專利名稱：一種畜禽用融合蛋白的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種融合蛋白，是一種用畜禽的細胞因子與畜禽的血清白蛋白 人工結合的融合蛋白，可用于畜禽相關疾病的防治，屬生物工程制藥領域。
背景技術：
細胞因子(cytokine, CK)是由細胞合成、分泌的具有生物活性的低分子量 蛋白質或多肽的統稱，通常由淋巴細胞、單核巨噬細胞、成纖維細胞、內皮細 胞等免疫細胞或非免疫細胞細胞產生。按其功能及與免疫學的關系可分為(1) 具有抗病毒活性的細胞因子，如干擾素(interferon, IFN); (2)具有免疫調節活 性的細胞因子，包括白細胞介素(interleukin， IL)類的IL2、 IL4、 IL5、 IL7、 IL9、 IL10禾n IL12，以及卩型轉化生長因子(transforming growth factor卩， TGFP); (3)具有炎癥介導活性的細胞因子，包括以腫瘤壞死因子
(tumor necrosis factor, TNF)及IL1、 IL6禾卩IL8為代表的結構相似的小分子 趨化因子；(4)具有造血生長活性的細胞因子，包括IL3、 ILll、集落刺激因子
(colony-stimulating factor, CSF)、促紅細胞生成素(erythropoietin, EPO)、干 細胞因子(stem cell factor, SCF)和白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)等。
作為藥物，細胞因子在治療腫瘤、感染、造血障礙等方面有良好的療效。 但是，由于細胞因子分子量較小，易被腎小球濾過清除，因而臨床應用時，血 漿半衰期較短，為維持有效血藥濃度， 一般需要大劑量頻繁用藥，如每周2_3 次，這種給藥方式不僅增加了治療費用和勞動強度，而且易對畜禽的生長產生 負面影響。
白蛋白又稱清蛋白，是一類呈球狀、能溶于水的蛋白質，主要存在于哺乳 動物、細菌、霉菌和植物中，卵白蛋白、乳白蛋白、豆白蛋白和血清白蛋白等 都屬此類。血清白蛋白是血清中含量最豐富的蛋白質，占血清總蛋白量的50% 以上，半衰期約為15-19天，其生理功能是維持和調節血液的滲透壓，并作為 載體參與運送脂肪酸和其他多種內源因子，因為這一特性，血清白蛋白也可用 作外源藥物的載體。
血清白蛋白不含糖，在飽和硫酸銨溶液中沉淀析出，在細胞中以含有信號 肽和前肽的形式合成，信號肽和前肽在轉運和分泌過程被切除。在正常情況下，血清白蛋白由于分子量較大，不易透過腎小球。利用這一特性，可將血清白蛋 白與其他需要延長作用時間的藥物進行偶連，在保持藥物療效和生物學特性的 同時，降低血漿清除率，維持有效血藥濃度，延長半衰期，減少給藥次數。 本發明就是針對細胞因子血漿半衰期較短的缺陷來進行設計和實施的。 本發明的目的利用生物技術對細胞因子和血清白蛋白進行融合，得到的 融合蛋白既能保持細胞因子的生物學活性，又能延長細胞因子的血漿半衰期。
本發明的積極效果對細胞因子進行了二次開發，并且采用畢赤酵母進行 分泌表達，純化較為簡單，為畜禽相關疾病的防治提供了新的手段。

發明內容
本發明的目的是針對目前細胞因子血漿半衰期較短的缺陷，設計一種既 有生物學活性，又能降低血漿清除率，半衰期較長的融合蛋白。 本發明是這樣實現的-
一種以細胞因子為主體，偶連了血清白蛋白的融合蛋白。
本發明的融合蛋白，包括與血清白蛋白至少80%序列同源的第一區，和與
