一種新型肝片吸蟲多表位疫苗的設計、制備方法和應用
【專利摘要】本發明提供一種新型肝片吸蟲多表位疫苗，其活性成分是一條多肽，主要由肝片吸蟲鞘脂激活蛋白樣蛋白?2 Th和B細胞抗原表位的多拷貝體以及黏膜免疫佐劑霍亂毒素B亞基構成。本發明主要通過基因合成技術合成一個人工基因，其包含有鞘脂激活蛋白樣蛋白?2的Th和B細胞抗原表位多拷貝體的基因序列，然后將該人工基因與霍亂毒素B亞基的基因序列相偶聯，形成一個融合基因。利用大腸桿菌原核表達系統表達該融合基因，經蛋白純化后，獲得肝片吸蟲多表位疫苗。該肝片吸蟲多表位疫苗能夠誘發機體產生針對鞘脂激活蛋白T細胞免疫應答和高滴度特異性抗體體液免疫應答，可用于預防和治療肝片吸蟲感染相關性疾病。
【專利說明】
一種新型肝片吸蟲多表位疫苗的設計、制備方法和應用
技術領域
[0001] 本發明屬于畜牧醫藥領域，具體涉及到一種肝片吸蟲多表位疫苗的設計、制備方 法和應用。
【背景技術】
[0002] 肝片吸蟲(AasciWa Aepaiica)隸屬于復殖目（Digenea)片形科(Fasciolidae)的片形 屬(Fasciola)，主要寄生于哺乳動物尤其是反芻類動物，其發病范圍廣、致死率高是制約當 今畜牧業發展的重要傳染疾病之一。牛羊的肝臟膽管中如被肝片吸蟲寄生，肝組織被破壞 引起肝炎及膽管變硬，同時蟲體在膽管內生長發育并產卵，造成膽管的堵塞，影響消化和食 欲;蟲體分泌的毒素滲入血液中，溶解紅細胞，使家畜發生貧血、消瘦及浮腫等中毒現象;蟲 體刺激使膽管壁增生，可造成膽管阻塞、肝實質變性、黃痘等。肝片吸蟲是我國危害最重，覆 蓋面最廣的牲畜寄生蟲病之一。每年均有爆發性流行，給我國畜牧業造成巨大的損失。國內 外均有報道肝片吸蟲病出現人畜共患，特別是在貧困的農村地區流行。有估計表明在60多 個國家大約有240萬人感染肝片吸蟲，并且有超過1.8億人住在肝片吸蟲感染區，嚴重危害 人類健康。
[0003] 研制肝片吸蟲疫苗是控制肝片吸蟲疾病的一種切實有效的方法。治療性肝片吸蟲 疫苗具有廣闊的應用前景，有望代替傳統的化學藥物療法，成為預防及治療肝片吸蟲的新 方法。目前治療肝片吸蟲感染主要是化學藥物法，大部分使用廣譜驅蟲藥物，其中三氯苯達 唑（TCBZ)是治療肝片吸蟲感染有效的藥物，但是有研究表明肝片吸蟲已經出現了耐藥性， 所以TCBZ不是治療肝片吸蟲的一種長期有效的藥物。采用藥物法存在諸多弊端：（1)廣譜驅 蟲藥的使用導致肝片吸蟲耐藥蟲體日益增多，藥物療效每況日下。（2)治療藥物在動物體內 是否殘留，是否通過食用肉進一步危害人類健康還不得而知。（3)藥物治療難以避免反復治 療。（4)藥物不能達到完全驅蟲的效果。因此，傳統化學藥物治療不宜在肝片吸蟲感染動物 中大規模推廣使用，研發肝片吸蟲疫苗是一種預防和治療肝片吸蟲感染、更實際和更有前 景的方法。
[0004] 寄生蟲疫苗分為弱毒疫苗、亞單位疫苗、核酸疫苗、表位疫苗。目前使用的寄生蟲 疫苗一般是弱毒疫苗，其保護機制主要是模擬自然感染，刺激機體產生免疫應答主要采取 以下幾種途徑篩選：（1)通過特殊動物傳代或在體外培養使毒力降低，如牛巴貝斯致弱苗就 是通過在切除脾臟牛體內反復傳代獲得的。（2)篩選缺少某一生活階段的蟲株，如剛地弓形 蟲S48株就不能形成包囊。（3)篩選生活周期縮短的蟲株，如早熟艾美爾球蟲苗。弱毒疫苗應 用不廣泛的幾個因素是：（1)安全性問題。目前的寄生蟲疫苗主要為活苗，雖然可以產生一 定的免疫保護，但畢竟是活的蟲體，在特定的情況下，仍有致病的可能。（2)免疫保護效果。 有些寄生蟲可以感染多種動物，其疫苗往往對某種動物保護效果較好，對另種動物效果較 差，或者對不同年齡的動物保護效果不一致等缺點。（3)經濟效益。盡管有些疫苗免疫保護 性好，但生產成本高、免疫方法復雜、與抗寄生蟲藥的廣譜性相比具有較窄的保護范圍均限 制了疫苗在生產中的應用。正是由于上述問題的存在，在一定程度上制約了寄生蟲疫苗的 使用，同時，促使人們去研究和開發新的疫苗。
