一種防齲齒蛋白疫苗及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于醫藥生物技術領域，特別涉及一種預防齲齒的蛋白疫苗及其制備方 法。
【背景技術】
[0002] 齲齒和心血管疾病、癌癥并稱為人類三大疾病。在中國，80%的兒童、50%的成人、 98%的老年人都不同程度受其困擾。要達到齲齒的有效預防，除了降低碳水化合物攝入、 利用氟化物增強牙齒對酸的抵抗力和采用密封劑減少致病菌在齒溝的定植之外，使用抗菌 物質減少或者消滅致齲微生物是科學家數十年來研宄的重點，齲齒疫苗的研發更是重中之 重，但到目前為止，仍然沒有一種疫苗能夠在臨床應用。
[0003] 齲齒疫苗的研發是隨著對致齲微生物的逐漸認識而進行的，變形鏈球菌 (Streptococcusmutans,S.Mutans)是主要的致願微生物，其致願性主要表現在對牙面的 黏附、產酸、耐酸以及產生多糖和細菌素等方面，針對變形鏈球菌的疫苗種類較多。早期，科 學家們嘗試將完整的變形鏈球菌滅活，作為經口途徑的疫苗使用，但是因為變形鏈球菌有 能與心肌特別是心脂質和肌纖維膜鞘交叉反應的抗原，導致接種者死亡的潛在危險而不被 接受；隨后，DNA重組技術被用來將致齲微生物的抗原成分重組到非致齲、無交叉反應的良 性細菌（如乳酸桿菌等）中，但是沒有足夠證據能夠保證所謂的良性細菌足夠安全；20世 紀90年代初出現DNA疫苗，其基本原理是將外源性基因直接導入宿主細胞內，誘導宿主免 疫系統對目的基因所表達的蛋白發生免疫反應，達到預防疾病的目的。DNA疫苗具有免疫 原性強、可激發全面持久的免疫應答、可制備成多價疫苗、制備簡單等優點。但是，目前為止 DNA免疫所得到的結果還很不均一，有的DNA疫苗能起到很好的保護作用，有的卻保護不明 顯，甚至還有免疫自然宿主反而加重了病毒感染的報道。因此，DNA免疫尚處于探索時期， 所有的動物、表達載體、基因片段等均不相同，結果差別甚大。
[0004] 近來，多種以S. Mutans抗原為基礎的防齲疫苗可顯著降低動物齲齒發生 率，抗原主要有：表面蛋白抗原I/II(Ag 1/11)、葡糖基轉移酶（GTF)和葡聚糖結合 蛋白（GBP)等抗原分子（Hajishengallis G. Infect Immun, 1998,66(4) : 1740-1743 ; Katz J. Infect Immun, 1993,61 (5) : 1964-1971 ；Childers NK.Oral Microbiol Immunol, 2006, 21 (5) : 309-313 ；Childers NK. J DentRes, 2002, 81 (1) : 48-52.； Peacock ZS.Oral Microbiol Immunol, 2005, 20 (1) :60-64 ；Smith D J. Infect Immun, 2005, 73(5) : 2797-2804)。葡糖基轉移酶（Glucosyltransferase，GTF)是變形鏈球 菌合成的重要致齲因子，催化蔗糖合成包括葡聚糖在內的多種胞外多糖。GTF結構包括催 化區（Catalytie，Cat)和葡聚糖結合區（Glucan binding，Glu)兩個功能區段。催化活 性區具有催化蔗糖水解的活性，能夠催化蔗糖產生葡聚糖；葡聚糖結合區與葡聚糖結合， 這種結合是特異性，不可逆的，且結合力非常強，由此介導了變形鏈球菌之間、菌體與葡聚 糖、菌體與牙面之間的相互作用，從而使變形鏈球菌粘附、聚集在牙齒的表面并產酸，酸引 起牙齒表面脫礦，最終導致齲病的發生，是齲病發生的主要因素。Glu具有良好的免疫原 性和免疫保護性，其可高效誘導抗GTF抗體，從而抑制GTF合成葡聚糖的能力，減少菌斑形 成（Xu QA，Vaccine. 2007Jan26 ;25(7):1191-5 ;Jespersgaard C，Infect Immun. 1999Feb ； 67(2) : 810-6 ;Taubman MA, Infect Immun. 2001 Jul ;69 (7) : 4210-6.)。因此，抑制 GTF 催化 合成葡聚糖有可能預防齲病的發生。

【發明內容】

[0005] 本發明的一個目的是提供一種防齲齒蛋白疫苗，其活性成分為SEQ ID N0 :1所示 的蛋白質。
