本發明(ming)涉及(ji)動(dong)物病(bing)毒基因工(gong)程技術領(ling)域，具體涉及(ji)一種優(you)化的豬圓(yuan)環病(bing)毒2型重組腺病(bing)毒的構建方法。

背景技術：

腺病毒(du)(du)具有(you)易感性強(qiang)、致病力(li)低、宿主范圍(wei)廣(guang)、穩定性好、病毒(du)(du)滴度高、易于濃(nong)縮和(he)(he)(he)貯存、介導基因(yin)轉移效(xiao)率(lv)高和(he)(he)(he)能容納較(jiao)大(da)基因(yin)片段等優點，而(er)(er)且其生物(wu)學背景已(yi)研究得相當清(qing)楚(chu)，因(yin)而(er)(er)腺病毒(du)(du)載(zai)(zai)體在疫苗制備中被廣(guang)泛研究和(he)(he)(he)應用，是最有(you)前途的載(zai)(zai)體之一，但(dan)是腺病毒(du)(du)本身也有(you)一些(xie)缺點限制了它的應用。

腺(xian)病(bing)(bing)(bing)毒(du)載(zai)體(ti)作(zuo)為一種疫苗載(zai)體(ti)，其最大的(de)(de)(de)問(wen)題(ti)是(shi)機體(ti)針對(dui)載(zai)體(ti)的(de)(de)(de)免疫反應(ying)過強，現在(zai)有幾種策(ce)略來解(jie)決這(zhe)個問(wen)題(ti),這(zhe)些策(ce)略包括：1.化學法，即用(yong)聚乙二醇等化學試劑包裹腺(xian)病(bing)(bing)(bing)毒(du)，屏(ping)蔽其抗原表(biao)位，從(cong)而逃逸(yi)宿主(zhu)的(de)(de)(de)免疫作(zuo)用(yong)，但此類方法難以(yi)獲(huo)得高(gao)(gao)滴度的(de)(de)(de)病(bing)(bing)(bing)毒(du)，在(zai)實(shi)際應(ying)用(yong)過程(cheng)中有較大難度；2.采(cai)用(yong)基因(yin)工程(cheng)的(de)(de)(de)方法對(dui)腺(xian)病(bing)(bing)(bing)毒(du)進行(xing)修飾(shi)(shi)，包括構建嵌合體(ti)修飾(shi)(shi)的(de)(de)(de)腺(xian)病(bing)(bing)(bing)毒(du)衣(yi)殼、構建嵌合型(xing)的(de)(de)(de)腺(xian)病(bing)(bing)(bing)毒(du)和將基于5型(xing)人(ren)腺(xian)病(bing)(bing)(bing)毒(du)的(de)(de)(de)疫苗完(wan)全(quan)替換為其他稀(xi)有的(de)(de)(de)(來自人(ren)類或(huo)非(fei)人(ren)類的(de)(de)(de))腺(xian)病(bing)(bing)(bing)毒(du)血清型(xing)；3.利用(yong)一些細(xi)胞(bao)因(yin)子(IL-2、IFN-γ和IL-18等)與(yu)目的(de)(de)(de)基因(yin)一起表(biao)達，發揮細(xi)胞(bao)因(yin)子分子佐(zuo)劑的(de)(de)(de)功(gong)能，從(cong)而提高(gao)(gao)重組腺(xian)病(bing)(bing)(bing)毒(du)載(zai)體(ti)的(de)(de)(de)免疫原性。

