HCV核心抗原基因而進行的第二輪PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳照片，其中箭頭所示為PCR產物。
圖5所示的是酶切鑒定pMD-18T-多表位HCV核心抗原重組質粒的瓊脂糖凝膠電泳照片，其中泳道1為DNA marker，泳道2為未經酶切的pMD-18T-多表位HCV核心抗原重組質粒，泳道3為EcoRI和HindIII雙酶切后的pMD-18T-多表位HCV核心抗原重組質粒。
圖6所示的是PET28a-Hsp65重組質粒酶切鑒定電泳照片，其中泳道1為DNA marker，泳道2為經NcoI和EcoRI雙酶切后的PET28a-Hsp65重組質粒，箭頭所示為釋放的DNA片段。
圖7所示的是PET28a-Hsp65-多表位HCV核心抗原重組質粒酶切鑒定電泳照片，其中泳道1為DNA marker，泳道2為經EcoRI和HindIII雙酶切后的PET28a-Hsp65-多表位HCV核心抗原重組質粒，箭頭所示為釋放的DNA片段(多表位HCV核心抗原)。
圖8所示的是PET28a-Hsp65-多表位HCV核心抗原重組質粒結構示意圖。
圖9為純化后的含有PET28a-Hsp65-多表位HCV核心抗原重組質粒的大腸桿菌表達產物(卡介苗HSP-65和多表位HCV核心抗原基因融合蛋白)的SDS-PAGE分析，其中泳道1為純化后的表達產物，泳道2為純化后經過除鹽的表達產物，泳道3為蛋白質分子量標志。可以看到目的蛋白分子量為80kDal左右，與理論計算值相符。
圖10所示的是酶切鑒定PET26b-8R-多拷貝多表位HCV核心蛋白重組質粒的電泳照片，其中泳道1和2是經BamH I和Xho I雙酶切后的PET26b-8R-多拷貝多表位HCV核心蛋白重組質粒，箭頭所示為釋放出的DNA片段(多拷貝多表位HCV核心抗原)，泳道3是DNA marker。
圖11所示的是大腸桿菌中表達的8R-多拷貝多表位HCV核心蛋白融合蛋白純化后的SDS-PAGE分析，其中泳道1為純化的8R-多拷貝多表位HCV核心蛋白融合蛋白，泳道3為純化后經過除鹽的8R-多拷貝多表位HCV核心蛋白融合蛋白，泳道4為蛋白質分子量標志，可以看到目的蛋白分子量為35kDal左右，與理論計算值相符。
圖12所示為疫苗組和對照組小鼠腫瘤形成狀況的對比照片。
圖13所示為表達HCV核心抗原表位的B16細胞的體外特異性殺傷實驗結果。
“卡介苗熱休克蛋白65”是指來源于卡介苗的分子量為65kDal的熱休克蛋白，其氨基酸序列優選地如實施例1中所示。
“多表位HCV核心抗原”是指來源于丙型肝炎病毒核心蛋白的5個表位相連接而形成的多肽，其氨基酸序列優選地如SEQ ID NO9所示，其編碼核苷酸序列優選地如SEQ ID NO8所示。
“人丙型肝炎病毒感染”是指丙型肝炎病毒通過某種途徑進入人體并感染肝細胞的狀態，包括急性感染和慢性感染以及無癥狀攜帶狀態，包括，但不限于表現出肝病臨床癥狀或有生化指標改變的狀態。
“嚴緊的雜交條件”是指為避免反應體系中非同源性或部分同源性的核酸序列形成雜交復合物而采用的雜交條件，如較高的反應溫度和低離子強度。
″治療″或″預防″包括(1)預防疾病，也就是使疾病的臨床癥狀不會在哺乳動物中發展，所述的哺乳動物可能與該疾病的病原體接觸或易患有該疾病但不曾經歷或顯現出疾病的該癥狀，(2)抑制疾病，也就是阻止或減輕該疾病或其臨床癥狀的發展，或(3)緩解疾病，也就是引起疾病或其臨床癥狀的退化。
丙型肝炎病毒的基因型和我們采用的丙型肝炎病毒基因序列丙型肝炎病毒基因組具有顯著異源性，而且具有一定的地域和人群分布特征。目前將已發現的100多種丙肝毒株分為6種主要基因型[Simmonds P.丙型肝炎病毒的異源性(Viral heterogeneity of the hepatitis C virus).1999 J.肝臟病學(Hepatology)3154-60]。歐美國家主要流行株為I型，亞洲及我國流行株屬于II型。本發明中所依據的基因序列來自HCV typeIb，即為II型中的一株。
本發明提供了一種重組蛋白疫苗，它是由卡介苗熱休克蛋白65和多表位HCV核心抗原融合而形成的融合蛋白，其中，所述的單拷貝多表位HCV核心抗原由如SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4和SEQ ID NO5所示的序列的多肽相互連接形成(按照1-5的順序連接)Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Glu Ile Asp Asp(SEQ ID NO1)；Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Glu AspSer Glu(SEQ ID NO2)；Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg AlaGlu Asn Asp Glu Ile Glu(SEQ ID NO3)；Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Asn AspGlu(SEQ ID NO4)；Leu Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Glu IleAsp Asn Glu(SEQ ID NO5)。該單拷貝多表位HCV核心抗原的序列優選地如SEQ ID NO9所示或其功能等價物，而所述的單拷貝HCV核心抗原多表位的表達基因的序列優選地具有SEQ ID NO8所示的核苷酸序列。
