一種A群C群腦膜炎球菌b型流感嗜血桿菌聯合疫苗的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種A群C群腦膜炎球菌b型流感嗜血桿菌聯合疫苗的制備方法，該方法包括：S1.制備單價疫苗原液；S2.制備聯合疫苗；S3.凍干。本發明提供了一種A群C群腦膜炎球菌b型流感嗜血桿菌聯合疫苗的制備方法，該方法將A群、C群腦膜炎球菌與b型流感嗜血桿菌疫苗結合起來，制備的聯合疫苗效果顯著，由于為聯合疫苗，因此該疫苗減少了接種次數，降低嬰幼兒創傷，降低了接種成本，具有良好的社會和經濟效益；本發明的方法具有操作簡單、制備方便、成本低、適用于工業化大規模生產。
【專利說明】
一種A群C群腦膜炎球菌b型流感嗜血桿菌聯合疫苗的制備方法
技術領域
[0001]本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種A群C群腦膜炎球菌b型流感嗜血桿菌聯合疫苗的制備方法。
【背景技術】
[0002]流行性腦脊髓膜炎是一種由奈瑟氏腦膜炎球菌(Neisseriameningitidis)引起的急性呼吸道傳染病。一百多年來，一直在世界各地流行或散在發生，感染病原菌后可引起敗血癥、腦膜炎。易感人群主要為兒童，以暴發型病死率最高，可達40%?60%。當今世界各大洲發病率在1/10萬?10/10萬，總病死率在5%?15%，高達20%的腦膜炎患者會有神經系統后遺癥，包括智力受損和耳聾等。
[0003]腦膜炎球菌根據莢膜多糖型別進行血清學分類可分13個血清型，其中A群，B群，C群約占流行菌群的90%。其中A群腦膜炎球菌是較大流行的主要致病血清群，特別是在所謂的非洲“流腦流行帶”，每隔7?14年就會出現一次較大流行，引起兒童和年輕成人超額發病率與死亡率。近年來，一些西方國家則出現過C群引起的流腦爆發。我國于1938年、1949年、1959年、1967年和1977年發生過5次全國性流腦流行。其中以1967年春季最為嚴重，發病率高達403/10萬，病死率為5.49%。我國過去90%以上的病例是A群病菌致病，現在B群或C群病菌有時亦引起流腦暴發。2003年開始，C群流腦的發病率明顯上升。目前A群和C群共占所有血清群的50%以上，且C群仍有進一步增高的趨勢。
[0004]即使是在醫療條件比較完善的地方，流腦病死率仍然很高(5-15%)。一般來說，僅靠藥物預防措施來控制此病是不夠的。目前預防流腦最有效的方法是接種疫苗。我國從2007年起已將流腦疫苗納入國家免疫規劃，在全國范圍對適齡兒童普及接種。
[0005]流感嗜血桿菌(Haemophilus Influenza，Hi)迄今仍是導致人類侵襲性疾病的主要致病菌，其中絕大部分由b型流感嗜血桿菌(Haemophilus Influenza type b，Hib)引起。Hib腦膜炎居細菌性腦膜炎的首位，具有發病率高、病死率高和致殘率高的特點；其另一個特點是發病年齡小，嬰幼兒感染率高，發病年齡主要集中在5歲以下，尤其是2歲以下。全世界估計每年至少造成300萬例嚴重疾病，其中約38.6萬人死亡，已成為全球性的一大公共衛生問題。
[0006]在發展中國家，Hib肺炎在兒童感染性疾病中占有重要地位，約占所有兒童肺炎的20%，是發展中國家兒童肺炎的重要死亡原因。上世紀90年代初，西歐、美洲等國家將Hib結合疫苗納入常規兒童免疫規劃，Hib侵襲性疾病的發病率迅速降低或消失。目前，世界衛生組織(WHO)正致力于推動將其納入其它國家的計劃免疫程序中。在我國，3?5歲兒童中Hib自然感染抗體水平低，為Hib感染高危人群。我國醫院臨床研究提示，Hib腦膜炎在小兒化膿性腦膜炎中占51.7%，其中84%為2歲以下兒童;兒童中Hib肺炎占34.3%，因此我國有使用Hib結合疫苗的必要。
[0007]目前在全世界可通過免疫接種來預防的疾病已經達三十多種，其中大部分是針對兒童接種。自1974年WHO推行擴大免疫計劃以來，疫苗的接種覆蓋率得到大大提高，接種次數也不斷增加。據統計，兒童入學前需接受預防接種21次左右，在未來還會有新的疫苗不斷研究和開發出來，因此兒童免疫計劃表中的疫苗種類也會隨之增加。為了在兒童期有限的時間內減少接種次數同時又能預防更多疾病，迫切需要研究開發聯合疫苗。
[0008]聯合疫苗較以往的單價疫苗有很多優勢，如更少的接種次數，降低嬰幼兒創傷;提高國家免疫計劃表的實施效率，減少漏種;更高的免疫覆蓋率;更低的空間存放要求;便于未來增加新品種疫苗到免疫計劃表中。因此從某種意義上說，聯合疫苗在預防傳染病的作用中代表了未來疫苗的發展方向。

【發明內容】

[0009]本發明的目的在于克服現有技術的缺點，提供一種A群C群腦膜炎球菌b型流感嗜血桿菌聯合疫苗的制備方法。
[0010]本發明的目的通過以下技術方案來實現:一種A群C群腦膜炎球菌b型流感嗜血桿菌聯合疫苗的制備方法，它包括以下步驟:
51.制備單價疫苗原液:包括制備A群腦膜炎球菌結合疫苗原液、制備C群腦膜炎球菌結合疫苗原液、制備b型流感嗜血桿菌結合疫苗原液；
52.制備聯合疫苗:將制備的A群腦膜炎球菌結合疫苗原液、C群腦膜炎球菌結合疫苗原液、b型流感嗜血桿菌結合疫苗原液按重量比為1:1:1的比例混合均勻，混合液中加入乳糖，至結合多糖的含量為30yg/0.5mL;
53.凍干:將凍干機的板層降溫至-45?-55°C，步驟S2制備的聯合疫苗制品預凍3.5?