細胞因子至少80。/。序列同源的第二區，必要時，還有起輔助作用的第三區。
所述的序列同源，不僅包括了與該區的氨基酸殘基序列相同，還包括了該 區的功能等同物。所謂功能等同物，是在不改變該區生物學特性的前提下，對 個別氨基酸殘基的取代、缺失或加入得到的多肽。
本發明的融合蛋白中，第一區可以位于融合蛋白的N末端，也可以位于融
合蛋白的C末端；相應的，第二區可以位于融合蛋白的C末端，也可以位于融
合蛋白的N末端。
本發明的融合蛋白中，為了保留細胞因子的生物學活性，必須給第二區保 留足夠的作用空間。因此，在第一區與第二區直接偶連導致第二區的作用空間 不足時，可以在第一區和第二區之間添加第三區，如連接肽、其他細胞因子等， 使融合蛋白兩部分間有較大的間隔。
本發明的細胞因子可以是任何一種畜禽細胞因子或與之同效的功能等同
物。包括a)具有抗病毒活性的細胞因子，如干擾素(interferon, IFN); (2)具 有免疫調節活性的細胞因子，包括白細胞介素(interleukin， IL)類的IL2、 IL4、 IL5 、 IL7 、 IL9 、 IL10和IL12 ，以及(3型轉化生長因子 (transforming growth factor (3， TGF卩)；(3)具有炎癥介導活性的細胞因子，包括以腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)及IL1、 IL6和IL8為代表的 結構相似的小分子趨化因子；(4)具有造血生長活性的細胞因子，包括IL3、 ILll、 集落刺激因子(colony-stimulating factor, CSF)、促紅細胞生成素(erythropoietin, EPO )、干細胞因子(stem cell factor ， SCF )和白血病抑制因子 (leukemia inhibitory factor, LIF)等。
本發明的融合蛋白的特征在于保留了細胞因子的生物學活性，因此，它既 可以作為相應受體的激動劑，也可以作為相應受體的抑制劑。
本發明的另一個目的是提供編碼本發明白蛋白融合蛋白的氨基酸序列及與 細胞因子連接的化學方法。本發明的融合蛋白可以是畜禽白蛋白與畜禽細胞因 子通過基因工程手段得到，也可以是結合化學手段如體外直接偶聯或借助于連 接臂偶聯等方法得到。
本發明的又一個目的是提供攜帶編碼本發明融合蛋白的DNA序列的重組表 達載體。
本發明的重組表達載體包括植物載體、原核質粒、真核質粒、雙穿梭質粒 及病毒載體等。
本發明的再一個目的是提供表達本發明融合蛋白編碼基因的宿主。
本發明的宿主可以是被重組表達載體或重組表達載體的一部分轉化，含有 本發明融合蛋白編碼基因的細菌、酵母、動物細胞或植物細胞；其中優選的是 原核表達，更優選的是酵母表達。
本發明將畜禽白蛋白分子，或其至少85%序列同源的類似物與細胞因子， 或其至少85%序列同源的類似物融合，所形成的融合蛋白既保留了與細胞因子 受體結合的活性，同時與細胞因子相比，其血漿半衰期又得到了延長。本發明 的融合蛋白既可以保留激活細胞因子受體的活性，作為該受體的激動劑，制造 成細胞因子類藥物，也可以僅保留與該受體結合的活性，作為該受體的抑制劑， 制造成用于治療某些與細胞因子或其受體過量表達有關疾病的藥物。
畜禽血清白蛋白天然存在多態性，本發明融合蛋白中的畜禽血清白蛋白部 分也包括所有這些多態型。