本發明的重組蛋白疫苗中，卡介苗熱休克蛋白65可以位于該融合蛋白的氨基端，單拷貝多表位HCV核心抗原位于該融合蛋白的羧基端。
將單拷貝多表位HCV核心抗原和卡介苗熱休克蛋白65的基因融合可表達出多表位HCV核心抗原和卡介苗熱休克蛋白65融合蛋白(序列優選地如SEQ ID NO7所示)。此蛋白在應用于人體后可在包括樹突狀細胞在內的抗原提呈細胞內進入MHC I類途徑加工提呈，誘生丙型肝炎病毒特異性CTL。此CTL可殺傷丙型肝炎病毒感染的細胞并失活丙型肝炎病毒因而對丙型肝炎病毒感染有預防和治療的作用。
因此，本發明的重組蛋白疫苗具有選自如下的任一氨基酸序列1)SEQ ID NO7所示的氨基酸序列；和2)由在嚴緊的雜交條件下與編碼1)的氨基酸序列的核苷酸序列雜交的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。
本發明還提供了編碼本發明的重組蛋白疫苗的核苷酸序列，該核苷酸序列可以具有選自如下的任一序列1)SEQ ID NO6所示的核苷酸序列；和2)由在嚴緊的雜交條件下與1)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
我們將這五個肽段的編碼基因相連在一起，合成了一種新的基因，這一基因編碼的多肽即為單拷貝多表位HCV核心抗原。將單拷貝多表位HCV核心抗原和卡介苗熱休克蛋白65融合形成的融合蛋白，可刺激人體的細胞毒性T細胞(CTL)攻擊和殺傷表達HCV核心抗原的靶細胞，因而對丙型肝炎預防和治療的作用。將單拷貝多表位HCV核心抗原相連接獲得的2-5個拷貝的多拷貝單拷貝多表位HCV核心抗原和卡介苗熱休克蛋白65融合形成的融合蛋白也可刺激人體的細胞毒性T細胞(CTL)攻擊和殺傷表達HCV核心抗原的靶細胞，因而對丙型肝炎預防和治療的作用。
卡介苗熱休克蛋白65是一種來源于卡介苗的蛋白質，它在和多表位HCV核心抗原形成融合蛋白后，可以協助多表位HCV核心抗原進入包括樹突狀細胞在內的抗原提呈細胞，并進入MHC I類途徑加工提呈，進而激活抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)對表達HCV核心抗原的細胞進行攻擊和殺傷。此外，卡介苗熱休克蛋白65還可刺激包括樹突狀細胞在內的抗原提呈細胞表達協同刺激分子(如B7等)和分泌細胞因子，這些協同刺激分子(如B7等)和細胞因子可激活細胞毒性T淋巴細胞的腫瘤細胞殺傷能力。
本發明的重組蛋白疫苗可通過本領域已知的方法，例如按照文獻(Brennan，W.A.and Lin，S.H.蛋白質純化策略及實驗規程(“Strategiesfor Protein Purification and Characterization，A LaboratoryManual”)，冷泉港實驗室出版，1996 Cold Spring Harbor LaboratoryPress.)所述進行生產，以下的實施例詳細地例舉了一種生產本發明的重組蛋白疫苗的方法。
因此，本發明還提供了含有上述編碼本發明的重組蛋白疫苗的核苷酸序列的表達載體；含有該表達載體的宿主細胞，其可以為本領域常規的各種原核細胞，真核細胞或哺乳動物細胞；以及該重組蛋白疫苗的基因工程制備方法。
另外，本發明還涉及該基因工程重組蛋白在制備用于預防和治療人丙型肝炎的疫苗制品中的用途以及含有該基因工程重組蛋白的疫苗制品。本領域技術人員可以理解的是，這些疫苗制品可用本領域周知的各種常規方法制備。
本發明的重組蛋白疫苗可通過皮下注射的方式給人接種，接種的劑量為100-500μg。為了加強效果，可進行2-3次的加強免疫。時間間隔可為2周-2月。
為了彌補因無丙型肝炎病毒細胞模型和動物模型的不足，本發明創立了一種研究丙型肝炎病毒疫苗激發特異性CTL并產生保護作用的新方法，即提供了一種檢測丙型肝炎病毒疫苗活性的一種方法。動物模型構建原理八聚精氨酸(8R)能有效地將其C末端的融合蛋白帶入細胞內并進入MHC-I類途徑[Park J，Ryu J，Kim KA，et al.攜帶外源性蛋白進入哺乳動物細胞所必須的I型人免疫缺陷病毒Tat蛋白轉導區域的變異分析(Mutational analysis of a human immunodeficiency virustype 1 Tat protein transduction domain which is required fordelivery of an exogenous protein into mammalian cells)普通病毒學雜志(J Gen Virol)2002 May；83(Pt5)1173-81]。我們利用8R的這一特性，構建8R-多拷貝多表位HCV核心抗原融合蛋白，并將其轉染來源于C57小鼠的黑色素瘤細胞B16。這樣的B16細胞表面將表達HCV核心抗原表位，可以被HCV核心抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)殺傷。將這種B16細胞注射入接種HCV疫苗的C57小鼠體內，觀察腫瘤生長狀況，并與未接種疫苗的小鼠進行對比，可作為一種檢測丙型肝炎病毒疫苗活性的方法。
