專利名稱：作為疫苗的hiv嵌合融合蛋白的制作方法
技術領域：
本發明主 要涉及人類免疫缺陷性病毒(HIV)疫苗；更具體而言，本發明涉及一種 可誘導體液及細胞介導免疫反應的HIV嵌合融合蛋白。
背景技術：
獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)蔓延全球，使我們急需可抵抗第一型人類免疫缺 陷性病毒(HIV-I)的疫苗。此外，AIDS疫苗可能必須產生有效率的體液及細胞免疫反應才 能有效。HIV疫苗所誘導的保護性免疫反應，主要應實現以病毒中和抗體及抗HIV細胞毒性 (CD8+)T淋巴細胞(CTLs)介導的免疫。HIV的病毒蛋白是由多個主要基因予以編碼。gag基因負責編碼病毒殼體蛋白 P24、核殼蛋白p6與p7，以及基質蛋白pl7。pol基因負責編碼反轉錄酶、嵌入酶，以及可將 衍生自gag與pol的蛋白切割為功能性蛋白的蛋白酶。env基因負責編碼gpl20與gp41的 前驅蛋白，其中gpl20與gp41是內嵌于病毒包膜的包膜蛋白，并使病毒得以附著并融合于 靶細胞。tat、rev、nef、vif、Vpr, vpu基因則分別編碼同名的單一蛋白Tat、Rev、Nef、Vif、 Vpr 與 Vpu0通過HIV-I感染試驗的動物模型，已證實中和抗體有助于預防病毒感染。在 第一型人類免疫缺陷性病毒中，可與中和抗體結合的病毒特異性靶點為包膜糖蛋白 (Yang, X.等人(2005) "Stoichiometry of Antibody Neutralization of Human Immonodeficiency Virus Type 1” ( “第一型人類免疫缺陷性病毒的抗體中和反應的化學 計量”)，Journal of Virology (“病毒學期刊”)，79 :3500_3508)。在感染 HIV-1 的一般 過程中常會產生病毒中和抗體，但中和效價往往偏低。大部分的中和抗體可與gpl20包膜 糖蛋白結合，而gpl20包膜糖蛋白正是病毒包膜糖蛋白三聚物的主要外露蛋白。此外，中和 抗體的靶點還包括HIV-lgpl20糖蛋白其保守性較高的受體結合表面。例如，CD4結合位點 (CD4BS)抗體可識別由數個重迭于CD4結合位點的gpl20區片段所構成的結構表位，而CD4 所誘導(CD4i)的抗體則可與高度保守的gpl20片段結合，該片段與趨化因子受體相互作用 高度相關。CDBS與CD4i抗體可干擾受體的結合，因而具有中和的能力。Gpl20包含十個結構域具保守性的結構域1-5(C1_C5)及具可變性的結構域 1-5(V1-V5)，其中結構域Cl與C5分別位于gpl20的N端(N-terminal，氨基端)與C端 (C-terminal，羧基端)。以V3環(其負責選定趨化因子受體)為靶點的抗體可阻斷gpl20 結合至受體CCR5和/或CXCR4，因而具有中和的效力，但往往僅限于對少數的HIV-I病毒株 有效。Gp 120是以非共價方式與gp41連結，而gp41亞單位則固定于膜內，且gp41亞單 位的N端具有非極性融合肽。gpl20-gp41復合體于受感染的細胞表面或于病毒粒子上形 成寡聚物。一般均認為，gpl20結合于gp41時即啟動gp41的膜融合活性，使病毒核殼得以 進入細胞。因此，HIV感染者血清內的gp41表位抗體有可能在病毒中和反應中扮演重要角 色。