一種魚類疫苗的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種魚類疫苗的制備方法，尤其涉及一種以殼聚糖納米微粒為載體的魚類疫苗的制備方法。
【背景技術】
[0002]魚類疫苗可通過三種途徑免疫魚體:腹腔注射、浸泡和口服。由于養殖面積大，注射需消耗大量的勞動力，對魚類的損傷也是避免不了的。浸泡則將消耗大劑量的疫苗，疫苗也會因養殖水體中的各種物質所消耗、沉積產生巨大的經濟虧損。而口服疫苗，雖然使用不受時間地點和魚的大小的限制，但當疫苗到達胃腸道后被破壞，又降低了疫苗的免疫效果。但如今口服疫苗又是免疫魚體最有效，最容易突破的方法，由此新型的疫苗開始蓬勃發展，以疫苗微球技術為例，它是一種用成膜材料把固體或液體包覆成微小粒子的技術，特點是囊心與外界隔絕具有保護功能并且利于囊心的貯存運輸。
[0003]口服疫苗微球不僅能夠引起全身及黏膜免疫反應，而且給藥安全、方便。目前，研宄較多的微球系統有聚乳酸微球、聚羥基乙酸微球、聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物微球和聚乳酸-聚乙二醇共聚物微球。但是，這些聚合物載體存在一些問題:(I)載體和抗原的結合需要使用有機溶劑，而有機溶劑會引起抗原變性；(2)屬于疏水性聚合物體系，對蛋白質包封率低；抗原蛋白在聚合物載體釋放中，突釋效應較為明顯；(3)聚合物水解降低溶液pH值，使抗原變性。殼聚糖除具有良好的生物黏附性、生物相容性、安全性外，還可以通過打開細胞間緊密連接，增強藥物的膜通透性。另外，殼聚糖微球在酸性環境下穩定，不會破壞抗原，加載抗原時只需在水相中混合，不必與有機溶劑接觸。由于殼聚糖具有以上諸多優良性能，使其成為口服疫苗載體的首選對象。

【發明內容】

[0004]本發明的目的在于提供一種使用殼聚糖作為載體的魚類疫苗的制備方法，可以很好地包覆疫苗，作為魚類疫苗載體，該方法所需設備少，反應條件溫和，成本低，包封率高，產品的安全性好。
[0005]本發明是通過如下技術方案實現的:
一種魚類疫苗的制備方法，包括如下步驟:
(1)取醋酸鈉54.6g，加lmol/L醋酸溶液20ml進行溶解，再加水稀釋至500ml，制得pH=6.0的乙酸/乙酸鈉緩沖液；
(2)用步驟(I)制得的乙酸/乙酸鈉緩沖液作為溶劑溶解殼聚糖，制得濃度為2mg/ml的殼聚糖溶液；再向2mg/ml的殼聚糖溶液中加入TWeen80，使得殼聚糖溶液中TWeen80的質量分數為0.5-1.5 % ；
(3)取3ml魚類疫苗藥液與2-5ml濃度為50mmol / L的硫酸鈉溶液混勻，加入到8-12 ml步驟(2)制得的殼聚糖溶液中，邊加邊攪拌，攪拌速度為800r/min，再向其中逐滴滴加2mg/ml的三聚磷酸鈉溶液3-8ml，溶液變成乳光懸液，再向其中逐滴滴加復合醇0.3-0.6ml，繼續攪拌8-15min，進行超聲分散，得到分散液；
(4)將步驟(3)得到的分散液再以10000r/min的轉速高速離心20min，取離心后的沉淀用蒸餾水進行洗滌，再向洗滌后的沉淀中加入NaCl和蒸餾水，使NaCl的質量分數為0.9%，即得；
所述的復合醇中各原料體積比為乙醇:1，2-丙二醇=1:5-8。
[0006]殼聚糖分子中含有游離氨基，其氮原子上存在I對孤對電子，使氨基呈弱堿性，所以殼聚糖能結合I個氫原子，成為帶正電荷的電解質。在制備口服疫苗微球過程中，殼聚糖微球通過氫鍵、疏水作用以及離子間相互作用結合抗原蛋白質，具有較高的包封率，加入特定比例的復合醇可進一步提尚包封率。
