專利名稱：融合蛋白疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物學和疫苗技術領域，并且涉及能夠賦予對B組鏈球菌感染的免 疫性的疫苗的研發。更具體地說，本發明涉及賦予對B組鏈球菌的侵入菌株的免疫性的新 融合蛋白。本發明進一步涉及編碼所述融合蛋白的分離的核苷酸序列；載體；宿主細胞；疫 苗；和預防或治療B組鏈球菌感染的方法。
背景技術：
B組鏈球菌(無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)) (GBS)為新生兒期侵入性 細菌感染，包括腦脊膜炎的主要原因。僅在美國，目前每年就有約5000個因這種細菌導致 的侵入性疾病的病例。這些感染總計具有約10%的死亡率，并且存活嬰兒中的許多存在持 久性的神經后遺癥。就此而言，已經作出了巨大嘗試來找到預防和治療的方法和分析GBS 導致感染的機理。GBS還可以導致牛的乳腺炎，即具有相當的經濟重要性的牛疾病。研發針對GBS感 染的疫苗由此在獸藥中也受到關注。所有女性中約20%為GBS的陰道攜帶者，并且從母親產道垂直傳播可能是因這種 細菌導致的新生兒疾病中的感染的最常見來源。然而，僅約的分娩時居留GBS的嬰兒 患有嚴重的感染。并非在分娩過程中接觸該細菌的其它因素由此必定促成新生兒疾病的發 生。基于多糖囊的結構將B組鏈球菌菌株分成9種血清型(Ia，Ib和II-VIII) (Baker, J Inf Dis 1990.161:917)。4種“典型的”血清型Ia，lb, II和III幾乎以等比例出現在 正常菌群種的菌株中，但III型在臨床上為最重要的血清型，特別是因為它導致大部分腦 脊膜炎病例。因為所述囊為公知的毒力因素，所以特別是對III型菌株的研究相當詳細。已 經嘗試研發疫苗，其中III型多糖囊可以為主要成分。EP 0 866 133中披露了能夠研發接受者發生因B組鏈球菌導致的感染的疫苗。本 發明涉及￡蛋白的多糖和片段的組合的應用。它進一步披露了流行病學數據提示類型特 異性囊在對B組鏈球菌感染的免疫性中起重要作用(參見第7頁，第2-3行)。另外，在本 申請中，不同蛋白質與提及的多糖之間存在大量不同的組合，但所有的權利要求均包括表 現出該特定成分的重要性的多糖。然而，多糖囊作為疫苗的應用因與人體組織的交叉反應 而可能產生問題(Pritchard等，Infectlmmun 1992.60 :1598)。因此，如果基于非多糖類的 蛋白質研發疫苗，那么可能極為有價值。對比文件 Gravekamp 等，Infection and Immunity，1997 年 12 月，p 5216-5221 中 披露了免疫原性的評價和alpha( a )C蛋白和單獨的N_末端部分的重復單位數量的保護。 發現免疫原性隨重復單位的數量增加而下降(參見圖2B)。然而，還發現在保護試驗中，與 針對N-末端區的抗體相比，針對重復區的抗體主要負責保護(參見5219頁，左欄，從倒數 1行數第6行，和5220頁，右欄，第26-29行)。W0 9410317中描述了 a蛋白，即GBS表面蛋白在研發綴合疫苗中的應用。使用這 種蛋白質的缺點在于它通常不被III型菌株表達，而這些菌株為許多嚴重GBS感染的主要原因。因此，針對這些菌株的保護性免疫不會由a蛋白疫苗引起。W0 9421685中描述了 Rib蛋白，即GBS表面蛋白在研發疫苗中的應用。這種蛋白 質在與明礬一起給予時引起免疫性。然而，Rib蛋白具有它不引起針對所有GBS菌株的保 護性免疫的缺點。目前，如上所述，適合于預防GBS疾病的疫苗尚未得到，不過，更多的工作致力于 解決這一問題。顯然，目前對研發預防和治療GBS感染的方法存在長期需求，但尚未得到滿 足。因此，仍然需要探索能夠引起針對廣泛GBS菌株的保護性免疫的疫苗策略。因此，本發明的主要目的在于提供能夠引起針對GBS感染的保護性免疫的疫苗。本發明的另一個目的在于提供引起針對許多臨床重要的GBS菌株的保護性免疫 的疫苗。本發明的另一個目的在于提供由引起針對GBS感染的保護性免疫的單一融合蛋 白組成的疫苗。所述單一蛋白具有優于由多種蛋白質組成的疫苗的幾個優點，例如生產成 本和安全性。實現上述目的和其它目的中的每一個的手段從下文對本發明的描述中顯而易見。發明概述令人意外地發現包含兩種不同的非免疫顯性區，諸如來自與來自GBSa蛋白的 N-末端區片段融合的GBS Rib蛋白的N-末端區片段的融合蛋白，即由兩種不同GBS菌株表 達的兩種不同蛋白質中的非免疫顯性區之間的融合體可以產生一種融合蛋白，在將該融合 蛋白作為疫苗對哺乳動物給予時，它可以產生針對因兩種不同細菌菌株導致的感染的極為 有效的保護作用。這種保護作用由抗體賦予。本發明在第一個方面中涉及融合蛋白，包含B組鏈球菌表面蛋白或其類似物，同 源物，衍生物或免疫相關的氨基酸序列或片段中的至少一種第一 N-末端區片段，其與B 組鏈球菌表面蛋白或其類似物，同源物，衍生物或免疫相關的氨基酸序列或片段中的至少 一種第二 N-末端區片段融合，其中所述B組鏈球菌表面蛋白中的第一和第二的至少一種 N-末端區片段來源于不同B組鏈球菌菌株，并且其中所述融合蛋白能夠引起針對B組鏈球 菌的保護性免疫。本發明的融合蛋白的主要優點在于它包括來自相關表面蛋白Rib和a的區，它們 各自被B組鏈球菌的許多臨床重要的菌株表達，且最重要的是，已經表明其引起針對這些 臨床重要的菌株的保護性免疫。該融合蛋白具有甚至在不使用佐劑的情況下它也具有免疫原性，從而引起針對表 達Rib-和a的菌株的保護性免疫的優點。此外，本發明的融合蛋白疫苗可以與明礬(一 種適用于人體的佐劑)一起給予。相反，據報道近期描述的“通用疫苗”僅與弗氏佐劑，即 一種不能用于人體藥物的強刺激性成分共同起作用(Maione，D.等，Science 2005. 309 148-150)。本發明的另一個優點在于本發明的疫苗組合物可以由單一融合蛋白組成，并且仍 然引起針對不同GBS感染的保護性免疫。這具有優于由多種蛋白質組成的疫苗的幾個優 點，例如單一蛋白質比包含多種蛋白質的混合物簡單，安全和制備低廉。更具體地說，本發明涉及所述融合蛋白；分離的核苷酸序列；載體，宿主細胞；疫 苗；和預防或治療B組鏈球菌感染的方法。
下面將特別參照附圖更詳細地描述本發明。附圖簡述

