一種新型多房棘球蚴亞單位疫苗的設計、制備方法和應用
【專利摘要】本發明提供一種新型多房棘球蚴亞單位疫苗，其活性成分是一條多肽，主要由多房棘球蚴的表面抗原Emy162以及黏膜免疫佐劑霍亂毒素B亞基(CTB)構成。本發明主要通過基因合成技術合成多房棘球蚴表面抗原Emy162基因序列，然后將該基因與霍亂毒素B亞基的基因序列相偶聯，形成一個融合基因。利用大腸桿菌原核表達系統表達該融合基因，經蛋白純化后，獲得多房棘球蚴亞單位疫苗。該多房棘球蚴亞單位疫苗能夠誘發機體產生針對多房棘球蚴T細胞及B細胞免疫應答和高滴度特異性抗體體液免疫應答，可用于預防和治療多房棘球蚴感染相關性疾病。
【專利說明】
一種新型多房棘球蚴亞單位疫苗的設計、制備方法和應用
技術領域
[0001] 本發明屬于生物醫藥領域，具體涉及到一種新型多房棘球蝴亞單位疫苗的設計制 備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 多房棘球蝴(Alveolar Echinococcosis)導致泡型棘球蝴病，多房棘球蝴在中間 宿主肝內以出芽的方式生長或浸潤式增殖，產生新囊泡，長入肝組織，囊壁外角皮層很薄且 常不完整，囊體與周圍組織間無明顯界限，囊液持續滲漏可與肝組織接觸，引起局部肝組織 病變、增生、肝纖維化、萎縮、變性和壞死，，晚期似肝癌樣轉移能轉移至肺、腦、乳腺等臟器， 素有"蟲癌"之稱，預后極差。世界范圍內北半球高海拔地區為泡型棘球蝴病的高發區域。我 國三江源地區是多房棘球蝴病的世界罕見高發地區。多房棘球蝴病具有發病范圍廣、惡性 程度高、早期診斷難、預后效果差、術后易復發等特點。目前針對多房棘球蝴病尚無令人滿 意的治療策略。大多數牧區患者出現癥狀時才就醫，而病情往往已至晚期，喪失手術機會， 即使進行肝部分或半葉切除，術后復發率也很高。甲苯達唑、阿苯達唑等抗生素療法有一 定的治療效果，但是由于需長期連續治療導致耐藥性的出現及治療后復發率高等缺限。 [0003]表面抗原是刺激機體產生免疫應答的基本功能單位，很多表面抗原可以用作疫苗 的研發。而亞單位疫苗基于表面抗原而制備，具有獨特的疫苗設計思路，是研制預防和治療 感染性疾病、惡性腫瘤和自身免疫性疾病等疫苗的新方向。亞單位疫苗具有以下優點：（1) 亞單位疫苗減少或消除了常規活疫苗或滅活疫苗難以去除的熱原、變應原及其它有害的反 應原;且由于亞單位疫苗不能在體內復制，對宿主沒有致病風險，是最具安全性和穩定性 的一種基因工程疫苗。（2)亞單位疫苗只含有病原體的一種或幾種只產生保護性免疫應答 所必需的免疫原成分，而不含有病原體其他遺傳信息，故不含有感染性組分，因而無須滅 活，也無致病性，具有很好的穩定性。（3)亞單位疫苗可采用大腸桿菌、酵母菌等原核表達系 統進行表達。故亞單位疫苗產量很高，易純化，便于工業化生產。在多房棘球蝴疫苗研究領 域，亞單位疫苗與其他疫苗相比，同樣具有很大優勢，既可激發更高特異性的抗多房棘球蝴 抗體，又可防止疫苗免疫引起的一些自身免疫性疾病，具有更高的免疫針對性和安全性。
[0004] 對于多房棘球蝴抗原的尋找一直是當前研究的熱點之一，現階段包蟲病研究主要 集中在包蟲病診斷抗原，對預防、抑制多房棘球蝴感染的抗原研究還較少;加之多房棘球蝴 感染宿主的免疫逃逸機制復雜，目前還未形成對多房棘球蝴的免疫治療方式。研究發現 Emyl62具有很強的免疫作用，并穩定表達于棘球蝴生命周期的各階段(原頭節、培養的棘球 蝴、未成熟成蟲與成熟成蟲），在棘球蝴的粘附及運動生理學中發揮重要的作用。
[0005] 本課題擬將多房棘球蝴的表面抗原Emyl62與黏膜免疫佐劑霍亂毒素 B亞基進行基 因融合，經原核系統表達純化得到亞單位疫苗CTB-Emy 162，免疫BALB/C小鼠，使用脾淋巴細 胞增殖、特異性ELISA等方法確證亞單位疫苗的免疫原性及免疫特異性。
[0006] 本發明的思路如下:根據機體對多房棘球蝴的免疫保護性機制，篩選出具有良好 免疫原性的多房棘球蝴表面抗原Emy-162,利用分子生物學技術與黏膜免疫佐劑霍亂毒素 B 亞基(CTB)相偶聯，設計出一個科學合理、結構新穎的多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emyl62。 利用小鼠脾淋巴細胞增殖、ELISA等多種免疫學方法檢測多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emyl62的免疫原性和免疫特異性。研究表明多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emyl62能夠激發 BALB/c小鼠產生的T細胞、B細胞免疫應答和有效抑制多房棘球蝴活性的高滴度特異性抗 體，具有很好的免疫原性和免疫特異性。