4.5h，預凍后抽真空至0.05?0.08mbar保持1.5?2.5h，采用三段升溫O°C保持1.5?2.5h，
溫持續升溫至28?35°C，制品溫度達到28?30°C后打開真空控制維持溫度保持15?25h，凍干結束后充氮氣壓蓋出柜，即制得聯合疫苗。
[0011]進一步地，步驟S2中A群腦膜炎球菌結合多糖為10yg/0.5mL、C群腦膜炎球菌結合多糖為10yg/0.5mL、b型流感嗜血桿菌結合多糖為10yg/0.5mL。
[0012]進一步地，步驟S3中所述三段升溫的第一段溫度為-50?_30°C、第二段溫度為-30?-20°C、第三段溫度為-20?O °C。
[0013]本發明具有以下優點:本發明提供了一種A群C群腦膜炎球菌b型流感嗜血桿菌聯合疫苗的制備方法，該方法將A群、C群腦膜炎球菌與b型流感嗜血桿菌疫苗結合起來，制備的聯合疫苗效果顯著，由于為聯合疫苗，因此該疫苗減少了接種次數，降低嬰幼兒創傷，降低了接種成本，具有良好的社會和經濟效益;本發明的方法具有操作簡單、制備方便、成本低、適用于工業化大規模生產。
【具體實施方式】
[0014]下面結合實施例對本發明做進一步的描述，本發明的保護范圍不局限于以下所述。
[0015]實施例1:一種A群C群腦膜炎球菌b型流感嗜血桿菌聯合疫苗的制備方法，它包括以下步驟:
S1.制備單價疫苗原液:包括制備A群腦膜炎球菌結合疫苗原液、制備C群腦膜炎球菌結合疫苗原液、制備b型流感嗜血桿菌結合疫苗原液；
511.制備A群腦膜炎球菌結合疫苗原液
開啟A群腦膜炎球菌工作種子批菌種，接種至流腦半綜合培養基，溫度35?37°C，培養16?24小時，然后經過三代擴增培養，制備數量適宜的生產用種子，接種至500L發酵罐培養，溫度35?37°C，培養時間6?12小時后加入甲醛殺菌；
將已殺菌的培養液離心收集上清，然后加入十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)至終濃度1.0g/L，充分攪拌后靜置過夜，離心收集多糖。沉淀的多糖用氯化鈣溶液攪拌3小時使多糖和CTAB解離，離心收集上清，上清加入乙醇至終濃度為25%( v/v)，2?8°C靜置過夜，離心收集上清，上清加入乙醇至終濃度為75?80%(v/v)，充分振搖使多糖沉淀，靜置18小時以上，離心收集沉淀，然后用無水乙醇和丙酮各洗三次，干燥后即為粗制多糖；
將粗糖溶解于10%飽和中性醋酸鈉溶液中。然后按1: l(v/v)比例加入冷酚溶液，振蕩混勻后離心收集上清液，抽提I?3次至上清液澄清，收集上清液，用超濾膜包超濾去除殘余的苯酚及核酸，超濾后的多糖溶液中加入4mol/L NaCl溶液，至NaCl終濃度為0.3mol/L，然后加入95%乙醇至乙醇終濃度為75%(v/v)，充分混勻后2?8°C靜置過夜，沉淀精糖，離心收集沉淀，然后依次用無水乙醇、丙酮各洗滌兩次，干燥后即為精糖；
將精糖溶解于注射用水中，按多糖:溴化氰=1: 0.5(w/w)的比例加入溴化氰溶液，維持溫度23±3°C，pH1.8±0.2反應30分鐘進行活化，活化完成后，按多糖:己二酰肼=1:3.5(w/w)的比例加入2.8%己二酰肼溶液，維持溫度23 ± 3 °C，pH8.5 ± 0.2反應15分鐘進行衍生；澄清過濾后，用0.05mol/L氯化鈉溶液為超濾液，用超濾膜包超濾去除溴化氰，即為多糖衍生物。；
按多糖:蛋白=1:0.8?1.2(w/w)的比例計算破傷風類毒素用量，加入多糖衍生物溶液中，按多糖:碳二亞胺=1:10(w/w)的比例加入碳二亞胺，維持反應溫度5 ± 3°C ; pH5.7 ±0.2，反應60分鐘，然后調節pH至6.9±0.1終止反應。經澄清過濾后，用0.15mol/L氯化鈉溶液為超濾液，用超濾膜包超濾去除碳二亞胺。然后將多糖蛋白結合物溶液用Sepharose 4FF凝膠層析柱純化。以0.15mol/L NaCl溶液為流動相，監測0D280nm的吸收值，收集Vo附近的洗脫峰。合并各次層析收獲的洗脫液后即為純化的結合物，經除菌過濾后，即為A群腦膜炎球菌結合疫苗原液；
512.制備C群腦膜炎球菌結合疫苗原液
開啟C群腦膜炎球菌工作種子批菌種，接種至流腦半綜合培養基，溫度35?37°C，培養16?24小時，然后經過三代擴增培養，制備數量適宜的生產用種子，接種至500L發酵罐培養，溫度35?37°C，培養時間6?12小時后加入甲醛殺菌；