通過(guo)提(ti)高抗原基(ji)因的(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)(biao)達(da)，降低腺病毒疫苗免(mian)疫劑量，達(da)到(dao)降低 載體自身免(mian)疫反應，增(zeng)強(qiang)(qiang)疫苗免(mian)疫效(xiao)果的(de)(de)(de)(de)(de)目(mu)的(de)(de)(de)(de)(de)。提(ti)高抗原基(ji)因的(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)(biao)達(da)策略之一(yi)是(shi)對載體骨(gu)架(jia)調(diao)(diao)控元件(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)優(you)化。人巨(ju)細胞病毒(human cytomegalovirus,hCMV)第一(yi)內(nei)含(han)子(zi)(zi)(zi)(zi)(human cytomegalovirus first intron,Intron A)作為(wei)轉(zhuan)錄后(hou)調(diao)(diao)節(jie)元件(jian)，與hCMV啟動(dong)子(zi)(zi)(zi)(zi)/增(zeng)強(qiang)(qiang)子(zi)(zi)(zi)(zi)(Promoter/Enhancer)一(yi)同提(ti)高缺失內(nei)含(han)子(zi)(zi)(zi)(zi)的(de)(de)(de)(de)(de)目(mu)的(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)因的(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)(biao)達(da)。內(nei)含(han)子(zi)(zi)(zi)(zi)可能(neng)通過(guo)幾種(zhong)不同機(ji)(ji)(ji)制(zhi)(zhi)來(lai)提(ti)高基(ji)因表(biao)(biao)(biao)達(da)效(xiao)率(lv)，這些機(ji)(ji)(ji)制(zhi)(zhi)通常分為(wei)兩類：一(yi)類是(shi)保(bao)護(hu)(hu)機(ji)(ji)(ji)制(zhi)(zhi)；另一(yi)類是(shi)增(zeng)強(qiang)(qiang)機(ji)(ji)(ji)制(zhi)(zhi)。保(bao)護(hu)(hu)機(ji)(ji)(ji)制(zhi)(zhi)強(qiang)(qiang)調(diao)(diao)內(nei)含(han)子(zi)(zi)(zi)(zi)的(de)(de)(de)(de)(de)保(bao)護(hu)(hu)能(neng)力，認為(wei)內(nei)含(han)子(zi)(zi)(zi)(zi)的(de)(de)(de)(de)(de)某(mou)些序(xu)列(lie)(lie)(lie)能(neng)夠通過(guo)自身的(de)(de)(de)(de)(de)折疊或者(zhe)結(jie)合其(qi)他蛋白(bai)形(xing)成(cheng)一(yi)種(zhong)二級(ji)結(jie)構(gou)從而(er)達(da)到(dao)穩定(ding)(ding)初(chu)級(ji)轉(zhuan)錄本(ben)的(de)(de)(de)(de)(de)作用。另外(wai)內(nei)含(han)子(zi)(zi)(zi)(zi)序(xu)列(lie)(lie)(lie)還可以(yi)作為(wei)RNA保(bao)護(hu)(hu)因子(zi)(zi)(zi)(zi)的(de)(de)(de)(de)(de)靶(ba)序(xu)列(lie)(lie)(lie)來(lai)穩定(ding)(ding)初(chu)級(ji)轉(zhuan)錄本(ben)，間接增(zeng)加mRNA核內(nei)穩定(ding)(ding)性，導致細胞質(zhi)中積(ji)累(lei)更多的(de)(de)(de)(de)(de)成(cheng)熟mRNA，從而(er)增(zeng)強(qiang)(qiang)目(mu)的(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)因的(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)(biao)達(da)效(xiao)率(lv)。而(er)增(zeng)強(qiang)(qiang)機(ji)(ji)(ji)制(zhi)(zhi)則強(qiang)(qiang)調(diao)(diao)內(nei)含(han)子(zi)(zi)(zi)(zi)的(de)(de)(de)(de)(de)促進轉(zhuan)錄能(neng)力，某(mou)些內(nei)含(han)子(zi)(zi)(zi)(zi)有這樣一(yi)些序(xu)列(lie)(lie)(lie)，能(neng)夠起到(dao)類似增(zeng)強(qiang)(qiang)子(zi)(zi)(zi)(zi)或其(qi)他順式調(diao)(diao)控元件(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)功(gong)能(neng)，它們(men)同某(mou)些蛋白(bai)質(zhi)結(jie)合，影響其(qi)轉(zhuan)錄的(de)(de)(de)(de)(de)起始(shi)和延伸，從而(er)開(kai)放染(ran)色(se)體的(de)(de)(de)(de)(de)功(gong)能(neng)域。