【發明內容】

[0007] 本發明的第一個方面是提供了一種新型多房棘球蝴亞單位疫苗。
[0008] 本發明的第二個方面是提供了多房棘球蝴亞單位疫苗的制備方法。
[0009] 本發明的第三個方面是公布了多房棘球蝴亞單位疫苗的用途。
[0010] 本發明的第一個方面是提供了一種針對多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emyl62。該多 房棘球蝴亞單位疫苗主要由Emyl62和霍亂毒素 B亞基構成，多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emyl62的整體氨基酸序列如(序列1)所示，表面抗原Emyl62的氨基酸序列如(序列3)所示。 [0011]本發明的新型多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emyl62具有以下優點：（l)Emyl62是多 房棘球蝴表面抗原，被公認為是多房棘球蝴疫苗的理想候選抗原能夠取得良好的保護作 用。多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emyl62能夠引起T細胞及B細胞免疫應答和特異性抗體體 液免疫應答。（3)Emy 162抗原表位肽的分子量很小，免疫原性很低，本發明的多房棘球蝴亞 單位疫苗CTB-Emyl62采取"偶聯分子內免疫佐劑"的設計思路來增強表面抗原Emyl62的免 疫原性，從而誘發高滴度的特異性抗體產生。
[0012] 本發明的第二個方面是提供多房棘球蝴亞單位疫苗的制備方法，其技術路線詳述 如下： (1)新型多房棘球蝴亞單位疫苗抗原分子的結構設計 根據機體對多房棘球蝴的免疫保護性機制，合理選擇具有良好免疫原性的多房棘球蝴 表面抗原Emy-162,并與黏膜免疫佐劑霍亂毒素 B亞基(CTB)相偶聯，設計出一個科學合理、 結構新穎的多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emy 162。
[0013] (2)重組表達質粒pET28a-CTB-Emyl62(含有融合基因 CTB-Emy 162)的構建 首先構建一個含有霍亂毒素 B亞基(CTB)基因的重組表達載體pET-CTB;然后通過基因 合成技術合成一個多房棘球蝴表面抗原Emyl62的核苷酸序列，并將其插入重組表達載體 pET-CTB中，構建重組表達載體pET28a-CTB-Emy 162。
[0014] (3)融合蛋白CTB-Emyl62的原核表達及純化 將重組表達載體pET28a-CTB-Emyl62轉化進大腸桿菌BL21(DE3)中，構建重組基因工程 菌株BL21(DE3)/ pET28a-CTB-Emyl62。利用IPTG誘導表達，并通過Ni-NTA鎳離子親和層析 能夠獲得高純度融合蛋白CTB-Emy 162,即為多房棘球蝴亞單位疫苗。
[0015] 本發明的第三個方面是提供了多房棘球蝴亞單位疫苗的用途。多房棘球蝴亞單位 疫苗CTB-Emy 162可用于預防和治療多房棘球蝴感染相關性疾病。
【附圖說明】
[0016] 圖1:新型多房棘球蝴亞單位疫苗的分子結構設計特點。
[0017] 圖2:Emyl62基因 PCR結果圖。
[0018] 泳道I:DNA Marker;泳道2為Emy 162 DNA片段經PCR后的結果 圖3:重組表達載體pET28a-CTB-Emyl62的雙酶切鑒定。
[0019] 泳道 1:DNA Marker;泳道2:pET28a-CTB-Emyl62質粒經Nco I和 Xho I雙酶切后 圖4:重組表達載體pET28a-CTB-Emy 162質粒圖譜。
[0020] Nco I和Xho I之間為插入的融合基因 CTB-Emyl62 圖5:多房棘球蝴融合蛋白CTB-Emy 162的原核表達。