下面結合具體的制備實施例和生物學效果實施例，并參照附圖進一步詳細地描述本發明。應理解，這些實施例只是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制本發明的范圍。
提取卡介苗基因組DNA的方法參照Molecular Cloning一書(J.Sambrook，從哺乳動物分離高分子量DNA(Isolation of high-molecular-weight DNA from mammalian cells)，9.16-9.22，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Molecular cloning，1989)。
采用PCR方法自卡介苗分離熱休克蛋白65(HSP65)結構基因。采用的5′端引物序列為5′CCATG GCC AAG ACA ATT GCG3′(SEQ ID NO21)，3′端引物序列為5′ACC GAA TTC GCT AGC CAT ATG GAA ATC CATGCC ACC CAT 3′(SEQ ID NO22)。
所述PCR操作程序是在一500μl微量離心管中加入下列試劑模板cDNA 5μl(10mmol/L)10×PCR緩沖液(67mmol/L Tris-Cl pH8.8，50mmol/L KCl，15mmol/L MgCl，10mmol/L DMSO)5μldNTPs(10mmol/L)1μl5′端和3′端引物(0.01mmol/L)各0.5μlTaq DNA聚合酶(5u/μl)0.25μl加去離子水至終體積50μl混合后加入礦物油3滴反應條件94℃，30″；55℃，1′；72℃，2′，30個循環周期后，72℃延伸10分鐘。
采用TA克隆方法克隆PCR產物，方法見文獻(于永利，麻彤輝，楊貴貞。TA克隆及雙鏈DNA測序介紹一種快速克隆及分析PCR產物的方法。中國免疫學雜志，1994，10(1)5)。
按常規方法(J.Sambrook，聚丙烯酰胺凝膠電泳(Polyacrylamidegel electrophoresis)1.21-1.32，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Molecular cloning，1989)提取質粒，DNA序列分析儀測序。所獲PCR產物的序列是cc atg gcc aag aca att gcg tac gac gaa gag gcc cgt cgc ggc ctc gagcgg ggc ttg aac gcc ctc gcc gat gcg gta aag gtg aca ttg ggc ccc aagggc cgc aac gtc gtc ctg gaa aag aag tgg ggt gcc ccc acg atc acc aacgat ggt gtg tcc atc gcc aag gag atc gag ctg gag gat ccg tac gag aagatc ggc gcc gag ctg gtc aaa gag gta gcc aag aag acc gat gac gtc gccggt gac ggc acc acg acg gcc acc gtg ctg gcc cag gcg ttg gtt cgc gagggc ctg cgc aac gtc gcg gcc ggc gcc aac ccg ctc ggt ctc aaa cgc ggcatc gaa aag gcc gtg gag aag gtc acc gag acc ctg ctc aag ggc gcc aaggag gtc gag acc aag gag cag att gcg gcc acc gca gcg att tcg gcg ggtgac cag tcc atc ggt gac ctg atc gcc gag gcg atg gac aag gtg ggc aacgag ggc gtc atc acc gtc gag gag tcc aac acc ttt ggg ctg cag ctc gagctc acc gag ggt atg cgg cag gag gcg gtc ctg gag gac ccc tac atc ctgctg gtc agc tcc aag ctg tcc acc ctg gtc gtc aac aag atc cgc ggc accttc aag tcg gtg gcg gtc aag gct ccc ggc ttc ggc gac cgc cgc aag gcgatg ctg cag gat atg gcc att ctc acc ggt ggt cag gtg atc agc gaa gaggtc ggc ctg acg ctg gag aac gcc gac ctg tcg ctg cta ggc aag gcc cgcaag gtc gtg gtc acc aag gac gag acc acc atc gtc gag ggc gcc ggt gacacc gac gcc atc gcc gga cga gtg gcc cag atc cgc cag gag atc gag aacagc gac tcc gac tac gac cgt gag aag ctg cag gag cgg ctg gcc aag ctggcc ggt ggt gtc gcg gtc atc aag