[0006] 本發明的另一個目的是提供以上防齲齒蛋白疫苗的制備方法，其主要包含步驟：
[0007] 1)通過PCR方法，從變形鏈球菌UA159基因組擴增水不溶性葡萄糖基轉移酶葡萄 糖結合區Glu基因片段，擴增引物序列如下：
[0008] 上游引物
[0009] 5'-CGC GGATCC ATGGGCTATCAAGCCAAAG-3r
[0010] 下游引物
[0011] 5'-CCG CTCGAG AATCCGAACTCGTTCTCCAG-3r
[0012] 2)將所述Glu基因片段構建到含有6-His組氨酸標簽的表達載體上，得到重組質 粒，轉化至表達菌，酶切鑒定；
[0013] 3)誘導表達可溶性的重組蛋白；
[0014] 4)純化步驟3獲得的重組蛋白，冰浴攪拌透析換液，除去咪唑。
[0015] 所述步驟（2)中的含6-His組氨酸標簽的表達載體為pET28a質粒，表達菌為 E. coli DH5 a 〇
[0016] 優選的，步驟（3)具體為：挑取含有目的蛋白的重組子的單克隆，轉入卡那霉素陽 性的LB液體培養基，37°C過夜震蕩培養；再接種至新鮮配制的卡那霉素陽性的LB液體培養 基中，37°C搖床震蕩過夜，增菌，待A6000D值為0. 4-0. 6時，加入IPTG終濃度為0. lmmol/ L-l. Ommol/L，15°C -37°C繼續培養 4-16 小時。
[0017] 優選的，步驟（3)具體為：挑取含有目的蛋白的重組子的單克隆，轉入卡那霉素陽 性的LB液體培養基，37°C過夜震蕩培養；再接種至新鮮配制的卡那霉素陽性的LB液體培養 基中，37°C搖床震蕩過夜，增菌，待A6000D值為0. 4-0. 6時，加入IPTG終濃度為0. 3mmol/L， 15°C繼續培養16小時。
[0018] 優選的，步驟（4)具體為：4°C，8000rpm離心5分鐘收集誘導后的菌體，去上清，用 binding buffer洗絳一次，根據菌體的量，選擇適量的binding buffer重懸菌體；冰浴環 境下，超聲破碎，收集蛋白粗液；l〇〇〇〇rpm，30min，4°C離心破碎液，收集上清，并經0. 45 y m 過濾器過濾，冰浴備用；使用lml HisTrap FF鎳柱以及AKTApurifier 10儀器進行純化， SDS-PAGE電泳，分析目的蛋白的純度；冰浴攪拌透析換液，除去咪唑。
[0019] 本發明通過對新型防齲重組蛋白疫苗的構建，同時對可溶性蛋白疫苗的表達和純 化步驟進行優化，建立了一種新型防齲蛋白疫苗的規模化制備方法，該方法適用于大規模 制備人用防齲蛋白疫苗，安全高效，具有良好的開發和應用前景。本發明所構建和純化得到 的重組蛋白疫苗，將為后續研宄蛋白疫苗的免疫效應提供充足的物質基礎。
【附圖說明】
[0020] 圖1為Glu基因PCR擴增結果圖，圖中M為DNA marker，1為Glu基因目的片段；
[0021] 圖2為Xholl和BamHI雙酶切質粒、Glu基因PCR擴增片段結果，圖中M為DNA marker，1為載體pET28a經Xholl和BamHI雙酶切，2為Glu經BamHI和Xholl雙酶切；
[0022] 圖3為不同溫度下誘導表達蛋白的SDS-PAGE圖，M為蛋白分子量，1、3、5分別代 表未經IPTG誘導，30°C，37°C，15°C下含pET28a-Glu的大腸桿菌的蛋白帶；2、4、6分別代表 30°〇，371：，151：下用111111?了6誘導含口￡了28&-6111的大腸桿菌的蛋白帶 ；
[0023] 圖4為Glu在15°C時經不同IPTG濃度誘導表達重組蛋白的SDS-PAGE圖，M為蛋 白分子量，1為誘導前的細菌裂解液，2為經IPTG = 0.1 mM誘導的細菌裂解液上清，3為經 IPTG = 0.1 mM誘導的細菌裂解沉淀，4為經IPTG = 0. 3mM誘導的細菌裂解液上清，5為經 IPTG = 0. 3mM誘導的細菌裂解液沉淀；
[0024] 圖5為Glu金屬螯合層析SDS-page結果，圖中M為蛋白Marker，1為Glu誘導前， 2為Glu超聲上清，3為Glu超聲沉淀，4為Glu流穿峰，5為Glu洗滌峰，6為Glu洗脫峰；
[0025] 圖6蛋白疫苗Glu純化后SDS-PAGE圖；
[0026] 圖7為蛋白疫苗免疫小鼠后血清中特異性抗體產生水平，A為PCIA-P DNA疫苗免 疫組，B為rPAc蛋白免疫，