[0021] 泳道I: BL21 (DE3) / pET-28a全菌蛋白；泳道2:蛋白質Marker;泳道3: BL21 (DE3) / pET-28a-CTB-Emyl62全菌蛋白；泳道4:BL21(DE3)/ pET-28a- CTB-Emyl62可溶蛋白；泳道 5: BL21 (DE3) /CTB-Emy 162包涵體蛋白。
[0022]圖6:多房棘球蝴融合蛋白CTB-Emyl62的Ni-NTA親和層析純化。
[0023] 泳道1:純化前的CTB- Emyl62蛋白樣品；泳道2:經Ni-NTA純化后的CTB- Emyl62蛋 白樣品。
[0024] 圖7 :多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emyl62誘發抗CTB-Emyl62及Emyl62抗原表位 E7-13、El29-129抗體的檢測。
[0025] 多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emy 162能夠誘發較高滴度的針對CTB-Emy 162及 Emyl62抗原表位E7-l3、El29-l29的抗體。
[0026] 圖8:多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emyl62抗體效價檢測。
[0027]圖9:多房棘球蝴亞單位疫苗CTB_Emyl62致敏小鼠脾臟淋巴細胞對抗原刺激的增 殖反應。
[0028]圖10:多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emyl62誘發抗多房棘球蝴抗體分型的檢測。
【具體實施方式】 [0029] 材料 I. IPTG溶液:稱取1.2g IPTG置于50ml離心管中，加入40ml無菌水，充分混勻溶解后， 定容至50ml。用0.22μπι濾器過濾除菌，小份分裝，-20°C保存。
[0030] 2.卡那青霉素(Kana)JC液（lg/mL):稱取Ig卡那青霉素(Kana)溶于ImL無菌水， 制得濃度為lg/mL的貯存液，通過0.22μπι細菌濾器過濾除菌，溶液分裝保存于-20°C冰箱 中。
[0031] 3.培養基：（I)LB液體培養基:稱取IOg胰蛋白胨、5g酵母提取物和5g NaCl，加蒸 餾水至1000 ml，調整pH至7.4，高壓蒸氣滅菌。（2)LB固體培養基：1.5g瓊脂粉/100ml LB培養 液，高壓滅菌后，傾倒平板。
[0032] 4. DNA電泳緩沖液（50 X TAE):稱取242g Tris、37.2g Na2EDTA · 2H20和57.1ml 冰乙酸，加水至1000ml，使用時稀釋50倍。
[0033] 5·SDS-PAGE電泳緩沖液(5X):稱取Tris粉末15.1g、甘氨酸94g、SDS5.0g;加入 約800ml的去離子水，攪拌溶解;加去離子水定容至1L，室溫保存;注意：加水時應讓水延著 壁緩緩流下，以避免由于SDS的原因產生很多泡沫。
[0034] 6.考馬斯亮藍R-250染液:0.25g考馬斯亮藍R-250溶解在100mL脫色液中。（3)固定 液:500ml乙醇、100mL冰醋酸用蒸餾水稀釋至1000 ml。（4)脫色液:250ml乙醇、80ml冰醋酸用 蒸餾水稀釋至1000 ml。（5)保存液:25ml 87%甘油溶于225ml脫色液中。
[0035] 9 .實驗動物：（2)BALB/c小鼠：為SPF級，雄性，6~7周齡，購自北京，許可證號： SCXK(京）2012-0001。
[0036] 12.淋巴細胞增殖實驗主要試劑（1)小鼠脾臟淋巴細胞分離液(天津灝洋生物技 術有限公司）（2)RPMI-1640完全培養液:在RPMI-1640基礎培養液加入10%胎牛血清、100U/ ml青霉素、100μg/ml鏈霉素。
[0037] 實例1:多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emy 162的分子結構設計 在獲取Emy 162氨基酸序列的基礎上，在此基礎上添加分子內粘膜免疫佐劑CTB，設計出 具有科學合理結構的多房棘球蝴融合蛋白，以達到有效提高體內粘膜免疫反應。
