一種雞新城疫病毒毒株及其在制備雞新城疫病疫苗中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種雞新城疫病毒毒株及其在制備雞新城疫病疫苗中的應用。本發明提供的雞新城疫病毒毒株，其制備方法包括如下步驟：將重組質粒pBrClone30-GM-CSF、pBL-N質粒、pBL-P質粒和pBL-L質粒共轉染哺乳動物細胞并培養，得到所述雞新城疫病毒毒株；所述重組質粒pBrClone30-GM-CSF為具有序列表的序列3自5’末端第2703-18408位核苷酸所示的DNA分子的質粒。本發明通過在現有新城疫活疫苗基因組中引入分子佐劑GM-CSF，可以有效提高免疫效果，極大縮短免疫空白期，同時可抵抗母源抗體，提高免疫保護率。本發明對于新城疫病的防治具有重大價值。
【專利說明】一種雞新城疫病毒毒株及其在制備雞新城疫病疫苗中的應用

【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及一種雞新城疫病毒毒株及其在制備雞新城疫病疫苗中的應用。

【背景技術】
[0002]新城疫病(Newcastle Disease, ND),又稱亞洲雞痕,是由新城疫病毒(NewcastleDisease Virus,NDV)引起的一種禽類高度接觸性和急性敗血性的傳染病，是嚴重危害世界養禽業的重大烈性傳染病之一。NDV是一種RNA病毒，幾乎可以感染所有禽類，病雞是該病的主要傳染源，雞感染后臨床癥狀出現前24h，其口、鼻分泌物和糞便就有病毒排出。病毒存在于病雞的所有組織器官、體液、分泌物和排泄物中。在流行間歇期的帶毒雞，也是本病的傳染源。鳥類也是重要的傳播者。病毒可經消化道、呼吸道，也可經眼結膜、受傷的皮膚和泄殖腔黏膜侵入機體。該病一年四季均可發生，但以春秋季較多。雞場內的雞一旦發生本病，可于4~5d內波及全群。
[0003]目前，預防新城疫的主要方法是接種疫苗免疫。由于弱毒疫苗使用方便且能夠誘導體液免疫和局部黏膜免疫，在國內外被普遍應用。但此類疫苗常常需要在首次接種后的15天左右才能產生相應保護抗體，即存在免疫空白期。如果新城疫一旦爆發在疫苗接種的免疫空白期，雞群將無法得到有效的免疫保護。因此，在新城疫的預防工作中，迫切需要一種可以刺激機體快速產生抗體從而縮短免疫空白期的高效安全的新型弱毒疫苗。此外，母源抗體的干擾是新城疫疫苗早期免疫失敗的重要原因之一，抵抗母源抗體干擾的新城疫疫苗，在新城疫免疫實踐中具有十分重要的意義。


【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供一種雞新城疫病毒毒株及其在制備雞新城疫病疫苗中的應用。
[0005]本發明提供的雞新城疫病毒毒株(命名為rClone30-GM-CSF病毒)，其制備方法包括如下步驟:將重組質粒pBrClone30-GM-CSF、pBL-N質粒、pBL_P質粒和pBL_L質粒共轉染哺乳動物細胞并培養，得到所述雞新城疫病毒毒株；所述重組質粒pBrClone30-GM-CSF為具有序列表的序列3自5’末端第2703-18408位核苷酸所示的DNA分子的質粒。序列表的序列3自5’末端第2703-18408位核苷酸所示的DNA分子即為rClone30-GM_CSF病毒的基因組DNA。
[0006]所述重組質粒pBrClone30-GM_CSF具體可為序列表的序列3所示的質粒。
[0007]所述哺乳動物細胞具體可為BHK-21細胞。
[0008]rClone30-GM_CSF病毒的制備方法具體如下:
[0009] (I)將所述重組質粒pBrClone30-GM-CSF、pBL-N質粒、pBL_P質粒和pBL_L質粒共轉染BHK-21 細胞(每1\106個細胞轉染14 8重組質粒？81"(:101^30-61^5?、0.54 8 pBL-N質粒、0.25 μ g pBL-P質粒和0.1 μ g pBL-L質粒)，置于5% C02、37°C環境中靜置培養72h ;
[0010](2)取步驟(1)得到的轉染細胞，反復凍融3次，離心收取細胞上清液，然后接種于9-11日齡SPF雞胚尿囊腔，置于37°C環境中培養72h，收集雞胚尿囊液(其中含有rClone30-GM-CSF 病毒)。
[0011]rClone30-GM-CSF病毒的制備方法具體如下:
[0012](I)將所述重組質粒pBrClone30-GM-CSF、pBL-N質粒、pBL_P質粒和pBL_L質粒共轉染BHK-21 細胞(每1\106個細胞轉染14 8重組質粒？81"(:101^30-61^5?、0.54 8 pBL-N質粒、0.25 μ g pBL-P質粒和0.1 μ g pBL-L質粒)，置于5% C02、37°C環境中靜置培養72h ;
[0013](2)取步驟(1)得到的轉染細胞，反復凍融3次，離心收取細胞上清液，然后接種于9-11日齡SPF雞胚尿囊腔，置于37°C環境中培養72h，收集雞胚尿囊液；
[0014](3)取步驟⑵得到的雞胚尿囊液，接種于新的9-11日齡SPF雞胚尿囊腔，置于37°C環境中培養72h，收集雞胚尿囊液；
[0015](4)取步驟(3)得到的雞胚尿囊液，接種于新的9-11日齡SPF雞胚尿囊腔，置于37°C環境中培養72h，收集雞胚尿囊液；
[0016](5)將步驟⑵得到的雞胚尿囊液、步驟(3)得到的雞胚尿囊液和步驟⑷得到的雞胚尿囊液混合，得到混合液，即為rClone30-GM-CSF病毒液。
[0017]本發明還保護一種雞新城疫病毒毒株(命名為rClone30-GM-CSF病毒)，其基因組DNA如序列表的序列3自5 ’末端第2703-18408位核苷酸所示。
[0018]本發明還保護以上任一所述的雞新城疫病毒毒株在制備雞新城疫病疫苗中的應用。
[0019]本發明還保護一種雞新城疫病疫苗，包括以上任一所述的雞新城疫病毒毒株。
[0020]本發明提供一種新的雞新城疫病毒毒株，命名為rClone30-GM_CSF，因此簡稱毒株rClone30-GM-CSFo毒株rClone30-GM_CSF是將chGM-CSF多肽的編碼基因插入到雞新城疫病毒毒株Clone30 (簡稱毒株Clone30，弱毒株，為現有的新城疫病活疫苗)的基因組的F基因和HN基因之間得到的重組病毒株。毒株rClone30-GM-CSF免疫雞群后，可以使雞快速產生抗體，將免疫空白期從15天縮短為7天，彌補了現有新城疫活疫苗產生抗體時間過長的缺點，在母源抗體存在的情況下仍可以激發幼雞產生抗體，解決了現有疫苗不能抵抗母源抗體的缺點。
[0021]本發明構建的重組新城疫病毒可視為基因工程改造后的弱毒疫苗株，可制備為任何常規制劑，如凍干粉針制劑、液體疫苗制劑等。
[0022]本發明通過在現有新城疫活疫苗基因組中引入分子佐劑GM-CSF，可以有效提高免疫效果，極大縮短免疫空白期，同時可抵抗母源抗體，提高免疫保護率。本發明對于新城疫病的防治具有重大價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為重組質粒pBrClone30-GM_CSF的元件示意圖。
[0024]圖2為混合液的HA效價和HI效價結果。
[0025]圖3為PCR鑒定電泳圖。
[0026]圖4為實施例2的結果。
[0027]圖5為實施例3的結果。
[0028]圖6為實施例4的結果。
[0029]圖7為實施例5的結果。

【具體實施方式】
[0030]以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。
[0031]提及“pBrClone30 質粒”的文獻！“Enhancement of ant1-tumor activity ofNewcastle disease virus by the synergistic effect of cytosine deaminase，，, ZhengLVj Asian Pac J Cancer Ptev.。
[0032]提及“pBL-N 質粒”、“pBL-P 質粒”和 “pBL_L 質粒”的文獻！Geneticallyengineered Newcastle disease virus expressing interleukin 2 is a potential drugcandidate for cancer immunotherapy, Fuliang Baij Immunology letters.。