圖1表示實施例中所用的蛋白質。(A)表示Rib和a蛋白，包括期唯一的N_末端 區(N-區)精確長重復區(R-區)。顯示了不同區中氨基酸殘基的數量和殘基的同一性。 (B)來源于Rib和a的重組蛋白。(C)通過SDS-PAGE分析純化的蛋白質。(D)使用小鼠 抗-Rib抗體的抑制試驗。(E)斑點印跡分析。圖2表示來自使用被動免疫法的研究的數據。(A)針對RibN或Rib2R的兔抗血清 與表達Rib的菌株BM110 (開放式符號)或其Rib-陰性突變體(封閉式符號)的反應性。 (B)具有兔抗-RibN或抗-Rib2R的小鼠的被動疫苗接種。圖3表示(A) Rib和a的N_末端區之間的交叉反應性分析⑶針對RibN- a N 和Rib2R_a2R的兔抗體的表征。(C)具有針對兩種融合蛋白的抗體的小鼠的被動疫苗 接種，隨后使用表達Rib的III型菌株BM110或表達a的la型A909攻擊。(D)使用 抗-(RibN-aN)的被動疫苗接種，隨后使用表達Rib的II型菌株或表達a的lb型菌株攻 擊。(E)使用抗-(RibN- a N)的被動疫苗接種，隨后使用Rib-陰性BM110突變體攻擊。圖4表示來自使用RibN-aN融合蛋白主動免疫接種的結果。(A)在使用或不使用 佐劑情況下給藥時RibN- a N的免疫原性。(B)使用RibN- a N的主動疫苗接種。圖5表示㈧能夠侵入人宮頸細胞系ME180的細胞的能力的細菌比較；(B) 抗-(RibN-aN)對上皮細胞的抑制。發明詳述術語“免疫原性”意指具有引起免疫應答的能力。本發明的新融合蛋白為免疫原 性的并且特征在于其引起針對至少包含Rib-和a _蛋白的GBS的保護性免疫應答的能力。術語“類似物”意指與Rib-和a-蛋白相關的那些蛋白質，其中Rib-或a-蛋白 (SEQ ID NO :2和4)的一種或多種氨基酸殘基被另一種氨基酸殘基取代，只要該類似物蛋 白質或融合蛋白的總體功能性和免疫原性受到保護。這類類似物可以為天然存在的或可以 通過合成方式或重組DNA技術，例如通過SEQ ID NO :1和3之一或其兩者的誘變產生。本 發明融合蛋白的類似物具有能夠產生與Rib-蛋白反應的至少一個表位和與a蛋白反應的 至少一個表位。這類類似物可以與SEQ IDN0 6中所示的融合蛋白具有至少80%的總體同 源性或同一性，諸如80-99%的同源性或同一性或其中的任意范圍。例如，可以使用購自 University of Wisconsin GeneticsComputer Group (UWGCG) 的GAP計算機程序6. 0版比較序列信息確定同源性百分比。GAP程序應用Needleman和 Wunsch 的序列對比法(J MolBiol 1970 48 :443)，如 Smith 和 Waterman 修訂(Adv Appl Math 19812:482)。簡言之，GAP程序將相似性定義為除以兩種序列中較短的中的符號總數 的彼此類似的序列對比符號(即核苷酸或氨基酸)數量。GAP程序的優選默認參數包括 (l)Gribskov和Burgess的單元比較矩陣(包含同一性的1值和非同一性的0值)和加 權比較矩陣(Nucl AcidsRes 1986 14 :6745)，如 Schwartz 和 Dayhoff，eds 所述(Atlas ofProtein Sequence and Structure, National Biomedical ResearchFoundation, Washington,D. C. 1979，pp. 353-358) ； (2)對各空位而言3. 0的罰分和對每個空位中的每個 符號而言額外的0. 10罰分；和(3)對末端空位而言無罰分。本文所用的“同源物”與來自鏈球菌的種類無乳鏈球菌的所述融合蛋白或Rib-和a-蛋白相關，其中氨基酸序列(SEQ ID N0:2或4)中的一種或多種氨基酸殘基被另一種 氨基酸殘基取代，只要該同源物蛋白質的總體功能性和免疫原性得以保留。這類同源物可 以為天然存在的或可以通過合成方式或通過重組DNA技術產生。SEQ ID NO :2或4的同源 物具有能夠產生與Rib-或a-蛋白反應的至少一個表位。這種同源物與Rib-和a-蛋白 可以具有至少80%的總體同源性(即，相似性)或同一性，諸如80-99%的同源性(即，相 似性)或同一性或其中的任意范圍。本文所用的“衍生物”為多肽，其中一種或多種物理，化學或生物特性已被改變。 這類改變包括，但不限于氨基酸取代，修飾，添加或缺失；脂化，糖基化或磷酸化模式的改 變；存在于多肽中的氨基酸殘基的游離氨基，羧基或羥基側基與其它有機和無機分子的反 應；和其它改變，其中的任一種可以導致一級，二級或三級結構的改變。本發明的“片段”具有至少一個免疫原性表位。本發明的優選片段會引起足以預 防或改善感染嚴重性的免疫應答。術語“藥學上可接受的媒介物”意指任何合適的常用于藥物制劑的可接受的賦形 劑、佐劑、載體、稀釋劑。本發明涉及抵抗B組鏈球菌(GBS)感染的疫苗，這種感染是新生兒中危及生命的 細菌感染的最重要的原因。本發明基于本發明人的知識和如下實現來源于B組鏈球菌的 兩種大表面蛋白中的亞區的融合蛋白Rib和a蛋白引起保護性免疫。鑒于研發基于單一成分的B組鏈球菌(GBS)疫苗的長期目的，本發明人分析了來 源于Rib和a的融合蛋白是否可以引起保護性免疫。Rib和a的大的尺寸和重復區的遺 傳不穩定性意味著融合蛋白應來源于亞區。然而，亞區的選擇并不是顯而易見的，因為保護 性表位存在于a和Rib的重復區中。令人意外的是，本發明人已經證實來源于N-末端區 的融合蛋白具有優于來源于這些蛋白質的其它區，即重復區的特性并且引起良好的保護性 免疫。在本說明書中，除非另有規定，否則“一種(a)”或“一種(an) ”意指“一種或多種”。在本說明書的上下文中，特別將任何和所有的參考文獻引入本專利申請中作為參考。融合蛋白本發明在第一個方面中涉及融合蛋白，包含B組鏈球菌的至少第一 N-末端區片 段，其與B組鏈球菌表面蛋白的至少第二 N-末端區片段融合，其中所述B組鏈球菌表面蛋 白中的第一和第二 N-末端區片段來源于不同B組鏈球菌表面蛋白，并且其中三十融合蛋白 能夠引起針對B組鏈球菌的保護性免疫。可以包含在本發明的融合蛋白中的不同鏈球菌表面蛋白包括，但不限于B組鏈球 菌Rib蛋白；B組鏈球菌a蛋白；B組鏈球菌0蛋白；B組鏈球菌￡蛋白；和/或B組鏈球 菌R28蛋白。本發明的一個實施方案涉及融合蛋白，包含與B組鏈球菌a蛋白的N_末端區片 段融合的B組鏈球菌的Rib蛋白的N-末端區片段，其中所述融合蛋白能夠引起針對B組鏈 球菌的保護性免疫。本發明的另一個實施方案涉及融合體，其中該融合蛋白包含至少第一氨基酸序列 SEQ ID NO :2或其類似物，同源物，衍生物或免疫相關的氨基酸序列或片段，其與至少第二氨基酸序列SEQ ID NO :4或其類似物，同源物，衍生物或免疫相關的氨基酸序列或片段融 合。所述至少第一氨基酸序列包含與如SEQ ID NO :2中所示的氨基酸序列具有至少80，85， 90，95，96，97，98或99%序列同一性的氨基酸序列。所述至少第二氨基酸序列包含與如SEQ ID NO 4中所示的氨基酸序列具有至少80，85，90，95，96，97，98或99%序列同一性的氨基 酸序列。融合蛋白的一個實例如SEQ ID NO :6中所示，另一個實例為包含選自SEQ ID NO 2和SEQ ID NO :4的三種或三種以上氨基酸序列或其部分的融合蛋白。B組鏈球菌Rib蛋白，在本說明書中也稱作Rib和Rib蛋白，其為本領域已知的表 面蛋白，并且例如描述在W0 9421685中。符號“Rib”意指蛋白酶抗性，免疫性和B組。Rib 蛋白首先分離自血清型III的B組鏈球菌菌株，為不同的95kDa蛋白質。蛋白質Rib由幾 乎所有臨床重要的血清型III的B組鏈球菌菌株表達，這些菌株導致腦脊膜炎的大部分病 例，并且由前體血清型，諸如II型的某些菌株表達。此外，Rib由III型超毒力克隆的所有 菌株表達。已經設計了純化蛋白質Rib的方法，并且已經證實針對該蛋白質的抗體預防因 表達蛋白質Rib的菌株導致的致命感染(進一步的詳細描述，諸如DNA和蛋白質序列參見 W0 9421685)。