gcc ggt gcc gcc acc gac gtc gaa ctcaag gag cgc aag cac cgc atc gag gat gcg gtt cgc aat gcc aag gcc gccgtc gag gag ggc atc gtc gcc ggt ggg ggt gtg acg ctg ttg caa gcg gccccg acc ctg gac gag ctg aag ctc gaa ggc gac gag gcg acc ggc gcc aacatc gtg aag gtg gcg ctg gag gcc ccg ctg aag cag atc gcc ttc aac tccggg ctg gag ccg ggc gtg gtg gcc gag aag gtg cgc aac ctg ccg gct ggccac gga ctg aac gct cag acc ggt gtc tac gag gat ctg ctc gct gcc ggcgtt gct gac ccg gtc aag gtg acc cgt tcg gcg ctg cag aat gcg gcg tccatc gcg ggg ctg ttc ctg acc acc gag gcc gtc gtt gcc gac aag ccg gaaaag gag aag gct tcc gtt ccc ggt ggc ggc gac atg ggt ggc atg gat ttccat atg gct agc gaa ttc
另外，圖2給出了以卡介苗基因組為模板用熱休克蛋白65(HSP65)特異性引物進行PCR所得到的PCR產物的電泳圖。
操作過程1回收PCR產物將目的DNA區帶的瓊脂糖凝膠切下，置1.5ml Ep管中，用DNA快速回收試劑盒(北京鼎國公司)回收目的DNA片段(操作步驟見產品說明)2連接反應載體質粒pMD-18T(50ng/μl)0.5μlPCR產物(10ng/μl)4.5μlLigation Solution I(Takara，成分見產品說明)5μl16℃反應2小時3轉化大腸桿菌JM109感受態細胞的制備a、將大腸桿菌JM109(本室保存)在LB瓊脂培養基上劃線，37℃培養12-16小時；b、次日從瓊脂平板上取一單菌落于2ml LB培養基中，37℃以225rpm速度震蕩培養12-16小時；c、取1ml上述培養物接種于100ml LB培養基中，37℃以225rpm的速度震蕩培養直至OD值為0.5左右(大約3小時)；d、將菌液冰浴2小時，然后2,500Xg，4℃離心20分鐘收集菌體；e、加入100ml冰冷的Trituration緩沖液(100mmol/LCaCl2，70mmol/L MgCl2，40mmol/L醋酸鈉，pH5.5)，混勻，置冰上45分鐘；f、1,800Xg，4℃離心10分鐘，棄上清，加入10ml冰冷的Trituration緩沖液懸浮細胞；g.按每份200ul分裝，4℃可保存1-2周。若需長期保存，可加甘油至終濃度為15％，置-70℃備用。
轉化方法a、將200ul感受態細胞置冰上融化，然后加入3ul DMSO或β-巰基乙醇，混合后，加入3-5μl連接反應液(含重組質粒)，溫和混勻，置冰上30分鐘；b、42℃45秒，然后迅速放回冰中1-2分鐘；c、加入2ml LB培養液，37℃以225rpm的速度搖蕩培養1小時；d、4,000Xg離心10秒鐘，棄上清，用200ul LB培養液重懸菌體；
e、將菌液鋪于含有Ampicillin(100ug/ml)的LB瓊脂培養板上，涂勻，室溫放置20-30分鐘，倒置于37℃孵箱中培養12-16小時。用限制性內切酶消化的方法鑒定重組克隆。
f、質粒和菌株的保存質粒冰凍保存于-20℃。菌株在含20-50％甘油培養液中保存于-20℃或-70℃。圖5所示的是酶切鑒定pMD-18T-多表位HCV核心抗原重組質粒的瓊脂糖凝膠電泳照片，其中泳道1為DNAmarker，泳道2為未經酶切的pMD-18T-多表位HCV核心抗原重組質粒，泳道3為EcoRI和HindIII雙酶切后的pMD-18T-多表位HCV核心抗原重組質粒。
卡介苗HSP-65基因的克隆用NcoI(Takara)和EcoRI(Takara)在37℃消化得自實施例1的質粒，時間為2小時。消化產物瓊經脂糖凝膠電泳分離。電泳的條件是1％瓊脂糖凝膠，1×TAE緩沖液，150-200mA，電泳0.5-1小時。20×TAE緩沖液0.8mol/L Tris base，0.4mol/L NaOAc，0.04mol/L Na2EDTA，用冰醋酸調pH8.3。
在紫外燈下觀察并切下瓊脂糖凝膠上的DNA電泳帶。將含DNA區帶的瓊脂糖凝膠切下，置-70℃冷凍15分鐘；室溫融化后，12,000rpm離心5分鐘，將上層液相移至另一管中，用2-2.5倍乙醇沉淀、洗滌和干燥DNA。
將回收的DNA片段克隆入經限制性內切酶NcoI(Takara)和EcoRI(Takara)消化的原核細胞表達載體pET-28a(+)質粒(美國Novagen公司)的6聚組氨酸(histidine)密碼子的上游。
質粒DNA的消化反應1μg質粒DNA1μl 10×緩沖液(見Promega Corporation產品說明書)。
1μl限制性內切酶NcoI(10單位/μl)1μl限制性內切酶EcoRI(10單位/μl)用雙蒸水補齊至10μl
混合后37℃溫育30-120分鐘。