[0033]pBK:lone30質粒中具有新城疫病毒的NP基因、P基因、M基因、F基因、HN基因和L基因，其中F基因和HN基因之間具有HpaI和MluI酶切識別位點。將pBK:lone30質粒、PBL-N質粒、pBL-P質粒和pBL-L質粒共轉染哺乳動物細胞并培養(pBL_N質粒、pBL_P質粒和pBL-L質粒起輔助作用，pBrClone30質粒提供病毒的全基因組)，得到毒株Clone30。
[0034]提及“NDV強毒BJ株”的文獻:“雞新城疫病毒強毒株的分離鑒定及其遺傳變異分析”，校海霞，河北農業大學碩士學位論文。
[0035]BHK-21 細胞:ATCC 編號為 CRL-13001。
[0036]DF-1 細胞:ATCC 編號為 CRL-12203。
[0037]SPF級白色來航雞:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所實驗動物中心。
[0038]chGM-CSF多肽的全稱為雞粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子，如序列表的序列2所示，其編碼基因的開放閱讀框如序列表的序列I自5’末端第16至450位核苷酸所示。
[0039]完全DMEM培養基即為含有5%胎牛血清的DMEM培養基。
[0040]雞血紅細胞凝集(HA)試驗的具體方法如下:⑴在血凝板第一排的1-12孔各加Λ 50 μ L生理鹽水；(2)在第I孔中加入50 μ L待測病毒液，混勻后吸50 μ L到第2孔，如此倍比稀釋直到第10孔，第10孔混勻后棄除50yL ;(3)在1-12孔中各加入50 μ LI %雞血紅細胞；(4)震蕩后室溫靜置20-30min，觀察結果。
[0041]雞血紅細胞凝集抑制(HI)試驗的具體方法如下:(I)在血凝板的1-12孔各加入25 μ L生理鹽水；(2)第I孔加入待檢血清25 μ L，混勻后吸25 μ L至第2孔，倍比稀釋直至第10孔，第10孔混勻后棄除25 μ L ; (3)在1-12孔中各加入25 μ L實施例1制備的rClone30病毒液(4個血凝單位)，室溫靜置30min ； (4)在1_12孔中各加入25 μ LI %雞血紅細胞；(5)震蕩后室溫靜置30-40min，觀察結果。
[0042]實施例l、rClone30-GM_CSF病毒液的制備
[0043]一、重組質粒的構建
[0044]1、合成序列表的序列I所示的雙鏈DNA分子。
[0045]序列表的序列I中，自5’末端第I至6位核苷酸為限制性內切酶HpaI的識別序列，第10-15位核苷酸為Kozac序列，第16至450位核苷酸為chGM-CSF多肽的編碼基因，第451至456位核苷酸為限制性內切酶Mlu I的識別序列。
[0046]2、用限制性內切酶HpaI和MluI雙酶切步驟I得到的雙鏈DNA分子，回收酶切產物。
[0047]3、用限制性內切酶HpaI和MluI雙酶切pBrClone30質粒，回收約16000bp的載體骨架。
[0048]4、將步驟2的酶切產物和步驟3的載體骨架連接，得到重組質粒pBrClone30-GM-CSFo重組質粒pBrClone30-GM_CSF的核苷酸序列如序列表的序列3所示(序列表的序列3中，自5’末端第2703-18408位核苷酸為rClone30-GM_CSF病毒的基因組)。重組質粒pBrClone30-GM-CSF的元件示意圖見圖1。
[0049]二、重組病毒的制備
[0050]1、將重組質粒pBrClone30-GM-CSF、pBL_N質粒、pBL-P質粒和pBL_L質粒共轉染BHK-21 細胞(每 I X 16 個細胞約轉染 I μ g 重組質粒 pBrClone30-GM-CSF、0.5 μ g pBL-N質粒、0.25 μ g pBL-P質粒和0.1 μ g pBL-L質粒)，置于5% C02、37°C環境中靜置培養72h。
[0051]2、取步驟I得到的轉染細胞，反復凍融3次，離心收取細胞上清液，然后接種于9-11日齡SPF雞胚尿囊腔，置于37°C環境中培養72h，收集雞胚尿囊液(該雞胚尿囊液的HA效價為4096，HI效價為256)。
[0052]3、取步驟2得到的雞胚尿囊液，接種于新的9-11日齡SPF雞胚尿囊腔，置于37°C環境中培養72h，收集雞胚尿囊液(該雞胚尿囊液的HA效價為2048，HI效價為1024)。
[0053]4、取步驟3得到的雞胚尿囊液，接種于新的9-11日齡SPF雞胚尿囊腔，置于37°C環境中培養72h，收集雞胚尿囊液(該雞胚尿囊液的HA效價為1024，HI效價為512)。