將已殺菌的培養液離心收集上清。然后加入十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)至終濃度1.0g/L，充分攪拌后靜置過夜，離心收集多糖。沉淀的多糖用氯化鈣溶液攪拌3小時使多糖和CTAB解離。離心收集上清，上清加入乙醇至終濃度為25%(v/v)，2?8°C靜置過夜，離心收集上清，上清加入乙醇至終濃度為75?80%(v/v)，充分振搖使多糖沉淀，靜置18小時以上，離心收集沉淀，然后用無水乙醇和丙酮各洗三次，干燥后即為粗制多糖；
將粗糖溶解于10%飽和中性醋酸鈉溶液中。然后按1: l(v/v)比例加入冷酚溶液，振蕩混勻后離心收集上清液，抽提I?3次至上清液澄清。收集上清液，用超濾膜包超濾去除殘余的苯酚及核酸。超濾后的多糖溶液中加入4mol/L NaCl溶液，至NaCl終濃度為0.3mol/L，然后加入95%乙醇至乙醇終濃度為75%(v/v)，充分混勻后2?8°C靜置過夜，沉淀精糖。離心收集沉淀，然后依次用無水乙醇、丙酮各洗滌兩次，干燥后即為精糖；
將精糖溶解于注射用水中。按多糖:溴化氰=1:0.5(w/w)的比例加入溴化氰溶液。維持溫度23±3°C，pH10.8±0.2反應30分鐘進行活化。活化完成后，按多糖:己二酰肼=1:3.5(w/w)的比例加入2.8%己二酰肼溶液。維持溫度23 ± 3 °C，pH8.5 ± 0.2反應15分鐘進行衍生。澄清過濾后，用0.05mol/L氯化鈉溶液為超濾液，用超濾膜包超濾去除溴化氰，即為多糖衍生物。
[0016]按多糖:蛋白=1:0.8?1.2(w/w)的比例計算破傷風類毒素用量，加入多糖衍生物溶液中，按多糖:碳二亞胺=1: 10(w/w)的比例加入碳二亞胺，維持反應溫度5 ±3°C ;pH5.7 土
0.2，反應60分鐘，然后調節pH至6.9±0.1終止反應。經澄清過濾后，用0.15mol/L氯化鈉溶液為超濾液，用超濾膜包超濾去除碳二亞胺。然后將多糖蛋白結合物溶液用Sepharose 4FF凝膠層析柱純化。以0.15mol/L NaCl溶液為流動相，監測0D280nm的吸收值，收集Vo附近的洗脫峰。合并各次層析收獲的洗脫液后即為純化的結合物，經除菌過濾后，即為C群腦膜炎球菌結合疫苗原液；
S13.制備b型流感嗜血桿菌結合疫苗原液
開啟b型流感嗜血桿菌工作種子批菌種，接種至Hib綜合培養基，溫度35?37 °C，5?8%CO2環境中，培養16?24小時，然后經過三代擴增培養，制備數量適宜的生產用種子，接種至500L發酵罐培養，溫度35?37°C，培養時間6?12小時后加入甲醛殺菌；
將已殺菌的培養液離心收集上清，然后加入十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)至終濃度I.0g/L，充分攪拌后靜置過夜，離心收集多糖;沉淀的多糖用氯化鈉溶液攪拌3小時使多糖和CTAB解離。離心收集上清，上清加入乙醇至終濃度為25%(v/v)，2?8°C靜置過夜，離心收集上清，上清加入乙醇至終濃度為75?80%( v/v)，充分振搖使多糖沉淀，靜置過夜，離心收集沉淀，用無水乙醇和丙酮各洗三次，干燥后即為粗制多糖；
將粗糖溶解于10%飽和中性醋酸鈉溶液中，然后按1: l(v/v)比例加入冷酚溶液，振蕩混勻后離心收集上清液，抽提I?3次至上清液澄清;收集上清液，用超濾膜包超濾去除殘余的苯酚及核酸;超濾后的多糖溶液中加入4mol/L NaCl溶液，至NaCl終濃度為0.3mol/L，然后加入95%乙醇至乙醇終濃度為75%(v/v)，充分混勻后2?8°C靜置過夜，沉淀精糖。離心收集沉淀，然后依次用無水乙醇、丙酮各洗滌兩次，干燥后即為精糖。
[0017]將精糖溶解于注射用水中。按多糖:溴化氰=1:0.5(w/w)的比例加入溴化氰溶液。維持溫度23 ± 3 °C，pH10.8 ± 0.2反應30分鐘進行活化。活化完成后，按多糖:己二酰肼=1:3.5(w/w)的比例加入2.8%己二酰肼溶液。維持溫度23 ± 3°C，pH8.5 ±0.2反應15分鐘進行衍生。澄清過濾后，用0.05mol/L氯化鈉溶液為超濾液，用超濾膜包超濾去除溴化氰，即為多糖衍生物。