連接反應質粒DNA(0.5μg/μl)2μlDNA插入片段(即卡介苗HSP-65基因)(300ng/μl)5μl10×連接緩沖液(見Protocols and Applications Guide，p57，Promega Corporation，Second Edition，1991)1μlT4 DNA連接酶1μl用雙蒸水補齊至10μl混合后置14-16℃水浴6-12小時。
將含卡介苗HSP-65基因的重組pET-28a(+)質粒轉化大腸桿菌。轉化方法同上。酶切鑒定陽性重組質粒。圖6所示的是PET28a-Hsp65重組質粒酶切鑒定電泳照片，其中泳道1為DNA marker，泳道2為經NcoI和EcoRI雙酶切后的PET28a-Hsp65重組質粒，箭頭所示為釋放的DNA片段。
20×TAE緩沖液0.8mol/L Tris base0.4mol/L NaOAc0.04mol/L Na2EDTA用冰醋酸調pH8.3。
在紫外燈下觀察并切下瓊脂糖凝膠上的DNA電泳帶。將含目的DNA區帶的瓊脂糖凝膠切下，置Ep管中，用DNA快速回收試劑盒(北京鼎國公司)回收目的DNA片段及線性化質粒。
將經EcoRI/HindIII消化的PET28a-HSP65重組質粒和多表位HCV核心抗原基因用T4 DNA連接酶(Takara)連接。連接物轉化感受態細胞JM109，用限制性內切酶消化的方法鑒定重組克隆。(具體序列參見SEQ ID No6)。重組質粒冰凍保存于-20℃。菌株在含20-50％甘油培養液中保存于-20℃或-70℃。圖7所示的是PET28a-Hsp65-多表位HCV核心抗原重組質粒酶切鑒定電泳，其中泳道1為DNA marker，泳道2為經EcoRI和HindIII雙酶切后的PET28a-Hsp65-多表位HCV核心抗原重組質粒，箭頭所示為釋放的DNA片段(多表位HCV核心抗原)。圖8所示的是PET28a-Hsp65-多表位HCV核心抗原重組質粒結構示意圖。
裂解緩沖液20mM Tris.HCL(pH7.9)5mM imidazole0.5M NaCl0.1mM PMSF每毫升裂解緩沖液加1M MgSO410ul，10ug/ml DNase I 10ul。冰上放置30min。12,000rpm，4℃離心15min。棄上清。每克菌加1.5ml結合緩沖液。
結合緩沖液20mM Tris.HCL(pH7.9)5mM imidazole
0.5M NaCl6M urea冰上放置2h。12,000rpm，4℃離心15min。留取上清，做Ni2+-Saphrose-4-B層析(層析介質購自Pharmacia公司)，分離HSP-65和多表位HCV核心抗原融合蛋白。
洗脫的目的蛋白進行苯基Sepharose疏水層析(層析介質購自Pharmacia公司)去除內毒素。
采用葡聚糖凝膠Sephadex-G-25離子交換層析(層析介質購自Pharmacia公司)去除目的蛋白中的鹽類。
采用常規的SDS-PAGE方法(J.Sambrook，聚丙烯酰胺凝膠電泳(Polyacrylamide gel electrophoresis)6.36-6.49，Cold Spring HarborLaboratory Press，Molecular cloning，1989)。鑒定HSP-65和HCV核心抗原多表位基因融合蛋白純度為95％。圖9為純化后的含有PET28a-Hsp65-多表位HCV核心抗原重組質粒的大腸桿菌表達產物(卡介苗HSP-65和多表位HCV核心抗原基因融合蛋白)的SDS-PAGE分析，其中泳道1為純化后的表達產物，泳道2為純化后經過除鹽的表達產物，泳道3為蛋白質分子量標志。可以看到目的蛋白分子量為80kDal左右，與理論計算值相符。實施例7八聚精氨酸(8R)-多拷貝多表位HCV核心抗原融合蛋白的表達和純化8R即八聚精氨酸，是一段由8個精氨酸殘基連接而成短肽，它能有效地將其C末端的融合蛋白帶入細胞內并進入MHC-I類途徑。我們利用8R的這一特性，構建8R-多拷貝多表位HCV核心抗原融合蛋白，用于轉染細胞。
實驗過程(a)PCR獲取HCV core multiple epitopes DNA為構建多拷貝多表位HCV核心抗原，設計一對引物primer 3AAG CTTACCA TGGTTGGA TCCATGTCTACTA ACCCGAAACC(SEQ ID NO18)primer 3’GAA TTCTTACTC GAGAGA TCTTTCGTTGTCG ATTTCCTGAC(SEQ ID NO19)。為構建多聚體，引物兩端分別設計BamH I、Bgl II酶切位點，以序列正確的pMD-18T-HCVcore multiple epitope重組質粒為模板進行PCRprimer3、primer3’各1μl(0.01mM)，模板質粒1μl，10mM dNTP2μl，10×Taq DNA聚合酶緩沖液10μl(北京鼎國公司，成分見產品說明)，Taq DNA聚合酶(20u/μl)1μl，84μl ddH2O。混勻后加一滴礦物油。按下列程序在PCR儀中擴增94℃ 30sec，55℃ 60sec，72℃ 90sec，共30個循環。循環結束后，72℃延伸10分鐘。反應結束后取PCR產物10μl做2％瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外燈下觀察結果。特異性DNA片段(HCVcoremultiple epitope)的回收及TA克隆方法同前。