在不同HIV亞型的gpl20-41復合體序列中，均顯示gp41具有高度保守的N端卷曲螺旋結構，以及可與gpl20的N端核心結構相互作用的C端殘基。HIV感染的防治與清除涉及諸多免疫效應子。例如，若欲防止宿主靶細胞受到感 染，須使用抗體；而在首批靶細胞感染病毒后，則須以細胞毒性T淋巴細胞及抗體共同殺死 受感染的細胞。有效的HIV疫苗除應誘導可與病毒結合的抗體，以防止病毒附著于靶細胞 夕卜，還應誘導可消滅任何受感染細胞的細胞毒性T淋巴細胞。 疫苗學家迄今仍難以建構有效且安全的活性減毒疫苗，或模擬病毒蛋白在重組抗 原感染實例(或由載有適當基因或抗原的復制或非復制載體加以感染的實例)中的表現。 此外，gpl20其V3結構域中的大量突變，也限制了其作為HIV疫苗的靶點的實用性。再者， 可變結構域的高可變性趨勢如何發展？在HIV病毒株演化過程中究竟有多少結構域是絕 對不變的？這些問題也沒有明確的答案。因此，如何解決HIV疫苗抗原生產的不足，尤其是提供有效的抗原決定簇肽，的確 是相關領域中的重要課題。

發明內容
在決定中和表現型時，gpl20與gp41的相互作用極為重要，本發明的發明人對此 已詳加研究。本發明的一個方面是關于一種嵌合融合蛋白，其可用作免疫原，用于誘導對 HIV抗原具有專一性的免疫反應。該嵌合體包含(a)第一多肽區，其包含假單胞菌外毒素 A(Pseudomonas Exotoxin A ；ΡΕ)結合結構域與PE轉運結構域，且位于該融合蛋白的N端； 和(b)第二多肽區，其位于該融合蛋白的C端，且包括(i)第一肽段，其包含gpl20Cl結構 域的片段，且位于該第二多肽區的N端；(ii)第二肽段，其包含gpl20C5結構域的片段，且 位于該第一肽段的C端；和(iii)第三肽段，其包含gp41氨基酸序列的片段，且位于該第二 肽段的C端，其中所述第二多肽區包含抗原決定簇，該抗原決定簇對HIV的一種亞型具有專 一性。該HIV亞型為選自HIV亞型A、B、C、D、E、F、G、H、J與K中的至少一種。在本發明的一個實施例中，該融合蛋白進一步包括位于C端的內質網保留序列， 例如氨基酸序列KDEL。在本發明的另一個實施例中，該嵌合融合蛋白進一步包括中間多肽 區，該中間多肽區位于第一多肽區與第二多肽區之間，且包含非Env的HIV抗原決定簇。在 本發明的一個實施例中，該中間多肽區為選自Gag24、Nef、Tat與Rev中的至少一種。在本 發明的另一實施例中，該中間多肽區包括Gag24氨基酸序列或其片段。在本發明的另一個 實施例中，該中間多肽區包含Gag24氨基酸序列的N端或C端。在本發明的一個實施例中， 該中間多肽區包含SEQ ID NO: 151所述的氨基酸序列。本發明的另一方面是關于一種HIV嵌合融合蛋白，其可用作免疫原，用于誘導對 HIV抗原具有專一性的免疫反應，其中該HIV嵌合融合蛋白包括(a)第一多肽區，其包含 PE結合結構域與PE轉運結構域，且位于該融合蛋白的N端；和(b)第二多肽區，其包含HIV 蛋白或其片段，且位于該融合蛋白的C端，其中所述第二多肽區包含抗原決定簇，該抗原決 定簇對HIV的一種亞型具有專一性。在本發明的一個實施例中，第二多肽區包含HIV Env的片段。在本發明的另一個 實施例中，所述第二多肽區包含gpl20V3結構域的一個或多個片段。在本發明的另一個實 施例中，所述第二多肽區包含SEQ ID NO :6所述的氨基酸序列。在本發明的一個實施例中， 所述第二多肽區包含HIV蛋白或其片段，且該HIV蛋白選自Gag24，Nef, Tat與Rev中。