另(ling)外(wai)文獻報道，土(tu)撥鼠(shu)肝炎病毒(woodchuck hepatitis virus,WHV)轉(zhuan)錄后(hou)調節元(yuan)件(woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element,WPRE)能通過提高(gao)mRNA穩定性、3’端加工(gong)、促進mRNA出細(xi)胞(bao)核和細(xi)胞(bao)質中mRNA的(de)積(ji)累來增強未經剪接的(de)基(ji)因表達(da)。

豬(zhu)(zhu)圓(yuan)(yuan)(yuan)環(huan)(huan)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)可引起(qi)豬(zhu)(zhu)圓(yuan)(yuan)(yuan)環(huan)(huan)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(porcine circovirus disease,PCVD)或豬(zhu)(zhu)圓(yuan)(yuan)(yuan)環(huan)(huan)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)相關(guan)性(xing)疾(ji)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(porcine circovirus-associated disease, PCVAD)，如(ru)引起(qi)仔(zi)豬(zhu)(zhu)的(de)(de)傳(chuan)染性(xing)先天性(xing)震顫(zhan)和斷奶仔(zi)豬(zhu)(zhu)多(duo)系統衰竭綜(zong)合征(postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)等(deng)多(duo)種疾(ji)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)。1991年加拿大首(shou)次(ci)暴發該(gai)(gai)(gai)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)，隨后(hou)許(xu)多(duo)國(guo)(guo)家(jia)和地區(qu)都(dou)報道了該(gai)(gai)(gai)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)，其(qi)已給養豬(zhu)(zhu)業造成了嚴(yan)重的(de)(de)經濟損失。1978年德國(guo)(guo)學者Tischer首(shou)次(ci)從豬(zhu)(zhu)腎傳(chuan)代(dai)細胞(bao)(bao)系PK-15細胞(bao)(bao)中分(fen)離到(dao)該(gai)(gai)(gai)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)，并(bing)于1982將其(qi)命名為圓(yuan)(yuan)(yuan)環(huan)(huan)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)，隨后(hou)經血清學調查發現(xian)在德國(guo)(guo)、加拿大、新西(xi)蘭(lan)(lan)、英國(guo)(guo)、北(bei)愛爾蘭(lan)(lan)和美國(guo)(guo)等(deng)國(guo)(guo)家(jia)的(de)(de)豬(zhu)(zhu)群(qun)中抗體陽(yang)性(xing)率很高，其(qi)中1997年Clark從加拿大西(xi)部患有PMWS的(de)(de)豬(zhu)(zhu)群(qun)中分(fen)離到(dao)一種新的(de)(de)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)，該(gai)(gai)(gai)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)與PK-15細胞(bao)(bao)中圓(yuan)(yuan)(yuan)環(huan)(huan)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)相似(si)，并(bing)命名為豬(zhu)(zhu)圓(yuan)(yuan)(yuan)環(huan)(huan)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)2型(porcine circovirus type 2,PCV2)。

PCV2重組腺病毒載(zai)體疫(yi)苗(miao)已經有(you)(you)學者進行相關(guan)研究，但(dan)是(shi)還(huan)沒有(you)(you)相應的商品化疫(yi)苗(miao)，分析其原(yuan)因是(shi)腺病毒載(zai)體本身蛋白引(yin)起的免(mian)疫(yi)反應會嚴重影響機體針(zhen)對PCV2Cap的免(mian)疫(yi)應答(da)。