[0018]按多糖:蛋白=1:0.8?1.2(w/w)的比例計算破傷風類毒素用量，加入多糖衍生物溶液中，按多糖:碳二亞胺=1: 10(w/w)的比例加入碳二亞胺，維持反應溫度5 ±3°C ;pH5.7 土
0.2，反應60分鐘，然后調節pH至6.9±0.1終止反應。經澄清過濾后，用0.15mol/L氯化鈉溶液為超濾液，用超濾膜包超濾去除碳二亞胺。然后將多糖蛋白結合物溶液用Sepharose 4FF凝膠層析柱純化。以0.15mol/L NaCl溶液為流動相，監測0D280nm的吸收值，收集VO附近的洗脫峰。合并各次層析收獲的洗脫液后即為純化的結合物，經除菌過濾后，即為b型流感嗜血桿菌結合疫苗原液；
52.制備聯合疫苗:將制備的A群腦膜炎球菌結合疫苗原液、C群腦膜炎球菌結合疫苗原液、b型流感嗜血桿菌結合疫苗原液按重量比為1:1:1的比例混合均勻，混合液中加入乳糖，至結合多糖的含量為30yg/0.5mL;其中，A群腦膜炎球菌結合多糖為10yg/0.5mL、C群腦膜炎球菌結合多糖為10yg/0.5mL、b型流感嗜血桿菌結合多糖為10yg/0.5mL；
53.凍干:將凍干機的板層降溫至_45°C，步驟S2制備的聯合疫苗制品預凍3.5h，預凍后抽真空至0.05mbar保持1.5h，采用三段升溫0°C保持1.5?2.5h，溫持續升溫至28°C，制品溫度達到28°C后打開真空控制維持溫度保持15h，凍干結束后充氮氣壓蓋出柜，即制得聯合疫苗，其中，中所述三段升溫的第一段溫度為-50°C、第二段溫度為-30°C、第三段溫度為OΓ。
[0019]實施例2:—種A群C群腦膜炎球菌b型流感嗜血桿菌聯合疫苗的制備方法，它包括以下步驟:
S1.制備單價疫苗原液:包括制備A群腦膜炎球菌結合疫苗原液、制備C群腦膜炎球菌結合疫苗原液、制備b型流感嗜血桿菌結合疫苗原液；
Sll.制備A群腦膜炎球菌結合疫苗原液
開啟A群腦膜炎球菌工作種子批菌種，接種至流腦半綜合培養基，溫度35?37°C，培養16?24小時，然后經過三代擴增培養，制備數量適宜的生產用種子，接種至500L發酵罐培養，溫度35?37°C，培養時間6?12小時后加入甲醛殺菌；
將已殺菌的培養液離心收集上清，然后加入十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)至終濃度1.0g/L，充分攪拌后靜置過夜，離心收集多糖。沉淀的多糖用氯化鈣溶液攪拌3小時使多糖和CTAB解離，離心收集上清，上清加入乙醇至終濃度為25%( v/v)，2?8°C靜置過夜，離心收集上清，上清加入乙醇至終濃度為75?80%(v/v)，充分振搖使多糖沉淀，靜置18小時以上，離心收集沉淀，然后用無水乙醇和丙酮各洗三次，干燥后即為粗制多糖；
將粗糖溶解于10%飽和中性醋酸鈉溶液中。然后按1: l(v/v)比例加入冷酚溶液，振蕩混勻后離心收集上清液，抽提I?3次至上清液澄清，收集上清液，用超濾膜包超濾去除殘余的苯酚及核酸，超濾后的多糖溶液中加入4mol/L NaCl溶液，至NaCl終濃度為0.3mol/L，然后加入95%乙醇至乙醇終濃度為75%(v/v)，充分混勻后2?8°C靜置過夜，沉淀精糖，離心收集沉淀，然后依次用無水乙醇、丙酮各洗滌兩次，干燥后即為精糖；
將精糖溶解于注射用水中，按多糖:溴化氰=1: 0.5(w/w)的比例加入溴化氰溶液，維持溫度23±3°C，pH1.8±0.2反應30分鐘進行活化，活化完成后，按多糖:己二酰肼=1:3.5(w/w)的比例加入2.8%己二酰肼溶液，維持溫度23 ± 3 °C，pH8.5 ± 0.2反應15分鐘進行衍生；澄清過濾后，用0.05mol/L氯化鈉溶液為超濾液，用超濾膜包超濾去除溴化氰，即為多糖衍生物。；
按多糖:蛋白=1:0.8?1.2(w/w)的比例計算破傷風類毒素用量，加入多糖衍生物溶液中，按多糖:碳二亞胺=1:10(w/w)的比例加入碳二亞胺，維持反應溫度5 ± 3°C ; pH5.7 ±0.2，反應60分鐘，然后調節pH至6.9±0.1終止反應。經澄清過濾后，用0.15mol/L氯化鈉溶液為超濾液，用超濾膜包超濾去除碳二亞胺。然后將多糖蛋白結合物溶液用Sepharose 4FF凝膠層析柱純化。以0.15mol/L NaCl溶液為流動相，監測0D280nm的吸收值，收集Vo附近的洗脫峰。合并各次層析收獲的洗脫液后即為純化的結合物，經除菌過濾后，即為A群腦膜炎球菌結合疫苗原液；