(b)pMD-18T-poly3 HCVcore multiple epitope重組質粒的構建取2個0.5ml Ep管(1和2)，每管加入pMD-18T-HCV’重組質粒16μl。管1中加10xBuffer K(Takara)2μl，限制酶BamH I、Pst I(Takara)各1μl；管2中加10xBuffer H(Takara)2μl，限制酶Bgl II、Pst I(Takara)各1μl。37℃孵育2小時，2％瓊脂糖凝膠電泳。回收管1中釋放出的特異性片段(multiple HCVcoreepitope)和管2中的線性化質粒(pMD-18T-multiple HCVcoreepitope)。連接，轉化，酶切鑒定(方法同前)。得到的陽性重組質粒為pMD-18T-poly2 multiple HCVcore epitope。
取pMD-18T-poly2 multiple HCVcore epitope重組質粒16μl，加10xBuffer H 2μl，限制酶Bgl II、Pst I各1μl。37℃孵育2小時，2％瓊脂糖凝膠電泳。回收線性化質粒，與上述HCVcore multipleepitope連接，轉化JM109感受態細胞。提取質粒酶切鑒定，所得陽性重組質粒為pMD-18T-poly3 multiple HCVcore epitope。(c)PET26b-8R-poly3 HCVcore multiple epitope表達質粒的構建質粒PET26b-8R用BamH I和Xho I(Takara)消化，回收線性化載體；pMD-18T-poly3 multiple HCVcore epitope重組質粒同樣用BamH I和Xho I消化，回收DNA片段poly3 multiple HCVcoreepitope。將二者連接，轉化感受態菌JM109。提取陽性重組質粒備用。
(方法同前)(d)PET26b-8R-poly3 HCVcore multiple epitope的表達和純化(方法同前)。
圖10所示的是酶切鑒定PET26b-8R-多拷貝多表位HCV核心蛋白重組質粒的電泳照片，其中泳道1和2是經BamH I和Xho I雙酶切后的PET26b-8R-多拷貝多表位HCV核心蛋白重組質粒，箭頭所示為釋放出的DNA片段(多拷貝多表位HCV核心抗原)，泳道3是DNA marker。圖11所示的是大腸桿菌中表達的8R-多拷貝多表位HCV核心蛋白融合蛋白純化后的SDS-PAGE分析，其中泳道1為純化的8R-多拷貝多表位HCV核心蛋白融合蛋白，泳道3為純化后經過除鹽的8R-多拷貝多表位HCV核心蛋白融合蛋白，泳道4為蛋白質分子量標志，可以看到目的蛋白分子量為35kDal左右，與理論計算值相符。
B16細胞B16細胞是來源于C57小鼠的黑色素瘤細胞，其MHC的型為H-2b。可在小鼠形成原位實體腫瘤。將8R-多拷貝多表位HCV核心抗原融合蛋白轉染B16細胞。這樣的B16細胞表面將表達HCV核心抗原表位。將這種B16細胞注射入接種HCV疫苗的C57小鼠體內，觀察其生長狀況，并與未接種疫苗的小鼠進行對比，可作為一種檢測丙型肝炎病毒疫苗活性的方法。2、實驗動物7周的雄性C57小鼠(購自中國軍事醫學科學院)，疫苗組11只；對照組4只。3、實驗方法接種疫苗在試驗的第1天，14天和21天即接種腫瘤前的第28天，14天和7天，疫苗組分別四肢皮下注射20μg卡介苗熱休克蛋白65和多表位HCV核心抗原融合蛋白重組蛋白疫苗；對照組分別四肢皮下注射同疫苗組同體積生理鹽水。培養B-16細胞采用含10％的滅活胎牛血清的IMDM培養基培養(購自GIBCO公司)B16細胞。在注射之前，在培養基中加入10％條件培養基培養24小時。
條件培養基制備方法1.將C57小鼠脫頸處死后，在75％乙醇中浸泡1-2分鐘。
2.無菌狀態下取小鼠脾臟，置于裝有2ml 10％FBS IMDM的無菌平皿里。
3.用無菌毛玻璃片將脾臟磨碎，用1ml加樣器反復吹打將毛玻璃片上的殘余細胞沖洗至平皿中。
4.將細胞懸液經200目尼龍網濾至10ml玻璃試管內。
5.加入2ml 0.83％NH4Cl，室溫放置10分鐘以破裂紅細胞。
6.1000rpm離心5分鐘，棄上清。
7.用2ml 10％FBS IMDM重懸細胞，將細胞移入一50ml細胞培養瓶中，補加4ml 10％FBS IMDM。
8.加入ConA至終濃度5mg/ml。37℃，5％CO2培養24小時。
9.培養12-24h期間觀察脾細胞的變化，高倍鏡下可觀察到部分細胞變大，變圓，并可見核分裂相。
10.將細胞懸液移至一個無菌10ml管，2000rpm離心5-10分鐘，將上清分裝至1.5ml管中。裝載8R-polyHCV核心抗原多表位蛋白將200ug 8R-polyHCV核心抗原多表位蛋白與10ul Lipotectin混均后加入細胞培養基中孵育4小時。接種腫瘤取7只免疫鼠每只小鼠注射1×105個轉染8R-polyHCV核心多表位的B16細胞；對照組4只，每只小鼠注射1×105個轉染轉染8R-polyHCV核心多表位的B16細胞。注射部位是小鼠右后肢腹側皮下。在接種腫瘤后的第15天，殺鼠取瘤，測量小鼠腫瘤塊大小及重量。4、實驗結果及結論動物腫瘤重量平均值注射轉染8R-polyHCV核心多表位的B16細胞的疫苗組為1.59g，對照組為3.28g，對照組與疫苗組差異明顯(p＜0.01)。圖12所示為疫苗組和對照組小鼠腫瘤形成狀況的對比照片。