[0005] DNA疫苗是近幾年發展起來的一種新型疫苗。因其操作簡便，既具有重組亞單位 疫苗的安全性，又具有減毒活疫苗高效、持續誘導全方位免疫應答的優點，該疫苗問世以 來，引起了全世界的研究熱潮。DNA疫苗研究已展開了積極的探索。在日本分體吸蟲、絳蟲、 瘧原蟲、利什曼原蟲、隱孢子蟲、弓形蟲、錐蟲、球蟲等疾病中，DNA疫苗研究中取得了較好的 結果，其中瘧疾DNA疫苗已獲準生產。
[0006] 表位疫苗基于抗原表位而制備，具有獨特的疫苗設計思路，是研制預防和治療感 染性疾病、惡性腫瘤和自身免疫性疾病等疫苗的新方向。表位疫苗與全菌疫苗、基因工程亞 單位疫苗和DNA疫苗相比，具有以下優點：（1)表位疫苗一般穩定、無毒，具有更高的安全性。 (2)抗原表位肽的分子結構小而簡單，不會引起免疫抑制或者自身免疫性疾病。（3)表位疫 苗可對抗原表位進行精確定位，具有更高的免疫針對性和特異性。（4)表位疫苗具有十分靈 活的設計性，可組合不同Th、B細胞抗原表位，制成針對多種病原體的疫苗。（5)表位疫苗選 用高保守性的抗原表位肽，可有效防止病原體快速基因突變所形成的免疫逃避機制。
[0007] 目前，研究人員已經對肝片吸蟲抗原蛋白進行了大量研究，并獲得了多個肝片吸 蟲抗原蛋白，如脂肪酸結合蛋白（FABP)、谷胱甘肽硫轉移酶(GST)、組織蛋白酶(CatL)類蛋 白酶和血紅蛋白（Hb)均能誘導宿主產生部分保護作用，可作為抗原用于反芻動物中，但是 其效果都不是很理想。鞘脂激活蛋白樣蛋白（SAP)是一大類蛋白家族，廣泛存在于從原生動 物直至哺乳動物的生物體內，并發揮著各種生物學作用。有實驗表明，SAPs參與裂解宿主細 胞用于進一步酶處理為寄生蟲提供營養。近年來發現該家族中SAP-2具有很強的細胞溶解 酶活性，結構類似于NK細胞溶解酶，殺傷動物紅細胞和外周單核細胞。最近發現FhSAP-2是 一個很好的抗原，它會刺激特定的細胞和體液免疫反應。小鼠接種FhSAP-2 DNA疫苗產生 Thl/Th2混合反應，因此認為FhSAP-2含有T細胞抗原，其中一些可能引起免疫保護反應。
[0008] 目前治療肝片吸蟲病的方法，主要采用廣譜驅蟲法，存在諸多弊端:如藥物在動物 體內殘留、肝片吸蟲耐藥蟲體增多等。因此，研制肝片吸蟲疫苗是控制肝片吸蟲感染的一種 切實有效的方法。FhSAP-2是公認的疫苗的理想抗原;FhSAP-2具有很強的細胞溶解酶活性， 在其寄生過程中起重要作用；在肝片吸蟲疫苗免疫保護性機制中，抗體體液免疫應答起重 要作用，而Th細胞免疫應答起關鍵作用。本發明合理選擇FhSAP-2的Th和B細胞抗原表位，激 發有效抑制FhSAP-2的活性和激發特異性細胞免疫應答，為研制針對FhSAP-2的新型治療性 多表位疫苗奠定實驗基礎。

【發明內容】

[0009] 本發明的第一個方面是提供了一種新型肝片吸蟲多表位疫苗 本發明的第二個方面是提供了該肝片吸蟲多表位疫苗的制備方法。
[0010] 本發明的第三個方面是公布了該肝片吸蟲多表位疫苗的用途。