在本發明的另一個實施例中，第二多肽區包含HIV Gag24氨基酸序列或其片段。在本發明的另一個實施例中，所述第二多肽區是一種嵌合蛋白，其包括(i)第一肽段，其 包含gpl20Cl結構域的片段，且位于該第二多肽區的N端；(ii)第二肽段，其包含gpl20C5 結構域的片段，且位于該第一肽段的C端；和(iii)第三肽段，其包含gp41氨基酸序列的片 段，且位于該第二肽段的C端。在本發明的又一個實施例中，所述第二多肽區包含SEQ ID NO :7所述的氨基酸序列。本發明的另一方面是關于一種用以誘導對HIV抗原具有專一性的免疫反應的方 法，其步驟為通過具有生物相容性的載液，施用有效量的上述嵌合融合蛋白，其中該載液適 合將該融合蛋白的預定等分部分運載并傳送至活體受試者體內的預選位點。在一并參閱以下優選實施例的詳細說明及附圖后，本發明的上述及其它方面將更 加明顯；然而，本領域技術人員也可加以變化及修改而不脫離本發明的新穎概念的實質與 范圍。附圖顯示了本發明的一種或多種實施例，這些附圖的作用為結合相關文字敘述以 說明本發明的原理。在所有附圖中，已盡可能使用相同的附圖標記來表示實施例中的相同 或相似組件。


圖IA至IF是HIV嵌合融合蛋白編碼質粒的圖譜。圖2A顯示動物血清樣本以酶聯免疫吸附測定(ELISA)測得的效價，其中動物血清 是采自以不同HIV嵌合包膜融合蛋白免疫的動物，且血清樣本的稀釋比例為1 2，500。圖2B顯示動物血清樣本以ELISA測得的效價，其中動物血清是采自以不同HIV嵌 合包膜融合蛋白免疫的動物，而血清樣本的稀釋比例則為1 12，500。圖3顯示小鼠經HIV Env融合蛋白疫苗免疫后產生可抵抗活性病毒的中和抗體。圖4 是建構 ρΡΕ( Δ IID-HIV gag24_K3 的流程圖。圖5 是建構 ρΡΕ( Δ IID-HIV gag24_gp 120-41-K3 的流程圖。圖6是HIV抗原決定簇肽融合于gpl20Cl-C5-gp41后生成嵌合體的示意圖，該嵌 合體可強化該抗原決定簇肽的細胞介導免疫反應。圖 7 是建構 ρΡΕ( Δ IID-HIV nef-NC_K3 的流程圖。
具體實施例方式本說明書所用的術語，其在本發明范圍內及在本說明書特定上下文中的解釋大致 依照各術語于本領域中的通常涵義。本說明書中用以描述本發明的特定用語將于下文中 或于本說明書他處加以說明，以利業界人士了解本發明的相關敘述。為便于閱讀，特定用 語可能以斜體字和/或引號等格式特別標示，但使用特別標示并不影響該用語的范圍及涵 義。這些用語不論是否經特別標示，其在相同上下文中的范圍及涵義均相同。在本文中，相 同的文意可以不同方式表達。因此，本文所述的用語皆可以其替代用語及同義詞取代，且一 用語是否在本文中經詳細說明或討論，并無任何特別意義。在此將提供特定用語的同義詞， 然而，使用某一同義詞不代表排除其它同義詞。本說明書所提出的實施例，包括在此所討論 的用語范例，僅出于說明的目的，而非用于限制本發明或任何示例用語的范圍與涵義。同樣地，本發明同樣不限于在此所列舉的實施例除非另行定義，否則在此所用的所有技術與科學用語的涵義均與本發明相關領域 內的技術人員所普遍了解的相同。若有相互沖突之處，則以本說明書及其所提供的定義為 解釋依據。