本發(fa)明將Intron A和WPRE引入(ru)到重(zhong)組腺病(bing)毒載體中，提高PCV2Cap表(biao)達量(liang)，以降低重(zhong)組腺病(bing)毒免(mian)疫(yi)劑量(liang)，減弱腺病(bing)毒自身的免(mian)疫(yi)反應。

技術實現要素：

本發明的(de)(de)目的(de)(de)是針對腺(xian)病(bing)毒表達系統的(de)(de)不足，提(ti)供一種(zhong)優化的(de)(de)豬圓(yuan)環病(bing)毒2型重(zhong)組(zu)腺(xian)病(bing)毒的(de)(de)構(gou)建方法，以提(ti)高Cap表達量(liang)，從而降低腺(xian)病(bing)毒使(shi)用劑(ji)量(liang)，減弱腺(xian)病(bing)毒自身(shen)的(de)(de)免疫反應。

為實現上(shang)述目的，本發明(ming)公開(kai)了如(ru)下技術方案：

一種優化的(de)(de)豬圓環病毒(du)2型重組腺(xian)病毒(du)的(de)(de)構建(jian)方法，將(jiang)Intron A和(he)WPRE加入到腺(xian)病毒(du)穿梭(suo)載體中，完成重組腺(xian)病毒(du)的(de)(de)構建(jian)。

作(zuo)為(wei)一(yi)種改(gai)進方(fang)案，所述重組腺病毒的構建具體包括如下步驟(zou)：

S1依次(ci)將Intron A、Cap和(he)WPRE編碼基因連接到載(zai)體pUC57，測序鑒定，命名為(wei)pUC-Intron A-Cap-WPRE；

S2將IntronA、Cap和(he)WPRE連接(jie)到pShuttle-CMV。用Xho I和(he)EcoR V雙(shuang)酶切pUC-Intron A-Cap-WPRE和(he)pShuttle-CMV，然后(hou)(hou)連接(jie)Intron A-Cap-WPRE和(he)pShuttle-CMV，轉化DH5a，挑菌、搖菌、提質粒，PCR鑒(jian)定和(he)單雙(shuang)酶切鑒(jian)定正(zheng)確后(hou)(hou)，送測序，測序正(zheng)確后(hou)(hou)，命名為(wei)PS-Intron A-Cap-WPRE；

S3將構建好的PS-Intron A-Cap-WPRE用(yong)限制性內切(qie)(qie)酶Pme I線性化后電轉BJ5183與其中的骨架(jia)質粒(li)pAdEasy-1進行重組，挑菌(jun)、搖菌(jun)、提質粒(li)，用(yong)限制性內切(qie)(qie)酶Pac I單酶切(qie)(qie)鑒定；

S4鑒定正(zheng)確后(hou)用試劑(ji)盒提取重(zhong)組(zu)(zu)質粒(li)，用限制性內切(qie)酶Pac I線性化后(hou)的重(zhong)組(zu)(zu)質粒(li)轉(zhuan)染HEK293A細胞(bao)，當細胞(bao)病變出現時(shi)，收集細胞(bao)，離(li)心(xin)后(hou)將沉(chen)淀重(zhong)懸于PBS；

S5反復凍融(rong)3次后，離(li)心取(qu)上清，此病(bing)毒(du)即為(wei)原種腺病(bing)毒(du)，命名為(wei)rAd-Intron A-Cap-WPRE。

進一步的改進方案

作為一種進一步(bu)(bu)的改(gai)進方(fang)案，所述步(bu)(bu)驟S3中，電轉條件(jian)為200Ω,2.5kV,25μF。

作為(wei)一種進一步的(de)改進方案，所述步驟S3中(zhong)，用限(xian)制性內切酶 Pac I線性化(hua)的(de)條件為(wei)37℃，2h。