[0011] 本發明的第一個方面是提供了一種肝片吸蟲多表位疫苗CTB-SAPE。該肝片吸蟲多 表位疫苗主要由來自鞘脂激活蛋白樣蛋白FhSAP-2的B細胞表位（分別是FhSAP 21-30， FhSAP76-85)和T細胞抗原表位(分別是FhSAP7i-8〇，FhSAP81-9〇)和霍亂毒素 B亞基構成，具有以 下優點：（1)肝片吸蟲多表位疫苗CTB-SAPE含有來自鞘脂激活蛋白樣蛋白FhSAP-2的B細胞 表位和T細胞抗原表位，能夠激發針對FhSAP-2表位特異性抗體。（2)本發明的肝片吸蟲多表 位疫苗CTB-SAPE可激發有效抑制FhSAP-2活性的表位特異性抗體。（3)選擇"FhSAP-2的B細 胞表位和T細胞抗原表位"來代替FhSAP-2大分子抗原研制表位疫苗，可有效避免FhSAP-2的 生物學毒性和一些免疫交叉性病理性傷害。
[0012] 本發明的第二個方面是提供了肝片吸蟲多表位疫苗CTB-SAPE的制備方法，其技術 路線簡述如下： (1)肝片吸蟲多表位疫苗CTB-SAPE抗原分子的結構設計 通過生物信息學軟件對霍亂毒素 B亞基(CTB)和肝片吸蟲鞘脂激活蛋白樣蛋白FhSAP-2 的B細胞表位和T細胞抗原表位的連接順序和間隔序列，加以分析和確定，設計一個具有科 學合理結構的肝片吸蟲多表位疫苗CTB-SAPE。
[0013] (2 )重組表達質粒pETCTB-SAPE (含有融合基因 CTB-SAPE )的構建 通過基因合成技術合成一個SAPE的核苷酸序列，將其插入含有霍亂毒素 B亞基(CTB)基 因的重組表達載體pETC中，構建重組表達載體pETCTB-SAPE。
[0014] (3)融合蛋白CTB- SAPE的原核表達及純化 將重組表達載體CTB-SAPE轉化進大腸桿菌BL21(DE3)中，構建重組基因工程菌株BL21 (DE3)/pETCTB-SAPE。利用IPTG誘導表達，并通過Ni-NTP鎳離子親和層析能夠獲得電泳純度 的融合蛋白CTB-SAPE，即為肝片吸蟲多表位疫苗。
[0015]本發明的第三個方面是提供了肝片吸蟲多表位疫苗CTB-SAPE的用途。肝片吸蟲多 表位疫苗CTB-SAPE可用于預防和治療肝片吸蟲感染相關性疾病。
【附圖說明】
[0016] 圖1:新型肝片吸蟲多表位疫苗的分子結構設計特點。
[0017] 圖2:重組表達載體pETCTB-SAPE的雙酶切鑒定。
[0018] 泳道 1:DNA Marker 2000bp;泳道2:DNA Marker lkd;泳道3:pETCTB- SAPE /Κρη I /Xho I;泳道4:pETCTB- SAPE /Nco I /Xho I 圖3:重組表達載體pETCTB- SAPE質粒圖譜。
[0019] Nco I和Xho I之間為插入的融合基因 CTB-SAPE 圖4:肝片吸蟲多表位肽融合蛋白CTB-SAPE的原核表達。
[0020] 泳道1:蛋白質Marker;泳道2: CTB-SAPE包涵體蛋白；泳道3: CTB-SAPE可溶蛋白。 [0021 ]圖5:肝片吸蟲多表位肽融合蛋白CTB-SAPE的Ni-NTA親和層析純化。
[0022] 泳道1:蛋白質Marker;泳道2: CTB-SAPE包涵體蛋白；泳道3:純化后的CTB-SAPE蛋 白樣品。
[0023]圖6:肝片吸蟲多表位疫苗CTB-SAPE誘發抗鞘脂激活蛋白樣蛋白2(FhSAP-2)IgG抗 體的檢測。
[0024]肝片吸蟲多表位疫苗CTB-SAPE都能誘發產生一定滴度抗鞘脂激活蛋白樣蛋白2 (FhSAP-2)抗體。