B組鏈球菌a蛋白，在本說明書中也稱作a，a蛋白和a抗原，其為本領域已 知的B組鏈球菌表面蛋白。W0 9410317中描述了包含a蛋白的綴合疫苗組合物。如TO 9410317中所述的天然B組鏈球菌a前體蛋白具有108kDa的分子量。切割41個氨基酸 的推斷的信號序列產生104kDa的成熟蛋白(然而，注意隨后顯示該信號序列具有56個氨 基酸殘基的長度31；益1]1&11111^]-0&1~1611^1111等，J Exp Med 177，1593 ;1993)。a 蛋白的 20kDa N-末端區未顯示出與上述蛋白質序列的同一性并且其后面跟隨一系列9個串聯重 復單位，它們構成所述成熟蛋白的74%。每個重復單位(本文稱作“R”)相同并且由82個 氨基酸組成，分子量約為8500道爾頓，被246個核苷酸編碼。a抗原的C_末端包含存在于 許多革蘭氏陽性表面蛋白中的細胞壁錨定結構域基元。GBS的Rib和a蛋白各自包括唯一的N_末端區(N)和長重復(R)區。GBS菌株 BM110和A909表達的蛋白質分別具有12和9個重復單位，如圖1A中所示。壁錨定區位于 C-末端上。Rib和a中的串聯重復單位在每種蛋白質內相同，但在蛋白質之間不同，并且在 分離物之間的數量上可變。除這種變化外，Rib和a的序列在菌株中穩定。盡管氨基酸殘 基同一性明顯(圖1A)，但是兩種蛋白質幾乎未表現出或無抗原交叉反應性。R28蛋白為B組鏈球菌表面蛋白，它賦予保護性免疫并且促進結合人上皮細胞 (Stalhammar-Carlemalm 等 Molecular Microbiologyl999. 33，208-219)。￡蛋白為B組鏈球菌a -蛋白-樣蛋白(Creti等Clin Microbiol. 2004. 42 1326-9)。本發明涉及的術語“N-末端區”意指蛋白質的N-末端區(N)。Rib和a的N_末 端區的氨基酸序列的實例如SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 4中所示。就本發明的目的而言，術語“融合蛋白”意指兩個或兩個以上蛋白質區的裝配集合 或其片段，例如，包含B組鏈球菌Rib蛋白的N-末端區片段和B組鏈球菌a蛋白的N-末 端區片段。例如，可以存在一個Rib-蛋白的N-末端區片段和一個a-蛋白的N-末端區片 段或Rib-和a -蛋白的2，3，4或5個N-末端區片段，其中來自兩種蛋白質的片段數量不相等。B組鏈球菌Rib蛋白的N-末端區片段和B組鏈球菌a蛋白的N_末端區片段的實 例包括編碼天然a和Rib蛋白(例如SEQ ID NO :2和SEQID NO 4)的N-末端區的天然氨 基酸序列的肽或可以為這些區的天然序列的功能性衍生物，其中這些功能性衍生物保持其 引起針對B組鏈球菌的保護性免疫的能力。術語功能性衍生物用以包括N-末端區的序列 和片段的部分；它還用以包括天然蛋白質的變體(諸如如天然分子表現出的具有氨基酸序 列改變，但保持引起免疫原性，毒力或抗原特性的能力的蛋白質)，例如具有改變的側翼序 列。包括可以按照本發明使用來自B組鏈球菌不同菌株的N-末端區片段。這意味著 N-末端區片段中的序列輕微改變，但不會改變生物特性及其引起保護性免疫的功能能力。 例如，分離自B組鏈球菌的不同菌株，而非SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 4中披露的那些的B 組鏈球菌a和Rib抗原旨在本發明的范圍內。可以通過幾種方式，例如通過偶聯以化學方式，綴合或交聯直接或通過中間體結 構；通過經俘獲在大分子結構中或上以物理方式；或通過分子的生物融合，即通過包含能 夠編碼兩者中每一種的核酸片段的重組核酸分子的組合，以便最終產生單一連續表達產物 可以實現多肽類的組合以提供融合蛋白。就本發明的目的而言，術語“蛋白質”意指氨基酸的分子鏈。蛋白質不具有具體的 長度，并且如果需要，可以在體內或體外通過例如糖基化，酰胺化，羧化或磷酸化加以修飾。 特別地，肽類，寡肽類和多肽類包括在本定義中。蛋白質或肽可以是天然或合成來源的。在 本文的上下文中，融合蛋白意指通過幾種方式，諸如上述的那些直接或間接地彼此共價連 接的兩種或多種多肽類。術語“融合”意指生成如上所述的融合蛋白。B組鏈球菌菌株，本文也稱作GBS，為眾所周知的并且可以分離自感染的人類血 液。GBS在美國為最常見的新生兒膿毒癥的原因并且每年造成約5000個病例。名稱“B組鏈球菌”來源于如下事實基于其細胞表面上存在的特異性碳水化合 物抗原將鏈球菌分入免疫組。目前，公認了 A-0組(Davis，B. D.等Microbiology，3rd. Edition，609 頁，(Harper &Row，1980)。本發明涉及的術語“保護性免疫”意指血清抗體和/或細胞毒性T細胞應答在免 疫接種過程中誘導預防(部分或完全)因病原體，諸如B組鏈球菌導致的疾病的能力。即 本發明疫苗免疫接種的脊椎動物經歷了 B組鏈球菌生長和傳播受限。為了測定融合蛋白或 疫苗是否誘導保護性免疫，可以使用本領域技術人員眾所周知的技術。例如，為了測定免疫 接種本發明的融合蛋白或疫苗是否誘導針對B組鏈球菌感染的保護性免疫，可以使用B組 鏈球菌度免疫接種試驗動物進行攻擊并且測定B組鏈球菌的生長和傳播。例如，為了確定 是否誘導了保護性免疫，可以使用如下實施例中所述的方法。在本發明的一個實施方案中，所述融合蛋白進一步包含B組鏈球菌R28蛋白的 N-末端區片段(基因庫登記號AAD39085. 1)和/或B組鏈球菌￡蛋白的N-末端區片段。在本發明的一個實施方案中，本發明的融合蛋白包含B組鏈球菌蛋白(即a和 Rib)的N-末端區片段的重復肽序列。按照本發明的一個實施方案，所述融合蛋白包含與如SEQ ID NO 6中所示的氨基 酸序列具有至少80 %，85 %，優選90 %，更優選95 %序列同一性的氨基酸序列。
術語“序列同一性”表示等長度的兩個氨基酸序列或等長度的兩個核苷酸序列 之間的同源性程度的定量測量值。如果待比較的兩個序列不具有等長度，那么必須將它 們進行序列比對以便達到最佳可能的擬合。例如，可以通過BLAST程序，例如BLASTP程 序或 BLASTN 程序計算序列同一性(Pearson ff. R and D. J. Lipman (1988) PNAS USA85 2444-2448)(www, ncbl. nlm. nlh. rov/BLAST)。按照本發明的另一個實施方案，所述融合蛋白包含如SEQ ID NO 6中所示的氨基 酸序列。分離的DNA&表汰系統在本發明的第二方面中提供了分離的核苷酸序列/DNA分子，其包含編碼本發明 融合蛋白的核苷酸序列/DNA序列。一個實例為包含至少第一如SEQ ID NO :1中所示的核 苷酸序列或其片段的核苷酸序列，其與如SEQ ID NO :3中所示的至少第二核苷酸或其片段融合。還提供了重組表達系統，包括載體和宿主細胞。各種表達宿主/載體組合可以用于表達本發明的核苷酸序列。用于真核宿主的有 用表達載體包括，例如包含來自SV40，牛乳頭瘤病毒，腺病毒，腺伴隨病毒，巨細胞病毒和逆 轉錄病毒的表達控制序列的載體。