512.制備C群腦膜炎球菌結合疫苗原液
開啟C群腦膜炎球菌工作種子批菌種，接種至流腦半綜合培養基，溫度35?37°C，培養16?24小時，然后經過三代擴增培養，制備數量適宜的生產用種子，接種至500L發酵罐培養，溫度35?37°C，培養時間6?12小時后加入甲醛殺菌；
將已殺菌的培養液離心收集上清。然后加入十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)至終濃度1.0g/L，充分攪拌后靜置過夜，離心收集多糖。沉淀的多糖用氯化鈣溶液攪拌3小時使多糖和CTAB解離。離心收集上清，上清加入乙醇至終濃度為25%(v/v)，2?8°C靜置過夜，離心收集上清，上清加入乙醇至終濃度為75?80%(v/v)，充分振搖使多糖沉淀，靜置18小時以上，離心收集沉淀，然后用無水乙醇和丙酮各洗三次，干燥后即為粗制多糖；
將粗糖溶解于10%飽和中性醋酸鈉溶液中。然后按1: l(v/v)比例加入冷酚溶液，振蕩混勻后離心收集上清液，抽提I?3次至上清液澄清。收集上清液，用超濾膜包超濾去除殘余的苯酚及核酸。超濾后的多糖溶液中加入4mol/L NaCl溶液，至NaCl終濃度為0.3mol/L，然后加入95%乙醇至乙醇終濃度為75%(v/v)，充分混勻后2?8°C靜置過夜，沉淀精糖。離心收集沉淀，然后依次用無水乙醇、丙酮各洗滌兩次，干燥后即為精糖；
將精糖溶解于注射用水中。按多糖:溴化氰=1:0.5(w/w)的比例加入溴化氰溶液。維持溫度23±3°C，pH10.8±0.2反應30分鐘進行活化。活化完成后，按多糖:己二酰肼=1:3.5(w/w)的比例加入2.8%己二酰肼溶液。維持溫度23 ± 3 °C，pH8.5 ± 0.2反應15分鐘進行衍生。澄清過濾后，用0.05mol/L氯化鈉溶液為超濾液，用超濾膜包超濾去除溴化氰，即為多糖衍生物。
[0020]按多糖:蛋白=1:0.8?1.2(w/w)的比例計算破傷風類毒素用量，加入多糖衍生物溶液中，按多糖:碳二亞胺=1: 10(w/w)的比例加入碳二亞胺，維持反應溫度5 ±3°C ;pH5.7 土
0.2，反應60分鐘，然后調節pH至6.9±0.1終止反應。經澄清過濾后，用0.15mol/L氯化鈉溶液為超濾液，用超濾膜包超濾去除碳二亞胺。然后將多糖蛋白結合物溶液用Sepharose 4FF凝膠層析柱純化。以0.15mol/L NaCl溶液為流動相，監測0D280nm的吸收值，收集Vo附近的洗脫峰。合并各次層析收獲的洗脫液后即為純化的結合物，經除菌過濾后，即為C群腦膜炎球菌結合疫苗原液；
513.制備b型流感嗜血桿菌結合疫苗原液
開啟b型流感嗜血桿菌工作種子批菌種，接種至Hib綜合培養基，溫度35?37 °C，5?8%CO2環境中，培養16?24小時，然后經過三代擴增培養，制備數量適宜的生產用種子，接種至500L發酵罐培養，溫度35?37°C，培養時間6?12小時后加入甲醛殺菌；
將已殺菌的培養液離心收集上清，然后加入十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)至終濃度I.0g/L，充分攪拌后靜置過夜，離心收集多糖;沉淀的多糖用氯化鈉溶液攪拌3小時使多糖和CTAB解離。離心收集上清，上清加入乙醇至終濃度為25%(v/v)，2?8°C靜置過夜，離心收集上清，上清加入乙醇至終濃度為75?80%( v/v)，充分振搖使多糖沉淀，靜置過夜，離心收集沉淀，用無水乙醇和丙酮各洗三次，干燥后即為粗制多糖；
將粗糖溶解于10%飽和中性醋酸鈉溶液中，然后按1: l(v/v)比例加入冷酚溶液，振蕩混勻后離心收集上清液，抽提I?3次至上清液澄清;收集上清液，用超濾膜包超濾去除殘余的苯酚及核酸;超濾后的多糖溶液中加入4mol/L NaCl溶液，至NaCl終濃度為0.3mol/L，然后加入95%乙醇至乙醇終濃度為75%(v/v)，充分混勻后2?8°C靜置過夜，沉淀精糖。離心收集沉淀，然后依次用無水乙醇、丙酮各洗滌兩次，干燥后即為精糖。