[0025] 圖7:肝片吸蟲多表位疫苗CTB-SAPE誘發抗肝片吸蟲總蛋白IgG抗體的檢測。
[0026] 肝片吸蟲多表位疫苗CTB-SAPE都能誘發產生一定滴度抗肝片吸蟲總蛋白的抗體。 [0027]圖8:肝片吸蟲多表位疫苗CTB-SAPE誘發FhSAP-2 21-3Q表位特異性抗體的檢測。
[0028] 肝片吸蟲多表位疫苗CTB-SAPE能夠產生較高滴度的FhSAP-221-3Q表位特異性抗體。 [0029]圖9:肝片吸蟲多表位疫苗CTB-SAPE誘發FhSAP-276-85表位特異性抗體的檢測。 [0030] 肝片吸蟲多表位疫苗CTB-SAPE能夠產生較高滴度的FhSAP-276-85表位特異性抗體。 [0031]圖10:肝片吸蟲多表位疫苗CTB-SAPE致敏小鼠脾臟淋巴細胞對抗原刺激的增殖反 應。
[0032]圖11:肝片吸蟲多表位疫苗CTB-SAPE與神經節苷脂GM1的結合活性檢測。
【具體實施方式】 [0033] 材料 1. IPTG溶液:稱取1.2g IPTG置于50ml離心管中，加入40ml無菌水，充分混勻溶解后， 定容至50ml。用0.22μπι濾器過濾除菌，小份分裝，-20°C保存。
[0034] 2.卡那青霉素(Kana)|C液（100 mg/mL):稱取100mg卡那青霉素(Kana)溶于lmL無 菌水，制得濃度為100mg/mL的貯存液，通過0.22μπι細菌濾器過濾除菌，溶液分裝保存于-20 °(：冰箱中。
[0035] 3.培養基：（1)LB液體培養基:稱取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和5g NaCl，加蒸 餾水至l〇〇〇ml，調整pH至7.4，高壓蒸氣滅菌。（2)LB固體培養基：1.5g瓊脂粉/100ml LB培養 液，高壓滅菌后，傾倒平板。
[0036] 4. DNA電泳緩沖液（50 X TAE):稱取242g Tris、37.2g Na2EDTA · 2H20和57.1ml 冰乙酸，加水至1 〇〇〇ml，使用時稀釋50倍。
[0037] 5. SDS-PAGE電泳緩沖液(5X):稱取Tris粉末 15.1g、甘氨酸 94g、SDS 5.0g;加入 約800ml的去離子水，攪拌溶解;加去離子水定容至1L，室溫保存;注意：加水時應讓水延著 壁緩緩流下，以避免由于SDS的原因產生很多泡沫。
[0038] 6.考馬斯亮藍蛋白染色試劑：（1)考馬斯亮藍G-250染液(蛋白質定量用）:考馬斯 亮藍G-250 100mg溶解在50ml 95%乙醇中，然后加入86%磷酸100ml，用蒸餾水稀釋至 1000ml。（2)脫色液:250ml乙醇、80ml冰醋酸用蒸餾水稀釋至1000ml。
[0039] 8.實驗動物：BALB/c小鼠：為SPF級，雄性，8~10周齡，購自北京維通利華實驗 動物技術有限公司，許可證號:SCXK(京)2012-0001。
[0040] 9. ELISA試劑：（1)包被液：1.6g Na2C03,2.9g NaHC03,0.2g NaN3,加雙蒸水至 1L， 調pH值至9.6。（2)洗滌液：分別稱取0.2g KH2P〇4,2.9g Na2HP〇4.12H20,8.0g NaCl，0.2g KC1，0.5ml Tween-20,加入ddH20定容至 1000 ml(PBST)。（3)封閉液:稱取3.0g BSA溶解于 l〇〇ml洗滌緩沖液中，過濾除菌后4°C保存。（4)底物液:可溶性單組份TMB底物溶液。（5)終 止液:量取蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸21.7ml (1M H2S〇4)。