作(zuo)為一種進一步(bu)的(de)改進方(fang)案，所(suo)述步(bu)驟S3中(zhong)，挑取(qu)單(dan)(dan)克(ke)(ke)隆的(de)方(fang)法是：電轉化后，涂瓊脂(zhi)板時，同時設立(li)5個梯度(du)的(de)涂菌(jun)量，分別為20μL、40μL、60μL、80μL和100μL菌(jun)量，在37℃細菌(jun)培養箱(xiang)中(zhong)放(fang)置18h，挑取(qu)單(dan)(dan)克(ke)(ke)隆菌(jun)落(luo)，單(dan)(dan)克(ke)(ke)隆菌(jun)落(luo)大小約為中(zhong)等的(de)菌(jun)落(luo)，太大或太小均不(bu)能挑取(qu)，每個梯度(du)挑取(qu)10個單(dan)(dan)克(ke)(ke)隆重復，共計50個單(dan)(dan)克(ke)(ke)隆。

作為一種進一步的改進方案，所述步驟S4中，轉染HEK293A細胞方法按照優化后的Lipofectamine^TM2000轉染程序進行轉染。具體轉染方法如下：(1)將DNA質粒溶于50μL無血清無抗生素的Medium培養液中，輕輕混勻，并在室溫下孵育5min；(2)將適量Lipofectamine^TM 2000溶于50μL無血清無抗生素的Medium培養液中，混勻并在室溫下孵育5min；(3)將上述兩種混合物混合(總體積100μL)，輕輕混勻，在室溫下孵育20min(不能出現霧狀沉淀)；(4)上述操作同時，將待轉染細胞用PBS清洗兩次，在每孔(24孔板)中加入100μL無血清無抗生素的Medium培養液，待DNA質粒/Lipofectamine復合物混合20min后，立即加入待轉染細胞孔中，并混勻，然后將細胞于37℃，5％CO₂細(xi)胞培養箱中培養，約4h后(hou)更換為含2％胎牛血(xue)清(fetal bovine serum,FBS)的(de)DMEM細(xi)胞培養液，繼續培養，并定期用(yong)顯微鏡觀察(cha)細(xi)胞生(sheng)長情況。

作為一種進一步的改進方案，所述步驟(zou)S4中(zhong)，細(xi)胞(bao)病變指細(xi)胞(bao) 腫脹、變圓、脫(tuo)落，但(dan)形(xing)態完整。

作(zuo)為一種進一步的改進方案，所述(shu)步驟S5中，離(li)心的條件(jian)為3000g，10min。

本發明公(gong)開的一(yi)種(zhong)優化的豬圓環病毒2型重組腺病毒的構(gou)建方法，具有以(yi)下有益效果：

1.hCMV Intron A作為轉錄調節元件，與hCMV啟動子(zi)/增強子(zi)(Promoter/Enhancer)一起(qi)提高缺失內含子(zi)的(de)目(mu)的(de)基(ji)因表達(da)。

2.WPRE能(neng)通過提高mRNA穩(wen)定性(xing)、3’端加(jia)工、促進mRNA出細胞核和細胞質(zhi)中mRNA的(de)積累來增強未經剪接的(de)目的(de)基因(yin)的(de)表達。

3.Intron A和WPRE克隆(long)到腺病(bing)毒穿梭載(zai)體(ti)中，可以提高PCV2Cap表達量，降(jiang)低(di)腺病(bing)毒免疫(yi)劑(ji)量和腺病(bing)毒自(zi)身載(zai)體(ti)免疫(yi)反應。

附圖說明

圖(tu)1是重組腺病毒(du)穿梭載體改造示(shi)意(yi)圖(tu)；

圖(tu)(tu)2是PS-Intron A-Cap-WPRE PCR鑒定圖(tu)(tu)，其(qi)中：1：Intron-Cap-WPRE；2：陰性(xing)對照；3：2K Plus Marker

圖3是重(zhong)組(zu)腺病毒(du)rAd-Intron A-Cap-WPRE感染HEK293A細(xi)胞48h對比照片，其(qi)中(zhong)：A為(wei)rAd-Intron A-Cap-WPRE感染HEK293A細(xi)胞；B為(wei)正常(chang)細(xi)胞對照；