[0021 ]將精糖溶解于注射用水中。按多糖:溴化氰=1:0.5(w/w)的比例加入溴化氰溶液。維持溫度23 ± 3 °C，pH10.8 ± 0.2反應30分鐘進行活化。活化完成后，按多糖:己二酰肼=1:3.5(w/w)的比例加入2.8%己二酰肼溶液。維持溫度23 ± 3°C，pH8.5 ±0.2反應15分鐘進行衍生。澄清過濾后，用0.05mol/L氯化鈉溶液為超濾液，用超濾膜包超濾去除溴化氰，即為多糖衍生物。
[0022]按多糖:蛋白=1:0.8?1.2(w/w)的比例計算破傷風類毒素用量，加入多糖衍生物溶液中，按多糖:碳二亞胺=1: 10(w/w)的比例加入碳二亞胺，維持反應溫度5 ±3°C ;pH5.7 土
0.2，反應60分鐘，然后調節pH至6.9±0.1終止反應。經澄清過濾后，用0.15mol/L氯化鈉溶液為超濾液，用超濾膜包超濾去除碳二亞胺。然后將多糖蛋白結合物溶液用Sepharose 4FF凝膠層析柱純化。以0.15mol/L NaCl溶液為流動相，監測0D280nm的吸收值，收集VO附近的洗脫峰。合并各次層析收獲的洗脫液后即為純化的結合物，經除菌過濾后，即為b型流感嗜血桿菌結合疫苗原液；
52.制備聯合疫苗:將制備的A群腦膜炎球菌結合疫苗原液、C群腦膜炎球菌結合疫苗原液、b型流感嗜血桿菌結合疫苗原液按重量比為1:1:1的比例混合均勻，混合液中加入乳糖，至結合多糖的含量為30yg/0.5mL;其中，A群腦膜炎球菌結合多糖為10yg/0.5mL、C群腦膜炎球菌結合多糖為10yg/0.5mL、b型流感嗜血桿菌結合多糖為10yg/0.5mL；
53.凍干:將凍干機的板層降溫至_55°C，步驟S2制備的聯合疫苗制品預凍4.5h，預凍后抽真空至0.0SmbaH呆持2.5h，采用三段升溫(TC保持2.5h，溫持續升溫至35°C，制品溫度達到30°C后打開真空控制維持溫度保持25h，凍干結束后充氮氣壓蓋出柜，即制得聯合疫苗，其中，中所述三段升溫的第一段溫度為-30°C、第二段溫度為-20°C、第三段溫度為-20Γ。
[0023]實施例3:—種A群C群腦膜炎球菌b型流感嗜血桿菌聯合疫苗的制備方法，它包括以下步驟:
S1.制備單價疫苗原液:包括制備A群腦膜炎球菌結合疫苗原液、制備C群腦膜炎球菌結合疫苗原液、制備b型流感嗜血桿菌結合疫苗原液；
Sll.制備A群腦膜炎球菌結合疫苗原液
開啟A群腦膜炎球菌工作種子批菌種，接種至流腦半綜合培養基，溫度35?37°C，培養16?24小時，然后經過三代擴增培養，制備數量適宜的生產用種子，接種至500L發酵罐培養，溫度35?37°C，培養時間6?12小時后加入甲醛殺菌；
將已殺菌的培養液離心收集上清，然后加入十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)至終濃度1.0g/L，充分攪拌后靜置過夜，離心收集多糖。沉淀的多糖用氯化鈣溶液攪拌3小時使多糖和CTAB解離，離心收集上清，上清加入乙醇至終濃度為25%( v/v)，2?8°C靜置過夜，離心收集上清，上清加入乙醇至終濃度為75?80%(v/v)，充分振搖使多糖沉淀，靜置18小時以上，離心收集沉淀，然后用無水乙醇和丙酮各洗三次，干燥后即為粗制多糖；
將粗糖溶解于10%飽和中性醋酸鈉溶液中。然后按1: l(v/v)比例加入冷酚溶液，振蕩混勻后離心收集上清液，抽提I?3次至上清液澄清，收集上清液，用超濾膜包超濾去除殘余的苯酚及核酸，超濾后的多糖溶液中加入4mol/L NaCl溶液，至NaCl終濃度為0.3mol/L，然后加入95%乙醇至乙醇終濃度為75%(v/v)，充分混勻后2?8°C靜置過夜，沉淀精糖，離心收集沉淀，然后依次用無水乙醇、丙酮各洗滌兩次，干燥后即為精糖；
將精糖溶解于注射用水中，按多糖:溴化氰=1: 0.5(w/w)的比例加入溴化氰溶液，維持溫度23±3°C，pH1.8±0.2反應30分鐘進行活化，活化完成后，按多糖:己二酰肼=1:3.5(w/w)的比例加入2.8%己二酰肼溶液，維持溫度23 ± 3 °C，pH8.5 ± 0.2反應15分鐘進行衍生；澄清過濾后，用0.05mol/L氯化鈉溶液為超濾液，用超濾膜包超濾去除溴化氰，即為多糖衍生物。；