在本文中，“約略”、“大約”或“概為”一般是指一已知數值或范圍的百分之二十以 內，優選為百分之十以內，更優選為百分之五以內。本文所列的數量為約略值，意指即使未 書明“約略”、“大約”或“概為”等用語，仍包含這些用語的涵義。在本文中，“羧基端部分使融合抗原得以保留在靶細胞的內質網(ER)膜上”是指肽 片段可使該融合抗原結合于該ER膜并將其保留于ER腔內以實現糖基化作用，同時使該融 合抗原看起來更接近外來蛋白質。在本發明的一個實施例中，該羧基端部分包含下列氨基 酸殘基，其沿氨基端至羧基端的方向依次為R1-R2-R3-R4- (R5)n其中R1為帶正電的氨基酸殘基；R2為帶負電的氨基酸殘基；R3為帶負電的氨基酸殘基；R4 為 L ；R5為帶正電的氨基酸殘基；且η 為 0 或 1。優選地，該羧基端部分為KDEL家族蛋白中的一員。在此所述的“KDEL家族蛋白” 是指一個蛋白群組，其具有可與細胞ER膜結合的相似羧基端，且進一步具有可將該蛋白 保留于ER腔內的能力。通常，該羧基端的長度介于4至16個殘基之間。如美國專利第 5，705，163號所述(在此以引用的方式將其全文并入本文)，KDEL家族蛋白其羧基端上的 氨基殘基(尤其是最后五個氨基酸中的氨基殘基)至關重要。針對存在于不同分子中且可 執行特定生物機能的相似序列所做的研究顯示，一種可在內質網中保留新生成蛋白的序列 為Lys Asp Glu Leu(KDEL)。此發現說明本發明融合抗原的羧基端序列可作為某種型態的 識別序列，以協助融合抗原從內吞區室移入ER并將其留置于腔內。該羧基端部分包含KDEL 序列。例如，該羧基端部分可包含序列KKDLRDELKDEL(SEQ ID NO :250)、KKDELRDELKDEL (SEQ ID NO 251), KKDELRVELKDEL (SEQ ID NO 252)或 KKDELRXELKDEL，其中 R 為 D 或 V。術語“ΡΕ( Δ IID-HIV gpl20” 與 “ΡΕ ( Δ III)-HIV gpl20V3_V3” 可交替使用。術語“ΡΕ (Δ III)-HIV gpl20_41” 與"ΡΕ ( Δ III)-HIV gpl20Cl_C5-gp41，，可交替 使用。術語“HIV亞型A gpl20Cl-C5-gp41”與“嵌合體Α”可交替使用；術語“HIV亞型B gpl20Cl-C5-gp41”與“嵌合體B”可交替使用；術語“HIV亞型C gpl20Cl_C5-gp41 ”與“嵌 合體C”可交替使用；依此類推。免疫原為配制免疫原，僅須將本文所述的融合蛋白產物與生物相容性載液混合 即可，只要該生物相容性載液適合將該融合蛋白產物的預定等分部分運載并傳送至活體受 試者體內的預選位點。本發明的免疫原可利用適當的載體，以皮內、肌內、腸胃外、鼻內、陰 道內、直腸內、經口或灌胃等方式施用。這些免疫原可以任何在人體內產生抗原性的方式導入，施用劑量則視情況而有所不同，取決于接受者的年齡、健康狀況與體重；同時進行的 療法類別(若有的話)；治療頻率；及所需體液抗體反應的性質。這些免疫原若需以皮內、 皮下、肌內、經靜脈或腸胃外等方式施用，應以無菌形態制備，采用多劑或單劑的形式，并分 散于例如無菌生理食鹽水或注射時常用的5%葡萄糖溶液等載液中。除此之外，也可采用其 它有利的施用方法。