由于疫苗組和對照組小鼠接種的腫瘤細胞來源及數量完全相同，疫苗組小鼠腫瘤重量明顯低于對照組，說明疫苗組小鼠接種的腫瘤細胞受到一定程度的特異性殺傷。造成這一現象的原因是疫苗組小鼠體內存在針對HCV核心抗原表位的CTL，能特異性殺傷表達HCV核心抗原表位的靶細胞。結論是此卡介苗熱休克蛋白65和多表位HCV核心抗原融合蛋白重組蛋白疫苗能激活丙型肝炎病毒特異性CTL，這種CTL能以MHC限制的方式殺傷和抑制表達HCV核心抗原表位的靶細胞。
2.棄掉培養液，用0.25％胰酶消化細胞3分鐘，吸棄胰酶，用4ml 10％FBS IMDM重懸細胞。
3.將100-200pmol的8R-多表位HCV核心抗原多聚體蛋白(8R-polyHCV)與5-7ul的Lipofectin混合，室溫放置10分鐘后加入細胞懸液，輕輕混勻，37℃，5％CO2培養3-4小時。
4.用吸管吹吸、重懸細胞，1000rpm離心5分鐘，棄上清。用110ul 10％FBS IMDM重懸細胞，置于同位素標記管中。取10ul稀釋100倍計數，記錄。
5.加入100ul51Cr(0.2mCi)，37℃，5％CO2培養1小時。
6.用含10％FBS的IMDM沖洗細胞四次，每次2ml。
7.用5ml含10％FBS及10％條件培養基的IMDM重懸細胞，均勻鋪于96孔板，每孔加入100ul細胞懸液，含1×104個細胞。
b.效應細胞的制備1.將免疫三次后的C57小鼠脫頸處死，在75％乙醇里浸泡1-2分鐘。
2.在超凈臺中無菌取小鼠脾臟，置于裝有2ml 10％FBS IMDM的無菌平皿里。
3.用無菌毛玻璃片將脾臟磨碎，用1ml加樣器反復吹洗毛玻璃片上的細胞。
4.將細胞懸液經200目尼龍網濾至10ml試管內。
5加入2ml 0.83％氯化氨(NH4Cl)，室溫放置10分鐘。
6. 1000rpm離心5分鐘，棄掉上清。
7.用2ml 10％FBS IMDM重懸細胞，將細胞移入一50ml培養瓶中，補加4ml 10％FBS IMDM。
8.加入10％條件培養基及200ug的疫苗(卡介苗Hsp65-單拷貝多表位HCV核心抗原融合蛋白)。37℃，5％CO2培養三天后，補加10％條件培養基及200ug的疫苗。繼續培養四天。
9.取同一只小鼠的淋巴結共9個，置于一無菌平皿中，加入2ml 10％FBSIMDM，，用無菌毛玻璃片將淋巴結研碎，用1ml加樣器反復吹洗毛玻璃片上的細胞至培養液中。
10.將細胞懸液經200目無菌尼龍網濾至50ml培養瓶中，加入3ml 10％FBSIMDM。
11.加入10％條件培養基及200ug的疫苗(卡介苗Hsp65-單拷貝多表位HCV核心抗原融合蛋白)。37℃，5％CO2培養三天后，補加10％條件培養基及200ug的疫苗。繼續培養四天。
12.將培養了7天的脾細胞及淋巴結細胞取出，計數，調整細胞濃度。按不同效靶比(200∶1，100∶1 50∶1)將效應細胞加入已鋪好靶細胞的96孔板，每孔加100ul，每個效靶比設三復孔。
13.輕輕敲擊96孔板板的四周以使細胞更好的混勻，置于平板離心機200rpm離心1-2分鐘。37℃，5％CO2培養12小時。
14.離心96孔板，3000rpm，5分鐘。每孔吸出100ul上清，測放射性。
特異殺傷率(％)＝實驗孔rpm—自發釋放rpm/最大釋放rpm—自發釋放rpm實驗結果如表1和圖13所示對照組特異殺傷率在三種效靶比中無明顯差別，為0％-1.1％疫苗組特異殺傷率效靶比50∶1為-10％效靶比100∶1為-24％效靶比200∶1為-56％
結論是經卡介苗熱休克蛋白65-多表位HCV核心抗原融合蛋白重組蛋白疫苗免疫的小鼠體內分離的淋巴細胞能特異性地殺傷表達HCV核心抗原表位的B16細胞。說明此卡介苗熱休克蛋白65和多表位HCV核心抗原融合蛋白重組蛋白疫苗能激活丙型肝炎病毒特異性CTL，這種CTL能以MHC限制的方式殺傷表達HCV核心抗原表位的靶細胞。
表1特異性殺傷率(％)效靶比 50∶1效應細胞來源 鼠1 鼠2 鼠3 鼠4 平均值PBS組 脾 -1.1 0.6 1.2 -0.8 -0.025淋巴結 -0.4 0.3 1.6 0.4 0.45疫苗組 脾 8.2 7.8 6.4 7.4 4.45淋巴結 9.3 11.4 8.6 9.7 9.75效靶比 100∶1PBS組 脾 0.5 1.1 -0.2 -0.6 0.2淋巴結 0.8 1.3 0.7 1.2 1疫苗組 脾 18.6 19.4 23.8 23.6 21.35淋巴結 23.3 26.7 25.9 29.2 26.13效靶比 200∶1PBS組 脾 0.6 1.3 -0.1 0.9 0.65淋巴結 -0.2 1.8 0.9 1.7 1.05疫苗組 脾 48.9 51.2 53.4 46.3 49.95淋巴結 59.4 63.8 62.7 57.6 60.85