按多糖:蛋白=1:0.8?1.2(w/w)的比例計算破傷風類毒素用量，加入多糖衍生物溶液中，按多糖:碳二亞胺=1:10(w/w)的比例加入碳二亞胺，維持反應溫度5 ± 3°C ; pH5.7 ±0.2，反應60分鐘，然后調節pH至6.9±0.1終止反應。經澄清過濾后，用0.15mol/L氯化鈉溶液為超濾液，用超濾膜包超濾去除碳二亞胺。然后將多糖蛋白結合物溶液用Sepharose 4FF凝膠層析柱純化。以0.15mol/L NaCl溶液為流動相，監測0D280nm的吸收值，收集Vo附近的洗脫峰。合并各次層析收獲的洗脫液后即為純化的結合物，經除菌過濾后，即為A群腦膜炎球菌結合疫苗原液；
S12.制備C群腦膜炎球菌結合疫苗原液
開啟C群腦膜炎球菌工作種子批菌種，接種至流腦半綜合培養基，溫度35?37°C，培養16?24小時，然后經過三代擴增培養，制備數量適宜的生產用種子，接種至500L發酵罐培養，溫度35?37°C，培養時間6?12小時后加入甲醛殺菌；
將已殺菌的培養液離心收集上清。然后加入十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)至終濃度
1.0g/L，充分攪拌后靜置過夜，離心收集多糖。沉淀的多糖用氯化鈣溶液攪拌3小時使多糖和CTAB解離。離心收集上清，上清加入乙醇至終濃度為25%(v/v)，2?8°C靜置過夜，離心收集上清，上清加入乙醇至終濃度為75?80%(v/v)，充分振搖使多糖沉淀，靜置18小時以上，離心收集沉淀，然后用無水乙醇和丙酮各洗三次，干燥后即為粗制多糖；
將粗糖溶解于10%飽和中性醋酸鈉溶液中。然后按1: l(v/v)比例加入冷酚溶液，振蕩混勻后離心收集上清液，抽提I?3次至上清液澄清。收集上清液，用超濾膜包超濾去除殘余的苯酚及核酸。超濾后的多糖溶液中加入4mol/L NaCl溶液，至NaCl終濃度為0.3mol/L，然后加入95%乙醇至乙醇終濃度為75%(v/v)，充分混勻后2?8°C靜置過夜，沉淀精糖。離心收集沉淀，然后依次用無水乙醇、丙酮各洗滌兩次，干燥后即為精糖；
將精糖溶解于注射用水中。按多糖:溴化氰=1:0.5(w/w)的比例加入溴化氰溶液。維持溫度23±3°C，pH10.8±0.2反應30分鐘進行活化。活化完成后，按多糖:己二酰肼=1:3.5(w/w)的比例加入2.8%己二酰肼溶液。維持溫度23 ± 3 °C，pH8.5 ± 0.2反應15分鐘進行衍生。澄清過濾后，用0.05mol/L氯化鈉溶液為超濾液，用超濾膜包超濾去除溴化氰，即為多糖衍生物。
[0024]按多糖:蛋白=1:0.8?1.2(w/w)的比例計算破傷風類毒素用量，加入多糖衍生物溶液中，按多糖:碳二亞胺=1: 10(w/w)的比例加入碳二亞胺，維持反應溫度5 ±3°C ;pH5.7 土
0.2，反應60分鐘，然后調節pH至6.9±0.1終止反應。經澄清過濾后，用0.15mol/L氯化鈉溶液為超濾液，用超濾膜包超濾去除碳二亞胺。然后將多糖蛋白結合物溶液用Sepharose 4FF凝膠層析柱純化。以0.15mol/L NaCl溶液為流動相，監測0D280nm的吸收值，收集Vo附近的洗脫峰。合并各次層析收獲的洗脫液后即為純化的結合物，經除菌過濾后，即為C群腦膜炎球菌結合疫苗原液；
S13.制備b型流感嗜血桿菌結合疫苗原液
開啟b型流感嗜血桿菌工作種子批菌種，接種至Hib綜合培養基，溫度35?37 °C，5?8%CO2環境中，培養16?24小時，然后經過三代擴增培養，制備數量適宜的生產用種子，接種至500L發酵罐培養，溫度35?37°C，培養時間6?12小時后加入甲醛殺菌；
將已殺菌的培養液離心收集上清，然后加入十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)至終濃度I.0g/L，充分攪拌后靜置過夜，離心收集多糖;沉淀的多糖用氯化鈉溶液攪拌3小時使多糖和CTAB解離。離心收集上清，上清加入乙醇至終濃度為25%(v/v)，2?8°C靜置過夜，離心收集上清，上清加入乙醇至終濃度為75?80%( v/v)，充分振搖使多糖沉淀，靜置過夜，離心收集沉淀，用無水乙醇和丙酮各洗三次，干燥后即為粗制多糖；
將粗糖溶解于10%飽和中性醋酸鈉溶液中，然后按1: l(v/v)比例加入冷酚溶液，振蕩混勻后離心收集上清液，抽提I?3次至上清液澄清;收集上清液，用超濾膜包超濾去除殘余的苯酚及核酸;超濾后的多糖溶液中加入4mol/L NaCl溶液，至NaCl終濃度為0.3mol/L，然后加入95%乙醇至乙醇終濃度為75%(v/v)，充分混勻后2?8°C靜置過夜，沉淀精糖。離心收集沉淀，然后依次用無水乙醇、丙酮各洗滌兩次，干燥后即為精糖。