編碼畜禽血清白蛋白的多聚核苷酸和編碼細胞因子的多聚核苷酸可以用本 領域周知的方法，如PCR、 RT-PCR方法、人工合成的方法和構建篩選cDNA文 庫的方法等獲得，用作PCR模板和用于構建cDNA文庫的mRNA或cDNA可以來源于任何含有相應mRNA或cDNA的組織、細胞、及文庫等，如從肝胎cDNA 文庫獲得。也可以用人工合成的方法獲得，人工合成時可選用宿主偏愛的密碼 子，這樣往往可以提高產物的表達。
編碼細胞因子(包括干擾素、白細胞介素、(3型轉化生長因子、腫瘤壞死因 子、小分子趨化因子、集落刺激因子、促紅細胞生成素、干細胞因子和白血病 抑制因子等。)的多聚核苷酸可以用PCR的方法從畜禽外周血白細胞的RNA制 品中獲得，或用人工合成的方法獲得。若需要可用本領域公知的方法對多聚核 苷酸進行突變、缺失、插入、和與其它多聚核苷酸連接等。編碼白蛋白和編碼 細胞因子的多聚核苷酸的融合，在保持各自閱讀框架不變的前提下，可以用本 領域周知的各種方法，如通過PCR的方法，在編碼序列的兩側引入限制性內切 酶識別位點，從而獲得編碼融合蛋白的基因。如果需要可在本發明的編碼融合 蛋白基因的兩側引入多聚核苷酸，引入的多聚核苷酸可有限制性內切酶識別位 點。可用本領域公知的方法將含編碼融合蛋白序列的核酸克隆到各種表達載體 中去。所用標準的分子克隆過程見J.薩姆布魯克等(J.薩姆布魯克等，《分子克隆 實驗指南》第二版，科學出版社，1995.)的敘述。
許多表達載體和其對應的宿主可以從公司購得。表達融合蛋白的宿主可以 是酵母、哺乳動物細胞、細菌、動物、植物等。融合蛋白或多肽可以存在于宿 主細胞內，也可以是從宿主中分泌出來，優選的，是從宿主中分泌出來。分泌 所用的信號肽，優選的是天然的血清白蛋白的信號肽，或酵母信號肽，或這兩 種信號肽的類似物。更優選的用天然的血清白蛋白的信號肽，用該信號肽時融 合蛋白表達水平較高。融合蛋白或多肽也可以不用信號肽，而在酵母中以胞內 口丁溶形式表達。編碼融合蛋白的核酸，可以插入至宿主染色體，或以游離質粒 形式存在。
轉化所需核酸至宿主細胞中去可用通常的方法，如電穿孔，制備感受態 的原生質球等。成功轉化的細胞，即含有本發明DNA構建體的細胞，可通過人 們熟知的技術加以鑒定，如細胞經收集并裂解，提取DNA,然后PCR方法鑒定。 或者，細胞培養上清中或細胞破碎液中的蛋白可用抗HSA或抗IFN的抗體檢測。 可以通過培養含有本發明DNA構建體的宿主，如重組酵母、重組哺乳動物細胞、 重組細菌、轉基因動植物等，生產本發明的融合蛋白。具體的培養方法，可以 用搖瓶或生物反應器等，生產時優選的為生物反應器。培養基應能提供菌體(或細胞)生長和產物表達所需的物質，應包含氮源、碳源、pH緩沖成分等，培養 基配方一般應根據不同培養對象，通過試驗獲得。培養可分兩個階段，第一階 段主要用于菌體(或細胞)的生長，第二階段主要用于合成產物。
可以用各種蛋白分離的方法自含有本發明DNA構建體的細胞培養物中分 離、純化融合蛋白。如鹽析、沉淀、超濾、液相層析等技術及這些技術的組合。 其中液相層析可以用凝膠排阻、親和、離子交換、疏水、反相等層析技術。
本發明中的融合蛋白可以有各種衍生物，這些衍生物可以是但不局限于其 不同形式的鹽、修飾產物等。如在多肽的氨基、羧基、羥基、琉基上再進行修 飾。所用修飾劑可以但不局限于聚乙二醇，葡聚糖等。