疫苗制備疫苗時，其配方至少包含本文所述的融合蛋白產物，其用量為預定； 生物相容性載液，其可將該融合蛋白產物的預定等分部分運載并傳送至活體受試者體內的 預選位點；及至少一種佐劑組合物，其分散于該載液中或與該融合蛋白產物結合。根據定 義，該疫苗含有免疫原，且包括一種或多種佐劑，用于促進或激發免疫反應并延長活體內的 抗原效果。在常用的佐劑物質中，適用的是經美國食品藥物管理局(FDA)核準的組合物(包 括現已用于或尚未用于全身和/或黏膜免疫的組合物)。部分佐劑適用于經黏膜施用的疫 苗，而部分佐劑則適用于以灌胃方式施用的疫苗。施用方式目前已有多種熟知且慣用的接種方式(也就是導入免疫原或疫苗的方 式)。全身性或腸胃外的施用方式(也就是經注射或灌注而導入的方式)基本上包括腹膜 內接種、靜脈接種、肌內接種、皮下接種與真皮下接種。至于經黏膜施用方式，不僅包括鼻內 及灌胃等導入方式，也包括經口或由陰道內及直腸內導入。
實施例以下所述僅為根據本發明實施例所提供的例示用設備、器材、方法及相關結果，不 應視為對本發明的限制。各實施例的標題或子標題僅為方便閱讀之用，同樣不應視為對本 發明的限制。此外，本文雖述及若干學說，但只要本發明是依據其本身實施，而非依據特定 的學說或實施方案，則該等學說無論正確與否，均不應視為對本發明的限制。I. HIV-lgpl20 與 gp41 融合蛋白實施例1 選取HIV Env蛋白gpl20與gp41的截短片段HIV gpl20與gp41的氨基酸序列是取自美國國家生物科技信息中心(NCBI，USA) 的數據庫并輸入軟件中，以評估靶蛋白的抗原決定簇(表位)，并在評估圖上顯示可用于 合成的候選片段。在選取靶蛋白上可供合成的抗原決定簇區域時，是使用逆向基因工程技 術，然后根據評估軟件的評估結果，選出若干肽片段作為靶肽。之后再以軟件DNA strider vl. 0分析靶肽的核苷酸序列是否包含限制性內切酶位點；若其出現在DNA序列中的位置并 不理想，則在適當的密碼子內加以調整而不改變氨基酸序列。接著以軟件檢查新產生的序 列，并于該DNA序列的兩端設計出限制位點以便進行克隆。部分氨基酸殘基(如Arg、Ile、 Gln與Pro)的密碼子是經改造以增強蛋白在大腸桿菌(E. coli)表達系統中的表達。表1 列出所選的肽片段及其對應的氨基酸序列。表 權利要求
一種嵌合融合蛋白，其可用作免疫原，用于誘導對HIV抗原具有專一性的免疫反應，該融合蛋白包含(a)第一多肽區，其包含假單胞菌外毒素A(PE)結合結構域與PE轉運結構域，且位于該融合蛋白的N端；和(b)第二多肽區，其位于該融合蛋白的C端，且包括(i)第一肽段，其包含gp120C1結構域的片段，且位于該第二多肽區的N端；(ii)第二肽段，其包含gp120C5結構域的片段，且位于該第一肽段的C端；和(iii)第三肽段，其包含gp41氨基酸序列的片段，且位于該第二肽段的C端，其中，所述第二多肽區包含抗原決定簇，其對HIV的一種亞型具有專一性。
2.如權利要求1所述的融合蛋白，在該融合蛋白的C端進一步包含內質網保留序列。
3.如權利要求1所述的融合蛋白，其中，所述HIV的一種亞型是選自HIV亞型A、B、C、 D、E、F、G、H、J與K中的至少一種。
4.如權利要求1所述的融合蛋白，其進一步包含中間多肽區，該中間多肽區位于所述 第一多肽區與第二多肽區之間，其中，該中間多肽區包含非Env的HIV抗原決定簇。
5.如權利要求4所述的融合蛋白，其中，所述中間多肽區包含HIV蛋白或其片段，其為 選自Gag24、Nef、Tat與Rev中的至少一種。