[0025]將精糖溶解于注射用水中。按多糖:溴化氰=1:0.5(w/w)的比例加入溴化氰溶液。維持溫度23 ± 3 °C，pH10.8 ± 0.2反應30分鐘進行活化。活化完成后，按多糖:己二酰肼=1:3.5(w/w)的比例加入2.8%己二酰肼溶液。維持溫度23 ± 3°C，pH8.5 ±0.2反應15分鐘進行衍生。澄清過濾后，用0.05mol/L氯化鈉溶液為超濾液，用超濾膜包超濾去除溴化氰，即為多糖衍生物。
[0026]按多糖:蛋白=1:0.8?1.2(w/w)的比例計算破傷風類毒素用量，加入多糖衍生物溶液中，按多糖:碳二亞胺=1: 10(w/w)的比例加入碳二亞胺，維持反應溫度5 ±3°C ;pH5.7 土
0.2，反應60分鐘，然后調節pH至6.9±0.1終止反應。經澄清過濾后，用0.15mol/L氯化鈉溶液為超濾液，用超濾膜包超濾去除碳二亞胺。然后將多糖蛋白結合物溶液用Sepharose 4FF凝膠層析柱純化。以0.15mol/L NaCl溶液為流動相，監測0D280nm的吸收值，收集VO附近的洗脫峰。合并各次層析收獲的洗脫液后即為純化的結合物，經除菌過濾后，即為b型流感嗜血桿菌結合疫苗原液；
52.制備聯合疫苗:將制備的A群腦膜炎球菌結合疫苗原液、C群腦膜炎球菌結合疫苗原液、b型流感嗜血桿菌結合疫苗原液按重量比為1:1:1的比例混合均勻，混合液中加入乳糖，至結合多糖的含量為30yg/0.5mL;其中，A群腦膜炎球菌結合多糖為10yg/0.5mL、C群腦膜炎球菌結合多糖為10yg/0.5mL、b型流感嗜血桿菌結合多糖為10yg/0.5mL；
53.凍干:將凍干機的板層降溫至_50°C，步驟S2制備的聯合疫苗制品預凍4h，預凍后抽真空至0.06mbaH呆持2h，采用三段升溫(TC保持2h，溫持續升溫至32°C，制品溫度達到29°(:后打開真空控制維持溫度保持20h，凍干結束后充氮氣壓蓋出柜，即制得聯合疫苗，其中，中所述三段升溫的第一段溫度為_42°C、第二段溫度為_25°C、第三段溫度為-10°C。
【主權項】
1.一種A群C群腦膜炎球菌b型流感嗜血桿菌聯合疫苗的制備方法，其特征在于，它包括以下步驟: 51.制備單價疫苗原液:包括制備A群腦膜炎球菌結合疫苗原液、制備C群腦膜炎球菌結合疫苗原液、制備b型流感嗜血桿菌結合疫苗原液； 52.制備聯合疫苗:將制備的A群腦膜炎球菌結合疫苗原液、C群腦膜炎球菌結合疫苗原液、b型流感嗜血桿菌結合疫苗原液按重量比為1:1:1的比例混合均勻，混合液中加入乳糖，至結合多糖的含量為30yg/0.5mL; 53.凍干:將凍干機的板層降溫至-45?-55°C，步驟S2制備的聯合疫苗制品預凍3.5?4.5h，預凍后抽真空至0.05?0.08mbar保持1.5?2.5h，采用三段升溫O°C保持1.5?2.5h， 溫持續升溫至28?35°C，制品溫度達到28?30°C后打開真空控制維持溫度保持15?25h，凍干結束后充氮氣壓蓋出柜，即制得聯合疫苗。2.如權利要求1所述的一種A群C群腦膜炎球菌b型流感嗜血桿菌聯合疫苗的制備方法，其特征在于，步驟S2中A群腦膜炎球菌結合多糖為10yg/0.5mL、C群腦膜炎球菌結合多糖為10yg/0.5mL、b型流感嗜血桿菌結合多糖為10yg/0.5mL。3.如權利要求1所述的一種A群C群腦膜炎球菌b型流感嗜血桿菌聯合疫苗的制備方法，其特征在于，步驟S3中所述三段升溫的第一段溫度為-50?-30°C、第二段溫度為-30?-200C、第三段溫度為-20?O °C。
【文檔編號】A61P31/04GK106075421SQ201610622999
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年8月2日 公開號201610622999.2, CN 106075421 A, CN 106075421A, CN 201610622999, CN-A-106075421, CN106075421 A, CN106075421A, CN201610622999, CN201610622999.2
【發明人】吳強, 陳道遠, 李晟, 陳元芬
【申請人】成都歐林生物科技股份有限公司