[0007]殼聚糖能和帶負電的三聚磷酸鹽在非常溫和的條件下，通過離子膠凝作用形成納米粒；而且可通過靜電作用將大量蛋白包裹進這種納米粒中。
[0008]本發明使用pH為6的乙酸/乙酸鈉緩沖液溶解殼聚糖，使得溶液的PH不會過低，減小了在魚類疫苗藥液混合的過程中PH過低對疫苗的破壞。
[0009]本發明利用粒子凝膠制備包覆魚類疫苗的殼聚糖納米微粒，反應條件溫和，制備方法簡單，使用設備少，具有不破壞抗原、包封率高的優點。
[0010]具體實施
實施例1:一種魚類疫苗的制備方法，包括如下步驟:
(1)取醋酸鈉54.6g，加lmol/L醋酸溶液20ml進行溶解，再加水稀釋至500ml，制得pH=6.0的乙酸/乙酸鈉緩沖液；
(2)用步驟(I)制得的乙酸/乙酸鈉緩沖液作為溶劑溶解殼聚糖，制得濃度為2mg/ml的殼聚糖溶液；再向2mg/ml的殼聚糖溶液中加入TWeen80，使得殼聚糖溶液中TWeen80的質量分數為I % ;
(3)取3ml魚類疫苗藥液與3ml濃度為50mmol/ L的硫酸鈉溶液混勻，加入到1ml步驟(2)制得的殼聚糖溶液中，邊加邊攪拌，攪拌速度為800r/min，再向其中逐滴滴加2mg/ml的三聚磷酸鈉溶液5ml，溶液變成乳光懸液，再向其中逐滴滴加復合醇0.5ml，繼續攪拌lOmin，進行超聲分散，得到分散液；
(4)將步驟(3)得到的分散液再以10000r/min的轉速高速離心20min，取離心后的沉淀用蒸餾水進行洗滌，再向洗滌后的沉淀中加入NaCl和蒸餾水，使NaCl的質量分數為0.9%，即得；
所述的復合醇中各原料體積比為乙醇:1，2-丙二醇=1:6。
[0011]用考馬斯亮藍法測定包封率為95.6%。
[0012]實施例2:—種魚類疫苗的制備方法，包括如下步驟:
(1)取醋酸鈉54.6g，加lmol/L醋酸溶液20ml進行溶解，再加水稀釋至500ml，制得pH=6.0的乙酸/乙酸鈉緩沖液；
(2)用步驟(I)制得的乙酸/乙酸鈉緩沖液作為溶劑溶解殼聚糖，制得濃度為2mg/ml的殼聚糖溶液；再向2mg/ml的殼聚糖溶液中加入TWeen80，使得殼聚糖溶液中TWeen80的質量分數為0.5 % ;
(3)取3ml魚類疫苗藥液與2ml濃度為50mmol / L的硫酸鈉溶液混勻，加入到8 ml步驟(2)制得的殼聚糖溶液中，邊加邊攪拌，攪拌速度為800r/min，再向其中逐滴滴加2mg/ml的三聚磷酸鈉溶液3ml，溶液變成乳光懸液，再向其中逐滴滴加復合醇0.3 ml，繼續攪拌8 min，進行超聲分散，得到分散液；
(4)將步驟(3)得到的分散液再以10000r/min的轉速高速離心20min，取離心后的沉淀用蒸餾水進行洗滌，再向洗滌后的沉淀中加入NaCl和蒸餾水，使NaCl的質量分數為0.9%，即得；
所述的復合醇中各原料體積比為乙醇:1，2-丙二醇=1:5。
[0013]用考馬斯亮藍法測定包封率為91.2%。
[0014]實施例3:—種魚類疫苗的制備方法，包括如下步驟:
(1)取醋酸鈉54.6g，加lmol/L醋酸溶液20ml進行溶解，再加水稀釋至500ml，制得pH=6.0的乙酸/乙酸鈉緩沖液；
(2)用步驟(I)制得的乙酸/乙酸鈉緩沖液作為溶劑溶解殼聚糖，制得濃度為2mg/ml的殼聚糖溶液；再向2mg/ml的殼聚糖溶液中加入TWeen80，使得殼聚糖溶液中TWeen80的質量分數為1.5 % ;
(3)取3ml魚類疫苗藥液與5ml濃度為50mmol / L的硫酸鈉溶液混勻，加入到12 ml步驟(2)制得的殼聚糖溶液中，邊加邊攪拌，攪拌速度為800r/min，再