圖(tu)4重(zhong)組腺病毒rAd-Intron A-Cap-WPRE感染豬(zhu)PK-15細(xi)胞后Cap表(biao)達顯著升高，其中：1為rAd-Cap；2為rAd-Intron A-Cap-WPRE；β-actin為內(nei)參蛋(dan)白；

圖5低劑(ji)(ji)(ji)量(liang)的rAd-Intron A-Cap-WPRE感(gan)(gan)染(ran)(ran)豬PK-15細胞可達(da)到 高劑(ji)(ji)(ji)量(liang)的rAd-Cap感(gan)(gan)染(ran)(ran)豬PK-15細胞后Cap的表達(da)水平(ping)，并顯著(zhu)降(jiang)低載體(ti)蛋(dan)白的表達(da)，其(qi)中(zhong)：1為(wei)rAd-Cap(感(gan)(gan)染(ran)(ran)劑(ji)(ji)(ji)量(liang)為(wei)20MOI)；2為(wei)rAd-Intron A-Cap-WPRE(感(gan)(gan)染(ran)(ran)劑(ji)(ji)(ji)量(liang)為(wei)2MOI)。

具體實施方式

下面結合實施例(li)并參照附圖對(dui)本(ben)發明(ming)作進一步描述。

一種優化的(de)豬圓環病(bing)毒2型重(zhong)組腺(xian)病(bing)毒的(de)構建方法，將Intron A和WPRE加入到腺(xian)病(bing)毒穿梭載體中，完成(cheng)重(zhong)組腺(xian)病(bing)毒的(de)構建。

具體來(lai)說，所述重組(zu)腺(xian)病(bing)毒的(de)構建具體包括如下步驟：

S1依(yi)次將Intron A、Cap和(he)WPRE編碼基因連接到(dao)載體pUC57，測序鑒定(ding)，命名為pUC-Intron A-Cap-WPRE；

S2將IntronA、Cap和WPRE連(lian)接到pShuttle-CMV。用Xho I和EcoR V雙酶切pUC-Intron A-Cap-WPRE和pShuttle-CMV，然后(hou)(hou)連(lian)接Intron A-Cap-WPRE和pShuttle-CMV，轉化DH5a，挑(tiao)菌(jun)、搖(yao)菌(jun)、提質粒，PCR鑒定(ding)和單雙酶切鑒定(ding)正確后(hou)(hou)，送(song)測(ce)序(xu)，測(ce)序(xu)正確后(hou)(hou)，命名為PS-Intron A-Cap-WPRE；

S3將構(gou)建好的PS-Intron A-Cap-WPRE用限制性(xing)(xing)內切酶(mei)Pme I線性(xing)(xing)化后(hou)電轉BJ5183與其中的骨架質粒pAdEasy-1進(jin)行重組，挑菌、搖菌、提質粒，用限制性(xing)(xing)內切酶(mei)Pac I單酶(mei)切鑒(jian)定；

S4鑒定(ding)正確后(hou)用試劑盒提取重(zhong)組質粒，用限制性內切(qie)酶Pac I線性化后(hou)的(de)重(zhong)組質粒轉(zhuan)染HEK293A細(xi)(xi)胞(bao)，當細(xi)(xi)胞(bao)病變出(chu)現(xian)時，收(shou)集(ji)細(xi)(xi)胞(bao)，離心后(hou)將沉淀(dian)重(zhong)懸于PBS；