用于細菌宿主的有用表達載體包括細菌制粒，諸如來自 大腸桿菌(E.coli)的那些，包括 pBluescript，pGEX2T, pUC 載體，col El, pCRl, pBR322, PMB9及其衍生物衍生物，較寬宿主范圍的制粒，諸如RP4，噬菌體DNA，例如噬菌體入的大量 衍生物，例如人GtlO和人GT11，NM989，和其它DNA噬菌體，諸如M13和絲狀單鏈DNA噬菌 體。用于酵母細胞的有用表達載體包括2. mu.質粒及其衍生物。用于昆蟲細胞的有用載體 包括 pVL 941。此外，各種表達控制序列中的任一種可以用于這些載體以便表達本發明的核苷酸 序列/DNA序列。有用的表達控制序列包括與上述表達載體基因相關的表達控制序列。有用 的表達控制序列的實例包括，例如SV40或腺病毒的早期和完全啟動子，lac系統，trp系統， TAC或TRC系統，T3和T7啟動子，噬菌體\的主要操縱子和啟動子區，外被蛋白的控制區， 3_磷酸甘油酸酯激酶啟動子或其它糖酵解酶，酸性磷酸酶啟動子，例如Pho5，酵母a -交配 系統啟動子和其它已知用于控制原核或真核細胞或其病毒基因表達的組成型和誘導型啟 動子序列及其各種組合。使用上述載體轉化的宿主細胞構成了本發明的另一個方面。各種單細胞宿主細 胞用于表達本發明的核苷酸序列/DNA序列。這些宿主可以包括眾所周知的原核和真核宿 主，諸如革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌株，諸如大腸桿菌菌株，假單胞菌屬(Pseudomonas)， 芽孢桿菌屬(Bacillus),鏈霉菌屬(Str印tomyces),鏈球菌屬(str印tococcus),葡萄球 菌屬(staphylococcus)，乳桿菌屬(lactobacillus)，曲霉屬(aspergillus)，志賀氏菌屬 (shigella)，沙門菌屬(salmonella)利斯特氏菌屬(listeria)，，真菌，酵母，昆蟲細胞，諸 如草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda) (SF9)，動物細胞，諸如CH0和小鼠細胞，非洲綠猴 細胞，諸如COS 1，C0S 7,BSC 1，BSC 40和BMT 10，人體細胞，和組織培養物中的植物細胞。 優選的宿主生物體包括細菌，諸如大腸桿菌和枯草芽孢桿菌(B. subtilis)，和組織培養物 中的哺乳動物細胞。當然，應理解并非所有的載體和表達控制序列都將同樣良好地其作用以表達本發明的核苷酸序列/DNA序列。不是所有的宿主均對同樣的表達系統起同樣良好的作用。然 而，本領域技術人員可以不經過度實驗并且在不脫離本發明的范圍的情況下在這些載體， 表達控制序列和宿主中進行選擇。例如，在選擇載體的過程中，必須考慮到宿主，因為載體 必須在其中復制。還應考慮載體的拷貝數，控制該拷貝數的能力和該載體編碼的任意其它 蛋白質，諸如抗生素標記的表達。在選擇表達控制序列的過程中，也應考慮各種因素。它們 包括，例如序列的相對強度，其可控性及其與本發明核苷酸序列/DNA序列的相容性，特別 是就可能的二級結構而言。應通過考慮其與選擇的載體的相容性，本發明核苷酸序列/DNA 序列編碼的產物毒性，其分泌特征，其正確折疊蛋白質的能力，其發酵或培養要求和從它們 中純化部分核苷酸序列/DNA序列編碼的產物的便利性選擇單細胞宿主。在這些參數中，本 領域技術人員可以選擇各種載體/表達控制序列/宿主組合，它們在培養時或大規模動物 培養中表達本發明的核苷酸序列/DNA序列。可以使用各種常規方法中的任一種從微生物培養物或細胞培養物中分離并且稠 合本發明核苷酸序列/DNA序列編碼的多肽類，包括液相色譜法，諸如正相或反相，使用 HPLC，FPLC等；親和色譜法(諸如使用無機配體或單克隆抗體)；離子交換色譜法，尺寸排 阻色譜法；固定化金屬螯合物色譜法；凝膠電泳等。本領域技術人員可以在不脫離本發明 的范圍的情況下選擇最適當的分離和純化技術。此外，可以通過幾種化學技術中的任一種生成本發明的多肽類。例如，可以使用最 初由R. B.Merrifield描述的固相合成技術制備它們(J Am Chem Soc 1963 83:2149-54)， 或可以通過溶液中的合成制備它們。肽合成技術綜述可以在E. Gross&H. J. Meinhofer, 4 ThePeptides Analysis Synthesis, Biology ；Modern Techniques OfPeptide And Amino Acid Analysis, John Wiley & Sons, (1981)；禾口 M. Bodanszky, Principles Of Peptide Synthesis, Springer-Verlag(1984)中找至丨J。本發明的優選組合物和方法包括具有增強的免疫原性的多肽類。這類多肽類可以 在該多肽類或其片段的天然形式被修飾或進行處理以便增強其在指定接受者中的免疫原 性時產生。許多技術是可以利用的并且是本領域技術人員眾所周知的，可以在不進行過度 實驗的情況下使用它們，以便顯著增加本文披露的多肽類的免疫原性。例如，可以通過與二 硝基苯酚部分或氨苯胂酸偶聯或通過加熱和/或SDS變性修飾所述多肽類。特別地，如果 所述多肽類為以化學方式合成的小多肽類，那么可能期望使它們與免疫原性載體偶聯。偶 聯當然不一定干擾所述多肽或載體適當其作用的能力。就偶聯策略中的某些一般性考慮 的綜述而 目，參見 Antibodies，A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory, ed. E. Harlow和D. Lane (1988)。有用的免疫原性載體是本領域眾所周知的。這類載體的實 例為鑰孔滅血藍蛋白(KLH)；白蛋白，諸如牛血白蛋白(BSA)和卵白蛋白，PPD(結核菌素的 純化蛋白衍生物)；紅血細胞；破傷風類毒素；霍亂類毒素；瓊脂糖珠；活性炭；或膨潤土。還可以在所謂的不含細胞的表達系統中進行表達。這類系統包括來自可操作地與 在該特定系統中起作用的啟動子連接的適當的重組核酸的所有表達用必需因子。Rib和a的N-末端區的核苷酸序列/DNA序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :3中 所示，并且如下實施例中所用的融合蛋白的核苷酸序列/DNA序列如SEQ ID NO :5中所示。本發明在一個實施方案中涉及生產所述融合蛋白的方法，包括下列步驟提供包 含如上所述核苷酸序列的如上所公開的宿主細胞，使該宿主細胞在本領域技術人員眾所周