[0038]結果：多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emyl62的分子結構設計特點和思路如（圖1)所 不。
[0039]實例2:重組表達載體(含有融合基因 CTB-Emy 162 )的構建 (1)多房棘球蝴表面抗原Emyl62核苷酸序列的基因合成 將前期獲取的Emyl62的氨基酸序列，按照大腸桿菌密碼子偏愛性原則轉化成相應的核 苷酸序列，委托南京金斯瑞生物科技公司進行基因合成。合成后的Emyl62進行PCR，反應體
PCR反應條件為：95°C預變性5min，95°C變性30 sec，72°C退火30 sec，72°C延伸40sec， 共30個循環;最后72°C延伸10 min。然后用1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察電泳結果（圖2)。利用 DNA片段凝膠回收純化試劑盒(北京天根生物技術有限公司）回收純化PCR擴增的Emyl62基 因，以備后續實驗使用。
[0040] (2)重組表達載體pET28a-CTB(含有霍亂素素 B亞基基因）的構建 通過質粒小量提取試劑盒(天根)提取重組質粒PET-CTB-UE(由郭樂教授惠贈），用
37Γ _切反應2 h，然后用1%瓊脂糖凝股電泳。分別利用瓊脂糖凝股DNA回收純化試 劑盒回收多表位肽UE基因和pET28a-CTB表達載體雙酶切產物，pET28a-CTB以備后續實驗使 用。
[0041 ] (3)多房棘球蝴表面抗原Emyl62基因與pET28a-CTB表達載體的連接 將回收的pET28a-CTB線性化質粒載體和PCR后回收的Emyl62基因通過互補的粘性末 端，在T4 DNA連接酶的作用下(4°C過夜)連接成閉合環狀的DNA分子，即形成重組表達質粒 nRT28a-CTR-Rmvlfi2"T4 DNA 連梓BS連梓體系加下，
結果:利用Afco IAfto I雙酶切待檢重組質粒pET28a-CTB-Emyl62，37°C反應2h，用1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測，發現雙酶切的DNA片段約790bp，與融合基因 CTB-Emy 162的理論大 小一致(圖3所示）。
[0042] 將pET28a-CTB-Emyl62送交南京金斯瑞生物科技公司，采用T7啟動子和終止子通 用引物進行基因測序，證明pET28a-CTB-Emyl62中融合基因 CTB-Emyl62的核苷酸序列完全 正確，且無移碼突變。重組表達載體pET28a-CTB-Emyl62的質粒圖譜如（圖4)所示。
[0043]實例3多房棘球蝴融合蛋白CTB-Emy 16 2的原核表達 將測序100%成功的重組表達質粒pET28a-CTB-Emyl62轉化進E.coli BL21(DE3)菌株 中。在預先制備好的含50ug/mL Kana的LB平板上，接種環劃線基因工程菌株pET28a-CTB-Emy 162/BL21 (DE3)，倒置于37°C培養箱，過夜培養12~16h后，挑取單個菌落，接種于含50μ g/mL Kana的LB液體培養基中，37°C，190rpm，培養6-8h。以1%接種量分別接種重組菌于含50 Ug/mL Kana LB液體培養基中，37 °C，180rpm振蕩過夜，次日晨再將該菌液以1%接種量接種 于含SOyg/mL Kana的LB液體培養基中，37°C，190rpm搖瓶9h后，加入IPTG使終濃度達到 ImmoI/L，28 °C，190rpm誘導表達，以空載體菌pET28a/BL21 (DE3)作為陰性對照。
[0044] 結果：將基因工程重組菌株pET28a-CTB-Emyl62/BL21(DE3)在PH值為7、IPTG濃度 為lmmol/L、誘導溫度28°C、誘導時間為9h的情況下進行誘導表達。與對照菌株對比，基因工 程重組菌株pET28a-CTB-Emy162/BL21(DE3)在約33KD處出現目的蛋白條帶，與多房棘球蝴 重組融合蛋白CTB-Emyl62的理論大小相符合（圖5)。多房棘球蝴重組融合蛋白CTB-Emyl62 在包涵體蛋白中存在。