S5反復凍(dong)融3次后，離心取上清，此病毒即為原種腺病毒，命名為rAd-Intron A-Cap-WPRE。

本發明中，所述步驟S4中，轉染HEK293A細胞方法按照優化后的Lipofectamine^TM2000轉染程序進行轉染。具體轉染方法如下：(1)將DNA質粒溶于50μL無血清無抗生素的Medium培養液中，輕輕混勻，并在室溫下孵育5min；(2)將適量Lipofectamine^TM 2000溶于50μL無血清無抗生素的Medium培養液中，混勻并在室溫下孵育5min；(3)將上述兩種混合物混合(總體積100μL)，輕輕混勻，在室溫下孵育20min(不能出現霧狀沉淀)；(4)上述操作同時，將待轉染細胞用PBS清洗兩次，在每孔(24孔板)中加入100μL無血清無抗生素的Medium培養液，待DNA質粒/Lipofectamine復合物混合20min后，立即加入待轉染細胞孔中，并混勻，然后將細胞于37℃，5％CO₂細(xi)胞(bao)(bao)培(pei)養箱中(zhong)培(pei)養，約4h后更換為含2％FBS的(de)DMEM細(xi)胞(bao)(bao)培(pei)養液，繼續培(pei)養，并定期(qi)用顯微鏡觀察細(xi)胞(bao)(bao)生長情況。

請參見圖1。圖1是腺病毒穿梭載體PS-Intron A-Cap-WPRE構建示意圖。Intron A基(ji)因(yin)(yin)插(cha)(cha)入到Cap基(ji)因(yin)(yin)的(de)上游，WPRE基(ji)因(yin)(yin)插(cha)(cha)入到Cap基(ji)因(yin)(yin)的(de)下游。啟動子為CMV啟動子，多聚(ju)腺苷酸信(xin)號為SV40poly。

請參見圖(tu)2。圖(tu)2是(shi)PS-Intron A-Cap-WPRE PCR鑒定(ding)圖(tu)。將Intron A-Cap-WPRE連接到pShuttle-CMV穿梭載體上，轉(zhuan)化入DH5α，挑菌、搖菌和提質粒，用提取的質粒為(wei)模板，進行PCR，鑒定(ding)重組質粒 是(shi)否(fou)構建成功。

請參見圖(tu)3。圖(tu)中A：rAd-Intron A-Cap-WPRE；B：正常細胞(bao)對(dui)照(zhao)。將在BJ5183中重(zhong)組成功(gong)的(de)質粒轉染(ran)進(jin)入(ru)HEK293A細胞(bao)中進(jin)行包裝，約7～10d出現細胞(bao)病變效(xiao)應(ying)，兩圖(tu)分別是重(zhong)組腺病毒和對(dui)照(zhao)感染(ran)細胞(bao)后的(de)細胞(bao)病變圖(tu)。

請參見圖4。重組腺病毒rAd-Intron A-Cap-WPRE感(gan)染豬(zhu)PK-15細胞(bao)后(hou)，Cap表達顯著升高；

請參見圖(tu)5。低劑量(liang)的(de)rAd-Intron A-Cap-WPRE感染豬(zhu)PK-15細胞(bao)可達到高(gao)劑量(liang)的(de)rAd-Cap感染豬(zhu)PK-15細胞(bao)后(hou)Cap的(de)表達水平，并顯著降低載體蛋(dan)白的(de)表達。

綜上所述，本發明提供(gong)了提高了Cap的表(biao)達量，從而降低腺(xian)病毒使用劑量，減少腺(xian)病毒自(zi)身蛋白(bai)表(biao)達量。

以上所述僅是本(ben)(ben)發(fa)明的(de)(de)優選實施方式，應(ying)當(dang)指出，對于(yu)本(ben)(ben)領域的(de)(de)普通技術人員，在不(bu)脫(tuo)離本(ben)(ben)發(fa)明的(de)(de)前提(ti)下，還(huan)可以對本(ben)(ben)發(fa)明做(zuo)出的(de)(de)若干(gan)改進(jin)和補充，這(zhe)些(xie)改進(jin)和補充，也應(ying)視為(wei)本(ben)(ben)發(fa)明的(de)(de)保(bao)護范圍。