11知的合適的宿主培養基中繁殖，使用上述技術中的一種或多種純化所述融合蛋白并且獲得 所述融合蛋白，可以將其進一步用于制備如下所述的疫苗。疫苗組合物本發明在第三個方面中提供了疫苗，其包含本發明的融合蛋白和藥學上可接受的 媒介物。本發明的疫苗組合物除包含所述融合蛋白外還可以包含其它藥學上可接受的組 分，諸如鹽，緩沖劑，免疫活性成分，佐劑，濕潤劑，乳化劑和助懸劑或甜味劑，矯味劑，芳香 劑和改善組合物功效所需的其它物質。如果接受者個體可以耐受其給藥，那么認為組合物 為“藥學上可接受的”。還可以通過使用本領域已知的技術合并所述融合蛋白與其它成分，包括，但不限 于白喉類毒素或破傷風類毒素或多糖類制備多價疫苗。本發明的多價疫苗的優選蛋白的其它實例包括B組鏈球菌的額外表面蛋白或其 等效物諸如R28蛋白和￡蛋白。在一個實施方案中，本發明的疫苗組合物包含B組鏈球菌R28蛋白的片段和/或 B組鏈球菌￡蛋白的片段。制備和配制疫苗組合物的方法是本領域技術人員眾所周知的。組分的選擇例如根 據組合物給藥途徑的不同而改變。例如，用于非腸道給藥的組合物包括無菌水或非水溶液， 混懸液和乳劑。非水溶劑的實例為丙二醇，植物油，諸如橄欖油，和可注射有機酯類，諸如油 酸乙酯。載體或封閉敷料可以用于增加皮膚滲透性和促進抗原吸收。用于口服給藥的液體 劑型一般可以包括含該液體劑型的脂質體溶液。用于懸浮脂質體的合適的劑型包括乳劑， 混懸液，溶液，糖漿劑和酏劑，它們包含本領域中常用的惰性稀釋劑，諸如純水。本發明的疫苗組合物可以包含額外的免疫活性成分。所述額外的免疫活性成分可 以為抗原，免疫增強物質和/或疫苗；它們中的任一種可以包含佐劑。佐劑為可以用于特別強化特異性免疫應答的物質。正常情況下，在呈遞給免疫 系統前將佐劑和組合物混合，或單獨將它們呈遞入免疫接種的動物或人的同一部位。可 以將佐劑基于其組成大致分成幾組。這些組包括油佐劑(例如弗氏完全和不完全佐 劑)，無機鹽(例如A1K(S04)2，AlNa(S04)2, A1NH4(S04). 二氧化硅，高嶺土和碳)，聚核苷 酸(例如聚IC和聚AU酸)，和某些天然物質(例如來自結核分枝桿菌的蠟D以及在小 棒桿菌(Corynebacterium parvum)或百日咳博II特菌(Bordetella pertussis)中發現 的物質和布魯桿菌屬(Brucella)中的成員。在那些物質中特別用作佐劑的是皂苷類，諸 如，例如QuilA。適用于疫苗組合物的材料的實例提供在Remington' sPharmaceutical Sciences (Osol, A, Ed, Mack Publishing Co, Easton, PA, pp. 1324-1341 (1980)中。在另一個實施方案中，本發明的融合蛋白可以用作綴合疫苗中的多糖的載體。在 該實施方案中，所述疫苗包含與多糖(諸如莢膜多糖)綴合的蛋白質，即融合蛋白。多肽，蛋白質或融合蛋白作為綴合疫苗中的多糖的載體的應用是本領域眾所周知 的，例如，參見 US 6 855 321, W0 9410317 和 US 4 496538)。所謂多糖意指由通常通過配糖鍵連接的單糖殘基組成的任意直鏈或支鏈聚合物， 且由此包括寡糖類。優選所述多糖包含2-50個單糖單位，更優選6-30個單糖單位。多糖成分可以基于或衍生于來自許多革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌病原體，諸如流感嗜血菌(H. influenzae)，腦膜炎奈瑟氏球菌(N. meningitidis)和肺炎鏈球菌 (S. pneumoniae)的多糖莢膜的多糖成分。從中多糖成分可以與本發明的載體蛋白綴合的其 它細菌包括金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、假單 胞菌屬、傷寒沙門菌(Salmonella typhi)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和痢 疾志賀氏菌(Shigelladysenteriae)。適用于本發明該方面的多糖成分包括Hib寡糖，來自 銅綠假單胞菌的脂多糖(Seid和Sadoff，1981)，來自沙門菌屬的脂多糖(Konadu等，1996) 和來自痢疾志賀氏菌的0-特異性多糖(Chu等，1991)。適用于本發明的其它多糖成分將是 本領域技術人員眾所周知的。可以通過任何合適的方法，諸如通過酸水解或超聲照射生產細菌莢膜多糖片段 (Szn等，1986)。多糖成分的其它制備方法將是本領域技術人員眾所周知的。在本發明的一個實施方案中，所述多糖為來源于B組鏈球菌的莢膜多糖或其等效 物。應當優選地使綴合疫苗的多糖成分通過共價鍵與載體蛋白偶聯。偶聯多糖和蛋 白質的特別優選的方法通過還原氨基化進行。其它方法包括使用溴化氰活化多糖，隨后 與己二酸二酰胼(間隔基)反應和使用可溶性碳二亞胺與載體蛋白的羰基化物部分綴合 (Shneerson等，1986)；使用己二酸二酰胼使載體蛋白官能化，隨后與溴化氰活化的多糖 類偶聯(Dick等，1989)；對載體蛋白和多糖進行化學修飾，隨后進行其偶聯(Marburg等， 1986 ；Marburg 等，1987 禾P 1989)。可以使多糖分子通過間隔分子，諸如己二酸與載體蛋白偶聯。這種間隔分子可以 用于促進蛋白質與多糖的偶聯。在進行偶聯反應后，可以通過滲濾或其它已知方法純化該 綴合物以便除去未反應的蛋白質或多糖成分。如果多糖來源于不同于GBS的細菌病原體，那么該綴合物可以引起針對兩種或兩 種以上病原體，例如多種類型的細菌的免疫性。這就是所述融合蛋白的潛在重要的應用。為 了制備綴合疫苗，蛋白質部分由單一融合蛋白組成具有相當的優勢。對本領域技術人員而言顯而易見，本發明的疫苗組合物可以包含非上述的其它物 質或化合物，諸如其它稀釋劑，乳化劑或穩定劑，或其它蛋白質或多糖類。這類物質或化合 物應賦予所述組合物期望的特性。預防和治療B組鏈球菌感染的方法本發明在另外的方面中提供了預防或治療由B組鏈球菌導致的感染的方法。這些 方法包括對個體給予藥學有效量的本發明的疫苗。本發明還提供了本發明的免疫原性組合 物在制備用于預防或治療由B組鏈球菌導致的感染的疫苗中的應用。使用抵抗母親和嬰幼兒中B組鏈球菌感染的疫苗的母源免疫預防長期以來作為 可能的途徑被推薦。本發明涉及的術語“預防或治療”在其各種語法形式中是指預防、治愈、逆轉、減 弱、緩解、改善、抑制、最大限度地降低、壓制或阻止1)與B組鏈球菌感染相關的病癥的有害 作用，(2)病癥發展，或(3)病癥病原體(B組鏈球菌)。此外，關注術語“預防或治療”包括 使B組鏈球菌感染的個體產生完全或部分免疫性。按照一個實施方案，該預防或治療方法包括對女性給予有效量的本發明的疫苗， 該疫苗能夠賦予所述女性的未出生后代對B組鏈球菌感染的免疫性。按照該實施方案，將所述疫苗給予非妊娠女性或妊娠女性，其時間和用量條件足以導致用于保護該女性和胎兒 或新生兒的抗體產生(通過經胎盤被動傳遞抗體)。在另一個實施方案中，該預防或治療由B組鏈球菌導致的感染的方法包括對個體 給予有效量的因第二個個體接觸本發明的疫苗而產生的抗血清。按照該實施方案，對B組 鏈球菌的抗性通過被動免疫接種被賦予該個體，即，將疫苗提供給宿主(即人或哺乳動物) 志愿者，并且回收產生的抗血清并且直接提供給懷疑具有由B組鏈球菌導致的感染的接受 者。預期可以將這類抗血清給予妊娠女性(在分娩時或分娩前)，其時間和用量條件足以使 得該抗血清可以用于保護胎兒或新生兒(通過經胎盤被動摻入該抗體)。由此可以在感染發作前(以便預防或減弱預期的感染)或在真正的感染開始后提 供本發明的疫苗或抗血清。可以將本發明的疫苗組合物或抗血清給予人或動物，包括哺乳動物和禽類，諸如 嚙齒動物(小鼠，大鼠，豚鼠或兔)；禽類(火雞，雌禽或小雞)；其它農場動物(母牛，馬，豬 或小豬)；寵物(狗，貓和其它寵物)；和人。盡管可以使用本發明的制品治療許多動物，但 是優選的治療個體為人或商業上有價值的動物和家畜。可以按照本領域已知的方法對個體給予本發明的疫苗組合物或抗血清。