[0045] 實例4:多房棘球蝴多表位肽融合蛋白CTB-EMY162的純化 (DNi-NTA鎳離子親和層析柱的純化 將Ni-NTA填料充分混勻后加入層析柱中，溶液可通過重力作用緩慢流出，待完全加入 后，將上層篩板平放入柱中；向裝填好的柱中加入適量的去離子水將乙醇沖洗干凈后，加入 8倍柱體積的Binding buffer平衡，平衡結束后即可上樣;收集菌體后，每IOOmg菌體加入1_ 5ml Binding Buffer，冰浴超聲裂解菌體；12000rpm離心，棄上清，將沉淀重懸于Binding Buffer中，進行超聲波處理，直至包涵體清洗干凈（呈較潔凈的乳白色狀）；將沉淀重懸于 含8M尿素的Binding Buffer中，冰浴lh，使包涵體溶解;將菌體裂解液負載上柱，流速為10 倍柱體積/小時;使用15倍柱體積的Wash buffer沖洗柱子，收集流穿峰;使用5倍柱體積的 Elution Buffer洗脫，收集洗脫峰；依次使用3倍柱體積的Binding Buffer和5倍柱體積 的去離子水洗滌后，用3倍柱體積的20%乙醇平衡，4°C保存。
[0046]結果:經Ni-NTA鎳離子親和層析柱的純化后，收集的各個蛋白峰進行SDS-PAGE分 析，可以發現目的蛋白集中在50mM咪唑和250mM咪唑洗脫產生的蛋白峰。通過凝膠成像檢 測儀分析在250mM咪唑洗脫的目的蛋白純度均在85%以上（圖6)。
[0047] 實施例5:多房棘球蝴多表位疫苗CTB-EMY162的免疫原性和免疫特異性研究 (l)BALB/c小鼠的免疫 實驗分組:將SPF級BALB/c小鼠隨機分為2組，分別為新型多房棘球蝴多表位融合蛋白 CTB-Emyl62免疫組、PBS免疫組。每組12只BALB/c小鼠，共24只，詳細分組如下圖所示： 衷I :SPF級MLR/c小鼠分鉬及免痦方鑾
免疫萬式：用75% 稩對小鼠腹部消毐，然后腹腔注射里組蛍臼和弗氏芫全佐刑的混 合乳化劑;每隔一周加強免疫一次，第2和3周加弗氏不完全佐劑，第4周直接注射重組蛋白 溶液加強免疫。
[0048] 抗血清的采集:在末次免疫后第五天，摘小鼠眼球采血，收集血液，放置待血清完 全分離，3000rpm離心5分鐘分裝血清，一 80°C凍存備用。
[0049] (2 )抗血清中特異性抗體的ELI SA檢測 將抗原Emyl62、Emyl62特異性抗原表位小肽(E7-13、E129-139)、I?S用包被液稀釋成5μg/ ml，100μl/孔包被ELISA板，4°C過夜。用洗滌液洗4次后，每孔加入300μl封閉液，37°C封閉 2h。用洗滌液洗4次后，將抗血清（鼠抗CTB-Emy 162抗血清、和鼠抗CTB抗血清)和小鼠陰性血 清倍比稀釋后加入ELISA板，100μΙ/孔，在37°C下孵育60min。用洗滌液洗4次后，加入HRP標 記的羊抗鼠 IgG(l :2000)，100μ1/孔，在37°C下孵育lh。用洗滌液洗4次后，加入TMB底物顯色 液，室溫避光反應15min，加50μ1終止液終止反應。用酶標儀測定各孔0D45Q值。將OD值大于設 定的陰性對照OD值的2.1倍的孔對應的稀釋度，定為該樣品的效價。
[0050] 結果:Emyl62的包被濃度為5μg/ml，通過ELISA檢測，CTB-EMY162亞單位疫苗能夠 產生針對Emyl62抗原的IgG抗體，而PBS免疫組不能產生針對Emyl62抗原的IgG抗體;E7-13及 E129-139包被濃度為5μg/ml，通過ELISA檢測，CTB-EMY162亞單位疫苗能產生針對Emyl62特異 性抗原表位肽E7- 13&E129-139的IgG抗體，而I3BS不能產生針對Emyl62特異性抗原表位肽E7- 13 及已129-139的IgG抗體（圖7,8)。上述結果說明亞單位疫苗CTB-Emyl62能夠刺激機體產生針對 Emy 162的高滴度特異性抗體，具有很好的免疫原性。
[0051 ] (3)小鼠脾臟淋巴細胞增殖實驗 將經抗原免疫的小鼠脫白處死，泡75%酒精5min后，移入超凈工作臺。用剪刀小心剪開 小鼠的腹部外皮，再剪開小鼠的腹腔，用鑷子取出小鼠脾臟(暗紅色）。在20 ml的無菌小燒 杯中放入4~5 ml EZ-Sep TM Mouse IX淋巴細胞分離液;用鑷子固定尼龍網，然后用注射器 活塞輕輕研磨小鼠脾臟，使得分散的單細胞透過尼龍網進入到淋巴細胞分離液中；把懸有 脾臟細胞的分離液立即轉移到離心管中，離心前再覆蓋上大約200yl的1640培養基;800 g 離心30 min。離心結束后淋巴細胞會漂浮上來，在1640覆蓋層下面聚集。用含10%小牛血清 的RPMI-1640培養基制備成一定濃度的細胞懸液(5 X 104/ml)。在96孔平底培養板中，每孔 加入100μΙ細胞，同時加入CTB-Emy 162、E7-13、E129-139、PBS(20μg/ml)，終體積為200μ1/孔，每 組做3個平行孔。將加好的96孔平底培養板放置37°C 5% CO2培養箱中培養48h后，向各孔中 加入MTT溶液(5mg/ml)30μ1，繼續培養4h后，輕輕吸出上清，每孔加入DMSO 100μΙ振蕩混勻 后用酶標儀讀取OD570值。