本發明中的融合蛋白及其衍生物可單獨使用，優選的為與一個或多個藥學 上可接受的載體一起組成藥物制劑。藥物載體一般應與融合蛋白相容且不能對 受體自身有害，典型的載體為水、鹽水、糖類、醇類或氨基酸，它們需無菌且 無致熱原。藥物制劑可以單位劑量的形式存在，并可通過任何本領域已知的方 法制備。這些方法包括將融合蛋白與具有一種或多種輔助成分混合的步驟。優 選的藥物制劑包括含水的液體制劑和含水量低于10%或不含水的凍干制劑。這 些制劑可以含有緩沖劑，鹽類，小分子糖類等，使藥物的滲透性與受體血液中 .的滲透性相等或相似。藥物制劑可存在于單元劑量或多劑量的容器中，如密封 的安瓶，西林瓶或小管中。凍干制劑是將液體制劑冷凍干燥制備的，使用前加 入無菌、無熱原的液態載體，如注射用水。
本發明中的融合蛋白及其衍生物或其藥物組合物可以通過任何已知的方 法，包括注射(如皮下或肌肉)、靜脈輸注、透皮、吸入、口服等方法給藥。優 選的方法為靜脈輸注或注射給藥。治療包括在一段時間內使用單一劑量或復合
使用劑量可通過融合蛋白相對于細胞因子的效價計算出，同時考慮融合蛋 白相對于天然工細胞因子延長的半衰期。按照摩爾數相當即意味著使用較大重 .量的融合蛋白，但使用頻率可降低。
權利要求
1、一種畜禽血清白蛋白與細胞因子的融合蛋白及其生產使用方法。
2、 根據權利要求1所述的血清白蛋白與細胞因子的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白包括與畜禽血清白蛋白至少80%序列同源的第一區和與細胞 因子至少80%序列同源的第二區。
3、 根據權利要求1所述的血清白蛋白與細胞因子的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白包括與畜禽血清白蛋白氨基酸殘基序列相同的第一區和與細 胞因子氨基酸殘基序列相同的第二區，或上述二區的功能等同物。
4、 根據權利要求3所述的血清白蛋白與細胞因子的融合蛋白，其特征在于所述功能等同物是在不改變所述融合蛋白特性的前提下，對融合蛋白個別 氨基酸殘基的取代、缺失或加入得到的多肽。
5、 根據權利要求1所述的血清白蛋白與細胞因子的融合蛋白，其特征在于所述與細胞因子同源的第二區可位于融合蛋白的N末端或C末端，也可以 同時位于融合蛋白的N末端或C末端。
6、 根據權利要求1所述的血清白蛋白與干擾素的融合蛋白，其特征在于所 述的細胞因子可以是任何一種細胞因子或多種細胞因子的串聯物。
7、 根據權利要求1-6中任何一項所述的血清白蛋白與細胞因子的融合蛋白，其特征在于所述與畜禽血清白蛋白同源的第一區與細胞因子同源的第二區之間可設有連接肽。
8、 根據權利要求1中所述的血清白蛋白與細胞因子的融合蛋白的生產方式，其特征在于該融合蛋白可以是基因工程融合，也可以是采用化學方法將 血清白蛋白與細胞因子偶聯融合。
9、 根據權利要求1中所述的血清白蛋白與細胞因子的融合蛋白的使用方式， 其特征在于通過注射、噴射、口服、滴鼻、滲透、吸收、物理或化學介 導的方法使上述融合蛋白進入機體，或是被其他物質包裹或混合后進入機 體的。
全文摘要
本發明涉及一種利用畜禽血清白蛋白作為融合蛋白及其生產方法和使用方法。屬獸用生物制品領域中細胞因子的制備方法。通過基因工程或化學偶聯獲得集血清白蛋白與細胞因子的特性為一體的血清白蛋白與細胞因子融合蛋白。延長細胞因子血漿半衰期。制造成用于治療某些與細胞因子有關疾病的藥物。
文檔編號C07K19/00GK101445560SQ20081023159
公開日2009年6月3日 申請日期2008年12月31日 優先權日2008年12月31日
發明者李智濤, 李玉林, 王云龍, 陳小科, 潔 韓 申請人:河南省生物工程技術研究中心