這類方法 包括例如非腸道施用，諸如通過所有注射途徑注入或通過皮膚例如肌內、靜脈內、腹膜內、 粘膜、粘膜下或皮下。此外，可以通過作為滴劑、噴霧劑、凝膠或軟膏局部施用于眼、鼻、口、 肛門或陰道的粘膜上皮或于身體的任何部位的外部皮膚的表皮上來施用它們。其它可能的 施用途徑通過經呼吸道吸入的噴霧劑、氣溶膠或粉末施用進行。在這最后一種情況中，可以 使用的粒度將確定該顆粒穿透入呼吸道有多深。可選擇地，施用可以通過與食物，飼料或飲 用水混合，例如作為粉末、液體或片劑或通過經消化道進行或作為液體，凝膠，片劑或膠囊 通過直接給藥入口腔或作為栓劑給藥至肛門進行。還可以以DNA疫苗的形式給予該疫苗。存在許多用于定時免疫接種的不同技術。能夠使用本發明的組合物一次以上來增 加由免疫接種動物表達的免疫球蛋白譜的表達水平和多樣性。一般而言，如果給予多次免 疫接種，那么應將它們間隔1-2個月給予。本發明涉及的術語“有效量”是指對指定條件和給藥方案提供治療作用的用量。這 是為產生期望治療作用計算的與所需添加劑和稀釋劑，即載體或給藥媒介物混合的活性物 質的預定量。此外，它用于意指足以減輕并且組優選預防宿主活動和應答中的臨床顯著缺 陷的用量。可選擇地，治療有效量足以導致宿主臨床顯著的病情改善。正如本領域技術人 員所理解的，化合物的用量可以根據其比活性的不同而改變。合適的劑量可以包含經計算 可產生期望的治療作用的與所需的稀釋劑，即載體或添加劑結合的活性組合物的預定量。 此外，給藥劑量將根據所用的一種或多種活性成分，所治療個體的年齡、體重等的不同而改 變。—般而言，該劑量由最可能使用佐劑初始注射約0. 01-10mg，且優選0. 1-1. Omg融 合蛋白抗原/個體，隨后最可能的是一次或可能多次加強注射組成。優選在初始注射后約 1和6個月時給予加強劑量。
實施例為了能夠更好地理解本發明，給出了下列實施例。然而，應理解給出下列實施例是
14為了例證本發明，而本發明并不限于這些實施例中所述的具體條件和細節。在下面的實施例中，使用下列B組鏈球菌(GBS)菌株A909(Ia型)SB35sedl(Ib 型)；1954/92 (II 型)；和 BM110(III 型)(Larsson 等 Infect. Immun. 1996. 64 :3518_3523 ； Stal harama r -Carlemalm 等 J. Exp. Med. 1993. 177 1593-1603)。菌株 BM110 為超毒力 ST-17克隆的成員。在37°C和不進行振搖下使所有GBS菌株生長在Todd-Hewitt肉湯中。本文涉及的所有菌株均可獲自本發明人所在的University ofLund and the Lund University Hospital (Doctor Gunnar Lindahl, Department of Medical Microbiology, Solvegatan 23，SE_22362Lund，瑞典)。實施例1 :Rib_和a -陰件細菌突變體的構津Rib-陰性突變體來源于含有rib基因和側翼序列的BM110. A 7kb片段，將其亞 克隆入 pJRS233(Perez-Casal 等，Mol. Microbiol. 1993.8 :809_819.)。通過反向 PCR 缺失 rib基因并且用卡那霉素抗性彈夾替代。在轉入BM110后，通過同源重組分離Rib-陰性 突變體(Perez-Casal，J.等，1993)。不同于上述的完整的rib基因在該突變體中不存在 (ffaldemarsson 等 J. Bacteriol. 2006. 188 378~388)。通過 PCR 證實該突變體的結構。該 突變體缺乏與抗-Rib血清的反應性，但不受莢膜表達的影響。通過類似技術構建A909的 a-陰性突變體。該突變體缺乏與抗_a血清的反應性，但不受莢膜或0蛋白表達的影響。t施例2:Rib和a的融合蛋白和！；它衍牛物的構律在本文所述的實施例中，使用完整的蛋白質和一系列重組蛋白(參見圖1B)。將 BM110中的Rib基因(SEQ ID NO 1)和編碼A909中a蛋白(SEQ ID NO 3)的bca基因的 片段克隆入pGEX-6P-2(AmerSham)并且用于制備GST-融合體。在除去GST部分后，純化 的衍生物具有N-末端序列GPLGS。RibN和Rib2R分別相當于Rib的氨基酸殘基1_174和 175-332，并且 aN相當于 a 的殘基 1-170 (W^S t f e 11等的編號:J. Biol. Chem. 1996.271 18892-18897)。RibN-a N 包含 Rib 的氨基酸 1-174 和 a 的氨基酸 1-170，而 Rib2R-a 2R 12包含Rib的氨基酸175-332和a的氨基酸171-334。由于使用的操作，所以每種融合蛋 白包括兩種區之間的序列EF。Rib和a分別純化自BM110和A909。實施例3 純化蛋白的分析圖1C表示通過SDS-PAGE分析純化的蛋白質。該圖從兩種凝膠合并而來。左側的 數字表示以kDa計的分子量。因為Rib和a在凝膠中異常移動，所以蛋白質的表觀大小確 實與從氨基酸序列推斷的大小不相當。實施例4 :Rib和a的重復區的免疫顯性試驗通過s. c.免疫接種在CFA中 35iig蛋白，隨后兩次加強接種在IFA中的 18iig 蛋白產生兔抗血清。給小鼠s.c.免疫接種25 yg蛋白與或不與佐劑，如所示的在4周后使 用12 yg蛋白加強接種，并且在2周后取血。就CFA小鼠而言，使用IFA給予加強劑量。基本上如所述的進行抗體結合和抑制試驗(圖ID) (SUlhammar-Carlemalm 等，J. Exp. Med. 1993. 177 :1593-1603 ； WaStfelt 等 J. Biol. Chem. 1996. 271 18892-18897)，以便分析使用明礬作為佐劑產生的小鼠抗-Rib抗體是否定向于N-末端區 和/或重復。使用白作為佐劑產生的抗體用于檢測在微量滴定孔中免疫接種的純的Rib， 并且通過添加所示的純的蛋白質(2iig)抑制結合。使用放射性標記的蛋白G檢測結合的 兔抗體并且通過與兔抗_小鼠Ig，隨后與放射性標記的蛋白G —起孵育檢測結合的小鼠抗體。計算在最低抗血清稀釋下結合的蛋白G的結合％。通過使用0. 05ug/ml的包被溶液 和稀釋1000-倍的小鼠血清優化抑制試驗的靈敏度(圖1D)。所有試驗均至少進行三次，并 且表示SDs。為了進行斑點印跡分析，將膜與所示的小鼠血清一起孵育并且通過與兔抗-小 鼠Ig，隨后與放射性標記的蛋白G —起孵育，并且實施放射自顯影術檢測結合抗體。如預計的，與Rib的結合被Rib完全抑制，并且使用Rib2R也觀察到大量幾乎完全 的抑制，而RibN具有極小的作用。因此，幾乎所有抗體均定向于重復單位。Rib2R的抑制為 非特異性的，因為它不抑制抗體與無關GBS抗原結合(數據未顯示)。在a系統中，斑點印跡分析顯示抗-a與完整a反應，而不與a N反應(圖1E， 左側)。aN缺乏反應性并非該構建體的內在特性，因為抗-aN與a和aN均反應(圖 1E，右側)。Rib和a中的重復區的免疫顯性原因尚不了解。B細胞上重復單位與Ig受體之間 的多價相互作用可以促成，但Rib和a并非不依賴于T-細胞的抗原，因為它們引起IgG反 應。