[0041 ] 10.淋巴細胞增殖實驗主要試劑（1)小鼠脾臟淋巴細胞分離液(達科為生物技術 有限公司）（2)RPMI-1640完全培養液:在RPMI-1640基礎培養液加入10%胎牛血清、100U/ml 青霉素、100μg/ml鏈霉素。（3)RPMI-1640不完全培養液:稱取10.4g RPMI-1640干粉、2.4g HEPES、0.75gNaHC03，加去離子水至1000ml，pH7.4，超濾除菌，分裝。
[0042] 實例1:肝片吸蟲多表位疫苗CTB-SAPE的分子結構設計 根據"機體對肝片吸蟲的免疫保護性機制"和"鞘脂激活蛋白樣蛋白抗原表位的免疫學 性質"，選擇鞘脂激活蛋白樣蛋白Th和B細胞表位FhSAP21-3Q、FhSAP76-85、FhSAP7i-8〇和 FhSAP81-9Q用于新型肝片吸蟲多表位疫苗的構建。在新型肝片吸蟲多表位疫苗的設計中，本 課題組將Th細胞表位放在B細胞表位的前端，有助于B細胞表位的有效遞呈，再經過生物信 息學DNAstar和RANKPEP軟件的分析和評價，抗原表位順序確定為?1^4?71-8()-?1134? 81-90-FhSAP21-30- FhSAP81-9〇;選擇KK作為相鄰Th抗原表位的間隔序列，選擇GS作為相鄰財允原表 位的間隔序列；將尿素酶抗原表位FhSAP 21-3Q、FhSAP76-85、FhSAP7i-so和FhSAP81-9〇分別拷貝兩 次;選擇霍亂毒素 B亞基(CTB)作為分子內免疫佐劑，融合在FhSAP多表位肽(SAPE)的N端，增 強FhSAP多表位肽(SAPE)的免疫原性。
[0043]結果:肝片吸蟲多表位疫苗CTB- SAPE的分子結構設計特點和思路如（圖1)所示。 [0044] 實例2:重組表達載體pETCTB- SAPE(含有融合基因 CTB- SAPE)的構建 (1)多表位肽SAPE核苷酸序列的基因合成 將前期設計的多表位肽SAPE的氨基酸序列，按照大腸桿菌密碼子偏愛性原則轉化成相 應的核苷酸序列，委托南京金斯瑞生物科技公司進行基因合成。
[0045] (2 )多表位肽SAPE基因與pETC表達載體的連接 通過質粒小量提取試劑盒(天根)提取重組質粒pUCSAPE和pETCTB(郭樂博士惠贈），用 Kpn I/Xho I分別進行雙酶切，雙酶切反應體系如下：
37°C酶切反應2 h，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察電泳結果。分別利用瓊脂糖凝膠 DNA回收純化試劑盒回收多表位肽SAPE基因和pETCTB表達載體雙酶切產物。將回收的 pETCTB線性化載體和SAPE基因通過互補的粘性末端，在T4 DNA連接酶的作用下(4 °C過夜） 連接成閉合環狀的DNA分子，即形成重組表達質粒PETCTB-SAPEJ4 DNA連接酶連接體系如 下：
結果:利用Nco I/Xho I雙酶切待檢重組質粒pETCTB-SAPE，37°C反應2h，用1%的瓊脂 糖凝膠電泳檢測，發現雙酶切的DNA片段為620bp，與融合基因 CTB-SAPE的理論大小一致，如 (圖2)所示。再將pETCTB-SAPE送交南京金斯瑞生物科技公司，采用T7啟動子和終止子通用 引物進行基因測序，證明PETCTB-SAPE中融合基因 CTB-SAPE的核苷酸序列完全正確，且無移 碼突變。重組表達載體pETCTB-SAPE的質粒圖譜如（圖3 )所示。