6.如權利要求4所述的融合蛋白，其中，所述中間多肽區包含Gag24氨基酸序列或其片段。
7.如權利要求6所述的融合蛋白，其中，所述中間多肽區包含Gag24氨基酸序列的N端 或C端。
8.如權利要求4所述的融合蛋白，其中，所述中間多肽區包含SEQID N0:151所述的氨基酸序列。
9.一種融合蛋白，其可用作免疫原，用于誘導對HIV抗原具有專一性的免疫反應，該融 合蛋白包含(a)第一多肽區，其包含PE結合結構域與PE轉運結構域，且位于該融合蛋白的N端；和(b)第二多肽區，其包含HIV蛋白或其片段，且位于該融合蛋白的C端， 其中，所述第二多肽區包含抗原決定簇，其對HIV的一種亞型具有專一性。
10.如權利要求9所述的融合蛋白，在該融合蛋白的C端進一步包含內質網保留序列。
11.如權利要求9所述的融合蛋白，其中，所述第二多肽區包含HIVEnv的片段。
12.如權利要求9所述的融合蛋白，其中，所述第二多肽區包含gpl20V3結構域的一個 或多個片段。
13.如權利要求12所述的融合蛋白，其中，所述第二多肽區包含SEQIDNO :6所述的氨基酸序列。
14.如權利要求9所述的融合蛋白，其中，所述第二多肽區包含HIV蛋白或其片段，其為 選自Gag24、Nef、Tat與Rev中的至少一種。
15.如權利要求14所述的融合蛋白，其中，所述第二多肽區包含HIVGag24氨基酸序列 或其片段。
16.如權利要求9所述的融合蛋白，其中，所述第二多肽區是嵌合蛋白，該嵌合蛋白包含(i)第一肽段，其包含gpl20Cl結構域的片段，且位于該第二多肽區的N端； ( )第二肽段，其包含gpl20C5結構域的片段，且位于該第一肽段的C端；和 (iii)第三肽段，其包含gp41氨基酸序列的片段，且位于該第二肽段的C端。
17.如權利要求16所述的融合蛋白，在該融合蛋白的C端進一步包含內質網保留序列。
18.如權利要求16所述的融合蛋白，其中，所述第二多肽區包含SEQIDNO :7所述的氨 基酸序列。
19.如權利要求9所述的融合蛋白，其進一步包含中間多肽區，該中間多肽區位于所述 第一多肽區與第二多肽區之間，其中，該中間多肽區包含非Env的HIV抗原決定簇。
20.如權利要求9所述的融合蛋白，其中，所述中間多肽區包含HIV蛋白或其片段，其為 選自Gag24、Nef、Tat與Rev中的至少一種。
全文摘要
一種嵌合融合蛋白，可用作免疫原，用于誘導對人類免疫缺陷性病毒(HIV)抗原具有專一性的免疫反應。該嵌合融合蛋白包含第一多肽區和第二多肽區。所述第一多肽區包括假單胞菌外毒素A(PE)結合結構域與PE轉運結構域。所述第二多肽區包括(i)第一肽段，其包含gp120C1結構域的片段，且位于第二多肽區的N端；(ii)第二肽段，其包含gp120C5結構域的片段，且位于第一肽段的C端；和(iii)第三肽段，其包含gp41的片段，且位于第二肽段的C端。所述第二多肽區包含對HIV的一種亞型具有專一性的抗原決定簇。也可包括中間多肽，其包含選自Gag24、Nef、Tat與Rev中的且非Env的HIV抗原決定簇。
文檔編號A61K38/16GK101969975SQ200980103387
公開日2011年2月9日 申請日期2009年1月23日 優先權日2008年1月31日
發明者廖朝暐, 章修綱 申請人:生寶美國公司;生寶生物科技股份有限公司