顯然對NH2-末端區的免應答差并非因掩蔽所致，因為這些區可接近抗體(參見下文)。實施例5 被動疫苗接種因為針對Rib和a的抗體幾乎僅定向于重復單位并且具有保護性，所以顯然融合 蛋白疫苗應來源于該重復單位。然而，得到的數據不包括分離的N-末端區的保護性可能超 過了所述重復單位并且適合于構建融合蛋白。為了分析這種推斷，我們使用了 Rib系統直 接比較抗體定向于N-末端區或重復單位的保護能力。該分析使用了由RibN或Rib2R產生 的兔抗體和被動疫苗接種小鼠模型。如所述的使用C3H/HeN小鼠，兔抗血清和LD9(1劑量的log-期細菌(105_106CFU， 取決于所用的菌株)進行被動疫苗接種(SUlhammar -Carlemalm等，J. Exp. Med. 1993. 177 1593-1603)在96小時期限過程中記錄存活率。為了進行主動疫苗接種，給 小鼠s.c.免疫接種混合了明礬的10 yg蛋白。4周后使用明礬給予5 yg加強劑量。對照 組小鼠接受PBS和明礬。加強劑量后2周，仗/::」.劑量的細菌攻擊小鼠并且記錄存活 率。所有實驗均得到有關動物研究的管理部門廣泛的綜合批準。抗體與表達Rib的細菌反應，但不與Rib-陰性突變體反應，表明它們識別Rib天 然形式上暴露的表位(圖2A)。因為抗-RibN具有高于抗-Rib2R 7-倍的滴度，所以將其 稀釋至能夠在小鼠模型中直接比較。在該模型中，每種抗血清均預防致命性感染(圖2B)， 并且稀釋的抗-RibN至少保護未稀釋的抗-Rib2R。p值是指與96小時時的預先免疫的對 照組的比較。在Rib系統中的結果提示應將來源于Rib和a的N-末端區的融合蛋白與來 源于重復單位的融合蛋白比較。然而，需要來源于N-末端區的融合蛋白并不明顯，因為這 些區表現出61%的殘基同一性(圖1A)，提示它們可能交叉反應。交叉反應性在預先的研 究中未得到注意，這些研究使用針對完整蛋白的抗體，即主要針對重復單位的抗體。用抗-RibN和抗-a N分析這種推定(圖3A)。每種抗血清與表達Rib的菌株BM110 的完整細菌反應(左側，開放式符號)，而不與Rib-陰性突變體反應(左側，封閉式符號)。 類似地，每種抗血清與表達a的菌株A909的細菌反應(右側，開放式符號)，而不與a-陰 性突變體反應(右側，封閉式符號)。使用每種類型的兩種兔血清獲得類似的數據。這表 明N-末端區缺乏交叉反應性。由此構建了融合蛋白RibN-a N并且與來源于重復單位的 類似大小的融合蛋白Rib2R_a2R比較。在兔中，融合蛋白RibN-a N引起的抗體應答優于Rib2R-a2R，正如通過與表達Rib-或a -的細菌的交叉反應性判斷的(圖3B)。為了在被 動保護的小鼠模型中進行比較，由此將抗-(RibN-aN)稀釋至與抗-(Rib2R-a 2R)相同的 滴度。每種抗血清預防表達Rib的III型菌株和表達a的la型菌株(圖3C)。因此，兩種 融合蛋白各自產生針對Rib和a的保護性抗體。實施例6 :GBS的多血清型的被動疫苗接種被動疫苗接種模型用于分析抗-(RibN-a N)提供的保護是否不依賴于莢膜血清 型。在使用表達Rib的II型菌株和表達a的lb型菌株進行的實驗中觀察到了良好的保護 (圖3D)。因此，抗-(RibN-aN)預防了 4種類型的血清型Ia，lb, II和III的表達Rib和 a的菌株。這種預防作用為非特異性的，因為抗-(RibN-aN)不預防Rib-陰性突變體(圖 3E)。顯然，Rib陰性突變體可以用于這種分析，因為它未在小鼠模型中表現出毒力降低。針 對RibN-aN的抗體也識別表達Rib和a與相關的兩種蛋白質R28和￡蛋白的菌株，這兩 種蛋白分別由血清型V和la的許多菌株表達(Lindahl等Clin. Microbiol. Rev 2005. 18 102-127 ;Brimil 等 Int J Med. Microbiol. 2006. 296 :39_44)。然而，預防表達 R28 或 e 的 菌株可能需要構建包括這些蛋白質的N-末端區的融合蛋白。實施例7 主動疫苗接種圖4表示來自使用RibN-aN融合蛋白進行主動免疫接種的結果。(A)在使用或 不使用佐劑給藥時RibN- a N的免疫原性。給4組小鼠免疫接種混合了 CFA，明礬或PBS的 RibN- aN,4周后加強劑量并且2周后取血。分析小鼠血清與在微量滴定孔中免疫接種的純 抗原的反應性。通過與兔抗_小鼠Ig，隨后與放射性標記的蛋白G —起孵育檢測結合的小 鼠抗體。(B)主動疫苗接種RibN-aN。給小鼠(y_軸上所示的數)免疫接種混合了明礬的 純RibN-aN，4周后加強劑量并且2周后使用Rib的III型菌株BM110 (左)或表達a的 la型菌株A909(右)攻擊。對照組小鼠接受PBS和明礬。從兩次實驗中采集a-菌株的數 據。P值是指在96小時時的比較。在使用純RibN-aN進行的主動免疫接種中，這種蛋白質對小鼠而言在免疫原性 方面與給予CFA，明礬或PBS (圖4A)時等同。此外，主動免疫接種RibN-aN和明礬預防了 小鼠的表達Rib和a的菌株(圖4B)。因此，RibN-a N使用人體應用可接受的佐劑引起了 保護性免疫。RibN-a N產生的抗體幾乎不包括IgG類(數據未顯示)。推斷至人體，這些數據 提示胎兒可以受到母源抗-(RibN-aN)抗體保護。這一結論得到了針對完整Rib和a的 抗體經過人體胎盤轉移這一發現的支持。與使用RibN-aN獲得的結果相反，Rib2R-a2R蛋白僅在接受抗原與明礬或PBS的 4種CFA小鼠之一中產生抗體(數據未顯示)。因此，Rib2R-a2R對小鼠而言免疫原性差， 不過，完整Rib和a對重復單位引起良好的免疫應答。這些數據確證了 RibN-aN作為疫 苗成分特別有意義的結論。實施例8 針對RibN- a N的抗體預防侵入上皮細胞圖5表示針對RibN-a N的抗體預防對人上皮細胞的侵入。(A)Rib和a在上皮 細胞侵入中的作用。將菌株BM110的Rib-陰性突變體(左)和菌株A909的a -陰性突 變體(右)與相應的野生型(WT)細菌比較它們侵入人宮頸細胞系ME180的細胞的能力。 ⑶抗-(RibN-aN)對上皮細胞侵入的抑制。將菌株BM110(左)或A909(右)的細菌與兔