[0046]實例3:多表位肽融合蛋白CTB-SAPE的原核表達 將驗證正確的重組表達質粒pETCTB-SAPE轉化進E.coli BL21(DE3)菌株中。在預先制 備好的含50yg/mL Kana的LB平板上，接種環劃線基因工程菌株pETCTB-SAPE/BL21(DE3)，倒 置于37°C培養箱，過夜培養12~16h后，挑取單個菌落，接種于含SOyg/mL Amp的LB培養基 中，37°C，180rpm，培養12~16h。以2%接種量分別接種重組菌于含SOyg/mL Kana LB培養基 中，37°C，180rpm振蕩過夜，次日晨再將該菌液以1%接種量接種于含SOyg/mL Kana的LB液體 培養基中，37°C，180rpm搖瓶3h后，加入IPTG使終濃度達到lmmol/L，37°C，180rpm誘導表達， 以空載體菌pET28a/BL21 (DE3)作為陰性對照。
[0047] 結果：將基因工程重組菌株pETCTB-SAPE/BL21 (DE3)在PH值為7、IPTG濃度為 lmmol/L、誘導溫度37°C、誘導時間為6h的情況下進行誘導表達。與對照菌株對比，基因工程 重組菌株PETCTB-SAPE/BL21 (DE3)在約26KD處出現目的蛋白條帶，與肝片吸蟲多表位肽融 合蛋白CTB-SAPE的理論大小相符合（圖4)。多表位肽融合蛋白CTB-SAPE在包涵體蛋白中存 在。
[0048]實例4:多表位肽融合蛋白CTB-SAPE的純化 Ni-NTA鎳離子親和層析柱的純化 將Ni-NTA填料充分混勻后加入層析柱中，溶液可通過重力作用緩慢流出，待完全加入 后，將上層篩板平放入柱中；向裝填好的柱中加入適量的去離子水將乙醇沖洗干凈后，加入 8倍柱體積的Binding buffer平衡，平衡結束后即可上樣;收集菌體后，每100mg菌體加入1-5ml Binding Buffer，超聲裂解菌體；12000rpm離心，棄上清；將沉淀重懸于含8M尿素的 Binding Buffer中，冰浴lh，使包涵體溶解;將菌體裂解液負載上柱，流速為10倍柱體積/小 時；使用15倍柱體積的Wash buff er沖洗柱子，收集流穿峰；使用5倍柱體積的Elution Buffer洗脫，收集洗脫峰；依次使用3倍柱體積的Binding Buffer和5倍柱體積的去離子 水洗滌后，用3倍柱體積的20%乙醇平衡，4 °C保存。
[0049]結果:經Ni-NTA鎳離子親和層析柱的純化后，收集的各個蛋白峰進行SDS-PAGE分 析，可以發現目的蛋白集中在250mM咪唑洗脫產生的蛋白峰。通過凝膠成像檢測儀分析在 250mM咪唑洗脫的目的蛋白純度可達電泳純（圖5)。
[0050] 實施例5:多表位疫苗CTB-SAPE的免疫原性和免疫特異性研究 (l)BALB/c小鼠的免疫 實驗分組:將SPF級BALB/c小鼠隨機分為3組，分別為新型多表位融合蛋白CTB-SAPE免 疫組、重組霍亂毒素 B亞基(rCTB)免疫組和PBS免疫組。每組6只BALB/c小鼠，共18只，詳細分 組如下圖所示：
免疫方式：用75%酒精對小鼠腹部消毒，然后腹部多點皮下注射表位融合蛋白CTB-SAPE和弗氏完全佐劑的混合乳化劑;每隔一周加強免疫一次，第2、3周加弗氏不完全佐劑， 第4周直接注射表位融合蛋白溶液加強免疫。
[0051 ]抗血清的采集:在末次免疫后第五天，摘小鼠眼球采血，收集血液，放置待血清完 全分離，3000rpm離心5分鐘分裝血清，一 80°C凍存備用。