[0054]5、將步驟2得到的雞胚尿囊液、步驟3得到的雞胚尿囊液和步驟4得到的雞胚尿囊液混合，得到混合液(該混合液的HA效價為2048，HI效價為512，見圖2)。
[0055]6、取步驟5得到的混合液，提取總RNA并反轉錄為cDNA，采用Fl和Rl組成的引物對進行 PCR 鑒定(Fl:5 , -GTTAACGCCGCCACCATGCTGGCACAGCTGACTATTCTGC-3 , ；R1:5 , -ACGCGTTTAGATGCAGTCTTTCTCCTCTGGC-3 ^ )，結果見圖3。PCR擴增片段大小約為450bp，與預期相符。
[0056]結果表明，成功制備了具備感染性的表達chGM-CSF多肽的NDV病毒，將步驟5得到的混合液命名為rClone30-GM-CSF病毒液。
[0057]三、對照病毒的制備
[0058]用pBrClone30質粒代替重組質粒pBrClone30-GM_CSF進行步驟二的I至5,得到的混合液命名為rClone30病毒液。
[0059]實施例2、檢測病毒液中chGM-CSF的表達量
[0060]1、將對數生長期的DF-1細胞接種于六孔板，以0.1MOI的劑量感染實施例1制備的rClone30-GM-CSF病毒液(rClone30-GM_CSF病毒液用完全DMEM培養基稀釋)，37°C靜置孵育lh，然后用完全DMEM培養基洗滌三遍，然后加入含I μ g/mL胰蛋白酶的完全DMEM培養基并置于5% C02、37°C環境中靜置培養48h，然后反復凍融3次，取上清液。
[0061]2、用實施例1制備的rClone30病毒液代替rClone30-GM-CSF病毒液，其它同步驟
1
[0062]3、采用GM-CSF試劑盒(CSB-E17363C，Cusab1)并按說明書進行操作，分別檢測步驟I得到的上清液和步驟2得到的上清液中的chGM-CSF的濃度。
[0063]結果見圖4。結果表明，rClone30-GM-CSF病毒能夠穩定表達chGM-CSF，而rClone30 病毒不表達 chGM-CSF。
[0064]實施例3、rClone30-GM_CSF病毒與rClone30病毒在宿主細胞中的動力生長曲線
[0065]1、將對數生長期的DF-1細胞接種于六孔板，以0.1MOI的劑量將實施例1制備的rClone30-GM-CSF病毒液(rClone30-GM_CSF病毒液用完全DMEM培養基稀稀釋)接種于細胞單層，采用含I μ g/mL胰蛋白酶的完全DMEM培養基，置于5% CO2、37°C環境中靜置培養96h，每隔24h取上清液并測定TCID5Q。
[0066]2、用實施例1制備的rClone30病毒液代替rClone30-GM_CSF病毒液，其它同步驟
1
[0067]結果見圖5。rClone30-GM-CSF病毒與rClone30病毒保持著一致的繁殖滴度。結果表明，chGM-CSF的編碼基因的插入并不影響rClone30病毒的增殖能力。
[0068]實施例4、rClone30-GM-CSF病毒或rClone30病毒免疫雞后的HI抗體效價
[0069]參照農業部標準，青年雞的抗體效價> 51og2時判為合格。特別是在30日齡前后抗體水平低于此標準，如果在此期間有強毒侵入，就有可能暴發新城疫。如果雞群能在此期間達到此標準，將不受新城疫病毒的威脅。
[0070]取30日齡的SPF級白色來航雞，隨機分為3組，每組10只。分別處理如下(均為單次免疫):
[0071]第一組:每只通過滴鼻點眼的方式免疫200 μ L實施例1制備的rClone30-GM-CSF病毒液(rClone30-GM-CSF病毒液用完全DMEM培養基稀釋，用于免疫的病毒液的濃度為15TCID50A).1ml)；
[0072]第二組:每只通過滴鼻點眼的方式免疫200 μ L實施例1制備的rClone30病毒液(rClone30病毒液用完全DMEM培養基稀釋，用于免疫的病毒液的濃度為105TCID5(l/0.lml)；
[0073]第三組:每只通過滴鼻點眼方式免疫200 μ L0.9%生理鹽水。
[0074]分別于免疫后7d、14d、21d翅靜脈采血分離血清，檢測HI效價。