[0052] 結果：多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emyl62致敏過的小鼠脾臟淋巴細胞，gCTB- Emyl62、E7-i3、E129-139刺激均均能夠發生明顯的淋巴細胞增殖反應，而PBS免疫組的小鼠脾臟 淋巴細胞接受上述抗原刺激時均未發生淋巴細胞增殖反應，說明多房棘球蝴亞單位疫苗 CTB-Emyl62保持有其免疫學特性，能夠刺激機體產生特異性細胞免疫應答(圖9)。
[0053] (4)抗血清中特異性抗體分型的ELISA檢測 將抗原Emy 162、PBS用包被液稀釋成5μg/ml，100μΙ/孔包被ELISA板，4°C過夜。用洗滌液 洗4次后，每孔加入300μ1封閉液，37°C封閉2h。用洗滌液洗4次后，將抗血清和小鼠陰性血清 倍比稀釋后加入ELISA板，100μΙ/孔，在37°C下孵育60min。用洗滌液洗4次后，加入HRP標記 的羊抗鼠 IgA、IgGI、IgG2a，抗體稀釋液稀釋，稀釋比例（1:2000)，100μ1 /孔，在37 °C下孵育 Ih。用洗滌液洗4次后，加入TMB底物顯色液，室溫避光反應15min，加50μ1終止液終止反應。 用酶標儀測定各孔OD 450值。
[0054] 結果：如（圖10)所示，PBS免疫對照組相比，多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-EMY162能 夠產生抗Emy 162的I gG I、I gGA和I gG2a抗體。
【主權項】
1. 一種多房棘球蝴亞單位疫苗，其活性成分是一條多肽，主要由霍亂毒素 B亞基(CTB) 和棘球蝴表面抗原Emyl62構成，其氨基酸序列如序列1所示。2. 如權利要求1所述，一種多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emyl62,其核苷酸序列如序列2 所示。3. -種多房棘球蝴表面抗原Emyl62的氨基酸序列如序列3所示。4. 如權利要求3所述，多房棘球蝴表面抗原Emyl62的核苷酸序列如序列4所示。5. 包含權利要求2和4中所述的核苷酸序列的表達載體，轉基因細胞系及宿主菌。6. 如權利要求1所述，霍亂毒素 B亞基（CTB)和多房棘球蝴表面抗原Emyl62之間的間隔 序列為DPRVPSS。7. -種多房棘球蝴亞單位疫苗的制備方法，通過基因合成技術合成多房棘球蝴表面抗 原Emyl62的核苷酸序列，將其融合在霍亂毒素 B亞基(CTB)基因的下游，構建含有融合基因 CTB-Emy 162的重組表達載體pET28a-CTB-Emy 162及其重組基因工程菌BL-21 (DE3)， 重組基因工程菌株發酵后，經Ni-NTA鎳離子交換層析純化，獲得該疫苗的融合蛋白 CTB-Emy162〇8. 按照權利要求1和6所述的多房棘球蝴亞單位疫苗，其特征在于能夠激發機體產生針 對多房棘球蝴T細胞免疫應答和有效抑制多房棘球蝴的高滴度特異性抗體。9. 按照權利要求1和7所述的多房棘球蝴亞單位疫苗，其特征是可以用作預防和治療多 房棘球蝴感染的藥物組合。
【文檔編號】C12P21/02GK106075416SQ201610417912
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月15日 公開號201610417912.8, CN 106075416 A, CN 106075416A, CN 201610417912, CN-A-106075416, CN106075416 A, CN106075416A, CN201610417912, CN201610417912.8
【發明人】樊海寧, 格日力, 陽旦才讓, 湯鋒, 周虎, 李潤樂
【申請人】青海大學