序列表<110>北京迪威華宇生物技術有限公司<120>預防和治療人丙型肝炎病毒感染的重組疫苗及其用途<130>I020106<160>17<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>16<212>PRT<213>Hepatitis C virus<400>1Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Glu Ile Asp Asp1 5 10 15<210>2<211>18<212>PRT<213>Hepatitis C virus<400>2Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Glu1 5 10 15Asp Ser<210>3<211>22<212>PRT<213>Hepatitis C virus<400>3Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala1 5 10 15Glu Asn Asp Glu Ile Glu20<210>4<211>18<212>PRT<213>Hepatitis C virus<400>4Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Asn1 5 10 15Asp Glu<210>5<211>20<212>PRT<213>Hepatitis C virus<400>5Leu Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Glu1 5 10 15Ile Asp Asn Glu20<210>6<211>1965<212>DNA<213>Artificial<220><221>CDS<222>(1)..(1965)<223><400>6atg gcc aag aca att gcg tac gac gaa gag gcc cgt cgc ggc ctc gag48Met Ala Lys Thr Ile Ala Tyr Asp Glu Glu Ala Arg Arg Gly Leu Glu1 5 10 15cgg ggc ttg aac gcc ctc gcc 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權利要求
1.一種重組蛋白疫苗，它是由卡介苗熱休克蛋白65和多表位丙型肝炎病毒核心抗原融合而形成的融合蛋白。
2.按照權利要求1所述的重組蛋白疫苗，其中所述的多表位丙型肝炎病毒核心抗原由如SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ IDNO4和SEQ ID NO5所示的序列的肽段相互連接形成。
3. 按照權利要求1所述的重組蛋白疫苗，其中所述的多表位丙型肝炎病毒核心抗原可以是1-5個拷貝。
4.按照權利要求1所述的重組蛋白疫苗，其具有選自如下的任一氨基酸序列1)SEQ ID No7所示的氨基酸序列；和2)由在嚴緊的雜交條件下與編碼1)的氨基酸序列的核苷酸序列雜交的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。
5.按照權利要求1所述的重組蛋白疫苗，其中所述的單拷貝多表位丙型肝炎病毒核心抗原具有SEQ ID NO9所示的氨基酸序列。
6.按照權利要求1所述的重組蛋白疫苗，其中卡介苗熱休克蛋白65位于該融合蛋白的氨基端，多表位丙型肝炎病毒核心抗原位于該融合蛋白的羧基端。
7.按照權利要求1所述的重組蛋白疫苗，它具有SEQ ID No7所示的氨基酸序列。
8.編碼權利要求1至6中任意一項所述的重組蛋白疫苗的核苷酸序列。
9.按照權利要求8所述的核苷酸序列，其具有選自如下的任一序列1)SEQ ID NO6所示的核苷酸序列；和2)由在嚴緊的雜交條件下與1)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
10.按照權利要求7所述的基因，它具有SEQ ID NO6所示的核苷酸序列。
11.含有權利要求8-10中任一項的核苷酸序列的表達載體。
12.含有權利要求11的表達載體的宿主細胞。
13.按照權利要求12所述的宿主細胞，其為原核細胞，真核細胞或哺乳動物細胞。
14.一種制備權利要求1-6中任一項的重組蛋白疫苗的方法，包括培養如權利要求12或13所述的宿主細胞。
15.權利要求1-6中任一項所述的重組蛋白在制備用于預防和治療丙型肝炎病毒感染的疫苗制品中的用途。
16.按照權利要求15所述的用途，其中所述的丙型肝炎病毒感染是丙型肝炎。
17.一種用于預防丙型肝炎病毒感染的疫苗制品，含有權利要求1-6中任一項所述的重組蛋白和載體或賦形劑。
18.按照權利要求17所述的疫苗制品，其中所述的丙型肝炎病毒感染是丙型肝炎。
19.一種用于研究丙型肝炎病毒疫苗的免疫效果的細胞模型，包括B-16細胞裝載的多表位丙型肝炎病毒核心抗原。
20.一種用于研究丙型肝炎病毒疫苗的免疫效果的方法，包括使用如權利要求19所述的細胞模型以研究丙型肝炎病毒疫苗是否激發特異性CTL并產生保護作用。
全文摘要
本發明提供了一種重組蛋白疫苗，它是由卡介苗熱休克蛋白65和多表位丙型肝炎病毒核心抗原融合而形成的融合蛋白；這種蛋白的氨基酸序列和編碼這種重組蛋白疫苗的核苷酸序列；含有該核苷酸序列的表達載體；含有該表達載體的宿主細胞；該重組蛋白疫苗的制備方法；含有該重組蛋白的預防和治療丙型肝炎病毒感染的疫苗制品。本發明還提供了一種用于檢測丙型肝炎病毒疫苗誘導丙型肝炎特異性殺傷性T淋巴細胞活性的方法及其細胞模型。
文檔編號C07K14/085GK1462636SQ0212211
公開日2003年12月24日 申請日期2002年5月30日 優先權日2002年5月30日
發明者王麗穎, 孫蒙, 于永利 申請人:北京迪威華宇生物技術有限公司