[0075]結果見圖6。免疫后7d，第一組血清的HI效價高于51og2，第二組的效價低于31og2,即rClone30-GM-CSF病毒液將可以實現早期保護效果，使雞免受新城疫病毒的威脅，而rClone30病毒液將無法在免疫后7d實現有效保護雞免受新城疫病毒的威脅。
[0076]實施例5、重組病毒rClone30-GM_CSF或rClone30免疫含母源抗體的雞后的HI抗體效價
[0077]在養雞生產中，一個雞群的母源抗體水平往往參差不齊，其中一些母源抗體水平較低的雛雞在其幼齡階段易感染野毒和帶毒，當其它雛雞母源抗體水平下降時，它們亦依次受感染，使野毒在雞群中的傳播連綿不斷，遺留很大的潛在威脅。據有關文獻報道，蛋雞出雛后在不同日齡測定其新城疫母源抗體水平，結果顯示:1日齡母源抗體為6.61og2 ；7日齡時抗體水平下降為4.71og2 ;到10日齡時抗體水平降到41og2以下，如果以抗體效價41og2為臨界保護值，I日齡雛雞母源抗體保護率為95%，7日齡母源抗體保護率為80%，到10日齡時母源抗體保護率只有50%。
[0078]取I日齡的含母源抗體的白色來航雞，隨機分為3組，每組10只。分別處理如下(均為單次免疫):
[0079]第一組:每只通過滴鼻點眼的方式免疫200 μ L實施例1制備的rClone30-GM-CSF病毒液(rClone30-GM-CSF病毒液用完全DMEM培養基稀釋，用于免疫的病毒液的濃度為15TCID50A).1ml)；
[0080]第二組:每只通過滴鼻點眼的方式免疫200 μ L實施例1制備的rClone30病毒液(rClone30病毒液用完全DMEM培養基稀釋，用于免疫的病毒液的濃度為105TCID5(l/0.lml)；
[0081]第三組:每只通過滴鼻點眼方式免疫200 μ L0.9%生理鹽水。
[0082]分別于免疫后OcU 6d翅靜脈采血分離血清，檢測HI效價。
[0083]結果見圖7。
[0084]實施例6、攻毒試驗
[0085]將30日齡SPF級白色來航雞隨機分為3組，每組30只。分別處理如下(均為單次免疫):
[0086]第一組:實驗第I天，每只通過滴鼻點眼方式免疫200 μ L實施例1制備的rClone30-GM-CSF病毒液(rClone30-GM_CSF病毒液用完全DMEM培養基稀釋，用于免疫的病毒液的濃度為15TCID5tlA).lml)；
[0087]第二組:實驗第I天，每只通過滴鼻點眼方式免疫200 μ L實施例1制備的rClone30病毒液(rClone30病毒液用完全DMEM培養基稀釋，用于免疫的病毒液的濃度為15TCID50A).1ml)；
[0088]第三組:實驗第I天，每只通過滴鼻點眼方式免疫200 μ L0.9%生理鹽水。
[0089]實驗第8天，采用NDV強毒BJ株進行攻毒(每只雞采用14 ELD5tl的劑量經肌肉注射途徑攻毒，攻毒體積為0.1ml)，實驗第18天，統計各組的發病與死亡情況。結果見表1。
[0090]表1各組的發病與死亡情況統計(三次試驗的平均值)
[0091]

【權利要求】
1.一種雞新城疫病毒毒株，其制備方法包括如下步驟:將重組質粒pBrClone30-GM-CSF、pBL-N質粒、pBL-P質粒和pBL_L質粒共轉染哺乳動物細胞并培養，得到所述雞新城疫病毒毒株；所述重組質粒pBrClOne30-GM-CSF為具有序列表的序列3自5’末端第2703-18408位核苷酸所示的DNA分子的質粒。
2.如權利要求1所述的雞新城疫病毒毒株，其特征在于:所述重組質粒pBrClone30-GM-CSF為序列表的序列3所示的質粒。
3.如權利要求1或2所述的雞新城疫病毒毒株，其特征在于:所述哺乳動物細胞為BHK-21 細胞。
4.一種雞新城疫病毒毒株，其基因組DNA如序列表的序列3自5’末端第2703-18408位核苷酸所示。
5.權利要求1至4中任一所述的雞新城疫病毒毒株在制備雞新城疫病疫苗中的應用。
6.一種雞新城疫病疫苗，包括權利要求1 至4中任一所述的雞新城疫病毒毒株。
【文檔編號】A61K39/17GK104164410SQ201410386913
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年8月7日 優先權日:2014年8月7日
【發明者】李德山, 王卉, 張天援, 何金嬌 申請人:哈爾濱博翱生物醫藥技術開發有限公司