17抗-(RibN-aN)或預先免疫血清一起孵育，此后用于侵入測定。(A)和B組中所有的數據均 基于三次不同的實驗。顯示了 SD和p值。用PBS洗滌細菌培養物過夜，重新懸浮于DME中(補充了 lOmMIfepes和4mM L-谷 氨酰胺)至1x107CFU ml-1，并且將樣品(500 ill)加入到人宮頸細胞系ME180單層中(ATCC HTB33)，在24孔平板的孔中生長至100%匯合。加入的細菌在6. 7xl06CFU-2. 7xl07CFU的范 圍。以800xg將平板離心10分鐘并且在37°C下孵育1小時。使用PBS洗滌5次后，向每個 孔中加入包含慶大霉素(500 iig ml-1)和青霉素G(5iig ml-1)的DME(lml)并且連續孵育 2小時。用PBS洗滌3次后，使用胰蛋白酶-EDTA分離細胞并且用0.025% TritonX-100溶 解細胞，且通過鋪板測定胞內細菌。為了分析抗血清對侵入的抑制，將洗滌的細菌(500 yl) 與抗血清(50 yl)混合并且在室溫下孵育30分鐘。將該混合物加入到ME180單層中。測 定與抗血清一起孵育前和之后的CFU數量。然后如上所述進行分析。預先免疫兔血清用作 對照組。在沒有抗血清存在下侵入ME180的細菌部分占接種物的0. 13-0. 37%。在靈長類模型中的研究表明GBS在感染過程中侵入了上皮細胞。因為a促進了 體外GBS的侵入，所以我們使用GBS突變體比較了 Rib和a在侵入方面的作用(圖5A)。 人ME180細胞的侵入就Rib突變體而言比親代菌株降低了 20-倍，而就a突變體而言比 親代菌株降低了 4-倍。因此，Rib和a共有促進侵入的能力。這種潛在的重要功能被 抗-(RibN-aN)有效阻斷(圖5B)。在侵入針對減少并非因抗體介導的細菌聚集所致，它在 所用條件下并不出現(數據未顯示)。這一結果提示抗-(RibN-aN)阻斷了生物學的重要 功能。統計學分析.使用Fisher' s 2_尾確切檢驗分析來自小鼠保護試驗的數據。對 來自上皮細胞侵入試驗的數據的分析基于對兩種獨立二項式分布變量的最大似然估計值 的標準正態近似。將差異在統計學上視為具有顯著性，其中P < 0. 05。總之，我們的工作表明Rib和a的N_末端區可以用于衍生優于來源于所述重復 單位的融合蛋白疫苗。此外，就人GBS疫苗而言，我們的數據顯示RibN-aN融合蛋白可以 引起針對許多臨床重要菌株，包括大部分導致腦脊膜炎的菌株的保護性免疫。盡管通過實施例描述了本發明的優選實施方案，但是顯然本領域技術人員可以對 本發明進行變型和改變。不過，顯然可以理解這類變型和改變屬于如權利要求中所述的本 發明范圍。
權利要求
融合蛋白，包含B組鏈球菌表面蛋白或其類似物，同源物，衍生物或免疫相關的氨基酸序列或片段中的至少一種第一N-末端區片段，其與B組鏈球菌表面蛋白或其類似物，同源物，衍生物或免疫相關的氨基酸序列或片段中的至少一種第二N-末端區片段融合，其中所述B組鏈球菌表面蛋白中的第一和第二的至少一種N-末端區片段來源于不同B組鏈球菌菌株，并且其中所述融合蛋白能夠引起針對B組鏈球菌的保護性免疫。
2.權利要求1所述的融合蛋白，其中所述至少一種第一N-末端區片段為Rib蛋白，其 與為α蛋白的至少一種第二 N-末端區片段融合，其中所述融合蛋白能夠引起針對B組鏈 球菌的保護性免疫。
3.權利要求1-2中任意一項所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含a.至少一種第一氨基酸序列SEQID NO :2或其類似物，同源物，衍生物或免疫相關的 氨基酸序列或片段，其與b.至少一種第二氨基酸序列SEQID NO :4或其類似物，同源物，衍生物或免疫相關的 氨基酸序列或片段融合。
4.權利要求3所述的融合蛋白，其中所述至少一種第一氨基酸序列包含與如SEQID NO 2中所示的氨基酸序列具有至少80，85，90，95，96，97，98或99%序列同一性的氨基酸序 列。
5.權利要求3所述的融合蛋白，其中所述至少一種第二氨基酸序列包含與如SEQI D NO 4中所示的氨基酸序列具有至少80，85，90，95，96，97，98或99%序列同一性的氨基酸序 列。
6.權利要求1-5中任意一項所述的融合蛋白，其中該融合蛋白包含如SEQID N0:6中 所示的氨基酸序列。
7.權利要求1-5中任意一項所述的融合蛋白，其中該融合蛋白包含選自SEQID NO 2 和SEQ ID NO :4的三種或三種以上氨基酸序列或其部分的混合物。
8.上述權利要求中任意一項所述的融合蛋白，其中該融合蛋白進一步包含B組鏈球菌 R28蛋白的N-末端區片段和/或B組鏈球菌ε蛋白的N-末端區片段。
9.分離的核苷酸序列，包含編碼權利要求1-8中任意一項的融合蛋白的核苷酸序列。
10.核苷酸序列，包含a.如SEQID NO :1中所示的至少一種第一核苷酸序列或其片段，其與b.如SEQID NO :3中所示的至少一種第二核苷酸序列或其片段，或c.如SEQID NO 5中所示的至少一種核苷酸序列融合。
11.包含權利要求9-10中任意一項的核苷酸序列的載體。
12.包含權利要求11的載體的宿主細胞。
13.權利要求12所述的宿主，其中所述宿主為革蘭氏陰性菌細胞、革蘭氏陽性菌細胞、 酵母細胞、昆蟲細胞、動物細胞、非洲綠猴細胞、人細胞或植物細胞。
14.權利要求13所述的宿主，其中所述宿主細胞選自大腸桿菌(E.coli)，假單 胞菌屬(Pseudomonas),芽孢桿菌屬(Bacillus),鏈霉菌屬(Streptomyces),曲霉 屬(aspergillus)，乳桿菌屬(Iactobacillus)，志賀氏菌屬(shigella)，沙門氏菌屬 (salmonella),禾丨J其Jf特氏菌屬(listeria),鏈球菌屬(streptococcu s),葡萄球菌屬 (staphylococcus)和真菌。
15.生產所述融合蛋白的方法，包括下列步驟a.提供權利要求12-14中任意一項的宿主細胞，b.使所述宿主細胞繁殖，c.純化所述融合蛋白，和d.獲得所述融合蛋白。
16.生產權利要求1-8中任意一項所述融合蛋白的方法，其中所述方法包括不含細胞 的表達系統。
17.疫苗，包含藥學有效量的權利要求1-8中任意一項的融合蛋白或權利要求9-10的 核苷酸序列或權利要求11的載體或權利要求12-14的宿主，并且包含藥學上可接受的媒介 物，其中所述疫苗組合物能夠引起針對B組鏈球菌的保護性免疫。
18.權利要求17所述的疫苗，其進一步包含佐劑。
19.權利要求17-18中任意一項的疫苗，其中所述融合蛋白與多糖綴合形成綴合疫苗。
20.權利要求17-19中任意一項的疫苗，其中所述融合蛋白與細菌多糖綴合。
21.權利要求20所述的疫苗，其中所述細菌多糖為B組鏈球菌多糖。
22.權利要求1-8中任意一項的融合蛋白或權利要求9-10的核苷酸序列或權利要求 11的載體或權利要求12-14的宿主在制備用于預防或治療B組鏈球菌導致的感染的疫苗中 的應用。
23.預防或治療B組鏈球菌導致的感染的方法，該方法包括對個體給予有效量的權利 要求17-21中任意一項的疫苗。
24.權利要求23所述的方法，該方法包括對女性給予有效量的權利要求17-21中任意 一項的疫苗，它能夠賦予所述女性未出生的后代對所述感染的免疫性。
25.權利要求23-24中任意一項所述的方法，其中所述疫苗通過非腸道、肌內、靜脈內、 腹膜內、真皮內、粘膜、粘膜下、局部或皮下給予。
26.預防或治療B組鏈球菌導致的感染的方法，該方法包括對個體給予有效量的因使 第二個個體接觸權利要求17-21中任意一項的疫苗而產生的抗體。
全文摘要
本發明涉及微生物學和疫苗技術領域，并且涉及能夠賦予對B組鏈球菌感染的免疫性的疫苗的研發。更具體地說，本發明涉及包含B組鏈球菌表面蛋白的N-末端區片段的新融合蛋白，它賦予對B組鏈球菌的侵入菌株的免疫性。本發明進一步涉及編碼所述融合蛋白的分離的核苷酸序列；載體；宿主細胞；疫苗；和預防或治療B組鏈球菌感染的方法。
文檔編號A61P31/04GK101855238SQ200880020390
公開日2010年10月6日 申請日期2008年4月14日 優先權日2007年4月16日
發明者G·林達爾 申請人:隆德大學開發公司