[0052] (2 )抗血清中特異性抗體的ELI SA檢測 將抗原(FhSAP-2、肝片吸蟲總蛋白、FhSAP-221-3Q和FhSAP-276-85)用包被液稀釋成5yg/ ml或者10μg/ml，100yl/孔包被ELISA板，4°C過夜。用洗滌液洗4次后，每孔加入300μ1封閉 液，37 °C封閉2h。用洗滌液洗4次后，將抗血清（鼠抗CTB-SAPE抗血清和鼠抗rCTB抗血清）和 小鼠陰性血清倍比稀釋后加入ELISA板，100μΙ/孔，在37°C下孵育60min。用洗滌液洗4次后， 加入HRP標記的羊抗鼠46(1:10000)，10(^1/孔，在37°(：下孵育111。用洗滌液洗4次后，加入 TMB底物顯色液，室溫避光反應15min，加50μ1終止液終止反應。用酶標儀測定各孔0D45Q值。 [0053] 結果:FhSAP-2的包被濃度為10μg/ml，通過ELISA檢測，肝片吸蟲多表位疫苗CTB- SAPE能夠產生針對FhSAP-2的特異性IgG抗體，而PBS免疫組不能產生抗FhSAP-2抗體（圖6); 肝片吸蟲總蛋白的包被濃度為l〇μg/ml，通過ELISA檢測，多表位疫苗CTB-SAPE能夠產生抗 肝片吸蟲總蛋白的抗體，而PBS免疫組不能產生抗肝片吸蟲總蛋白的特異性抗體（圖7); FhSAP-2抗原表位FhSAP-221-3〇和FhSAP-276-85的包被濃度為10μg/ml，通過ELISA檢測，多表 位疫苗CTB-SAPE能夠產生較高水平的FhSAP-2 21-3〇和FhSAP-276-85特異性抗體，PBS免疫組 不能產生針對FhSAP-2表位特異性的抗體（圖8和圖9)。上述結果說明新型肝片吸蟲多表位 疫苗CTB-SAPE能夠刺激機體產生針對FhSAP-2的高滴度表位特異性抗體，具有很好的免疫 原性。
[0054] (3)小鼠脾臟淋巴細胞增殖實驗 將經抗原免疫的小鼠脫白處死，泡75%酒精5min后，移入超凈工作臺。用剪刀小心剪開 小鼠的腹部外皮，再剪開小鼠的腹腔，用鑷子取出小鼠脾臟(暗紅色）。在小平皿中放入2~ 3ml Lympholyte ?-M淋巴細胞分離液；用鑷子固定尼龍網，然后用注射器活塞輕輕研磨 小鼠脾臟，使得分散的單細胞透過尼龍網進入淋巴細胞分離液中；把懸有脾臟細胞的分離 液立即轉移到離心管中，離心前再覆蓋上大約lml的1640培養基；1000g~1500g離心20min。 離心結束后淋巴細胞會在1640培養基下層懸浮。用含10%小牛血清的RPMI-1640培養基制備 成一定濃度的細胞懸液(5 X 104/ml)。在96孔平底培養板中，每孔加入50μ1細胞，同時加入 CTB-SAPE和FhSAP-2各40μg/ml、FhSAP-2 Th細胞抗原表位肽（FhSAP-27i-so和FhSAP-2si-9〇) 和生理鹽水各50μ1，終體積為100μΙ/孔，每組做3個平行孔。將加好的96孔平底培養板放置 37°C 5% C02培養箱中培養60h后，向各孔中加入MTS溶液20μ1，繼續培養4h后用酶標儀讀取 0D49Q值。刺激指數(SI)多2時，判斷為陽性;刺激指數計算公式如下：
結果：多表位疫苗CTB-SAPE致敏過的小鼠脾臟淋巴細胞經FhSAP-2及CTB-SAPE刺激均 能夠發生明顯的淋巴細胞增殖反應，而PBS免疫組的小鼠脾臟淋巴細胞接受上述抗原刺激 時均未發生淋巴細胞增殖反應，說明肝片吸蟲多表位疫苗CTB-SAPE中FhSAP-2的Th抗原表 位(FhSAP-27i-8Q、FhSAP-2 81-9Q)均保持有其免疫學特性，能夠刺激機體產生針對各自Th抗原 表位的細胞免疫應答(圖10)。
[0055] 實例5:GM1-ELISA檢測多表位疫苗CTB-SAPE中CTB組分的分子免疫佐劑活性 將神經節苷脂GM1或者牛血清白蛋白（BSA)用包被液稀釋至10μg/ml，100μΙ/孔，包被 ELISA板，4 °C過夜。用TOST洗滌4次;每孔加入300μ1封閉液，37 °C封閉2h;用洗滌液PBST洗4 次后，4°C保存。將多表位肽融合蛋白CTB-SAPE和重組霍亂毒素 B亞基(rCTB)按照一定比例 稀釋（100μg/ml到Ο · 78μg/ml)，加入100μΙ/孔，37°C放置60min。用洗滌液PBST洗4次，加入鼠 抗CTB多克隆抗體（1:1000)，100μΙ/孔，37°C溫育60min。洗滌4次；加入HRP標記羊抗鼠 IgG (1:10000)，100μΙ/孔，37°C放置30min。洗滌4次后，加入TMB底物顯色液，37°C孵育lOmin，50 μL終止液終止反應。用酶標儀檢測各孔OD45Q值。
[0056] 結果:通過GM1-ELISA檢測多表位肽融合蛋白CTB-SAPE和rCTB是否具有形成五聚 體和神經節苷脂GM1結合的活性。多表位肽融合蛋白CTB-SAPE和rCTB的0D45Q都顯著高于陰 性對照組(包被BSA)，證明多表位肽融合蛋白CTB-SAPE和rCTB均具有形成五聚體和神經節 苷脂GM1結合的活性，也說明新型多表位疫苗CTB-SAPE中CTB組分具有較好的分子免疫佐劑 活性(圖11)。
【主權項】
1. 一種新型肝片吸蟲多表位疫苗，其活性成分是一條多肽，主要由霍亂毒素 B亞基 (CTB)和鞘脂激活蛋白樣蛋白-2多表位肽SAPE構成，其氨基酸序列如序列1所示。2. 如權利要求1所述，一種新型肝片吸蟲多表位疫苗，其核苷酸序列如序列2所示。3. 如權利要求1所述，鞘脂激活蛋白樣蛋白_2多表位肽SAPE主要由鞘脂激活蛋白樣蛋 白-2的Th和B細胞抗原表位的多拷貝體構成，其氨基酸序列如序列3所示。4. 如權利要求3所述，鞘脂激活蛋白樣蛋白-2多表位肽SAPE的核苷酸序列如序列4所 不。5. 包含權利要求2和4中所述的核苷酸序列的表達載體，轉基因細胞系及宿主菌。6. 如權利要求1所述，霍亂毒素 B亞基（CTB)和鞘脂激活蛋白樣蛋白-2多表位肽SAPE之 間的間隔序列為DPRVPSS。7. -種新型肝片吸蟲多表位疫苗的制備方法，通過基因合成技術合成鞘脂激活蛋白樣 蛋白-2多表位肽SAPE的核苷酸序列，將其融合在霍亂毒素 B亞基(CTB)基因的下游，構建含 有融合基因 CTB-SAPE的重組表達載體pETCTB-SAPE及其重組基因工程菌，重組基因工程菌 株發酵后，經Ni-NTA鎳離子交換層析，獲得該疫苗的融合蛋白CTB-SAPE。8. 按照權利要求1和7所述的肝片吸蟲多表位疫苗，其特征在于能夠激發機體產生針對 肝片吸蟲鞘脂激活蛋白樣蛋白-2 T細胞免疫應答和有效抑制肝片吸蟲鞘脂激活蛋白樣蛋 白-2活性的高滴度表位特異性抗體。9. 按照權利要求1和8所述的肝片吸蟲多表位疫苗，其特征是可以用作預防和治療肝片 吸蟲感染的藥物組合。
【文檔編號】C12R1/19GK105903007SQ201610421480
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年6月15日
【發明人】陳剛, 湯鋒, 李潤樂, 康明, 周虎, 馮琳
【申請人】青海大學