一種亞單位疫苗及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種亞單位疫苗，該疫苗的制備方法和應用，屬于獸用生物制品領域。
【背景技術】
[0002] 多殺性己氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm)屬于己氏桿菌科己氏桿菌屬多殺 性己氏桿菌種，是有芙膜的革蘭氏陰性短桿菌，兼性厭氧。根據其芙膜和脂多糖的不同，可 將化分為A、B、D、E、巧個血清群和16個血清型，A型主要引起禽霍亂，B、E型主要引起出 血性敗血癥，產毒素的D型主要引起豬萎縮性鼻炎。該病原菌在世界各地均有流行，宿主范 圍較廣，可感染多種動物并引起發病，不同動物感染后發病癥狀和病理變化不盡相同。
[0003] 豬的多殺性己氏桿菌病多數是由化A、B、D血清型引起，非產毒素多殺性己氏桿 菌主要引發豬肺疫，又稱豬出血性敗血癥，俗稱"鎖喉風"。該病最急性型呈敗血癥癥狀，咽 喉部急性腫脹，高度呼吸困難，犬坐姿勢，死亡迅速；急性型表現為纖維素性胸膜肺炎癥狀； 慢性型多為慢性肺炎、胃腸炎W及逐漸消瘦，有時伴發關節炎。產毒素多殺性己氏桿菌主要 引起進行性豬萎縮性鼻炎，該病會導致豬鼻甲骨萎縮、鼻吻變形及全身骨骼發育受到影響， 使豬的生長遲緩，容易繼發復合性肺炎，給養豬業造成巨大的經濟損失。
[0004] 目前臨床上用于預防多殺性己氏桿菌病的疫苗主要是滅活疫苗和弱毒活疫苗，滅 活苗對己氏桿菌不同血清型的交叉保護能力差、保護期短；弱毒活疫苗的免疫效果易受環 境等因素的影響且存在毒力返強的風險。無論是滅活疫苗還是弱毒活疫苗，均需要多次重 復免疫，面對異型菌株的攻擊，其保護功效是十分有限的。

【發明內容】

[0005] 本發明的主要目的在于克服現有技術缺陷，提供一種用于預防和/或治療豬多殺 性己氏桿菌病的疫苗組合物，包含H種豬己氏桿菌免疫保護性抗原和佐劑。
[0006] 本發明的第一方面包括一種疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物包括免疫量的豬 己氏桿菌抗原OmpA蛋白、OmpH蛋白和Pl祀蛋白。
[0007] 本發明采用大腸桿菌表達的0mpA、0mpH及Pl祀蛋白制備豬己氏桿菌亞單位疫苗， 對豬己氏桿菌不同血清型提供全面的保護；使用吸收效果好的新型水溶性佐劑，避免免疫 局部出現不良反應，提高免疫應答及對豬的免疫保護作用。
[000引本發明首次通過將化的外膜蛋白OmpA蛋白、OmpH蛋白和Pl祀蛋白組合使化針 對不同血清型豬己氏桿菌感染有較好的保護作用，而且只需要免疫一次，避免多次重復免 疫帶來的應激反應。通過免疫效力比較試驗，意外發現，幾種蛋白組合使用，協同刺激機體 免疫反應，能夠有效降低免疫劑量，大大降低免疫成本。
[0009] 本發明提供的預防和/或治療豬多殺性己氏桿菌病的疫苗組合物包含的豬己氏 桿菌免疫抗原為P. multocida重組OmpA、OmpH、Pl祀蛋白。
[0010] 作為本發明的一種優選實施方式，本發明的疫苗組合物中，所述豬己氏桿菌抗原 OmpA蛋白的氨基酸序列為SE化NO. 4,所述豬己氏桿菌抗原OmpH蛋白的氨基酸序列為SE化 NO. 5,所述豬己氏桿菌抗原Pl祀蛋白的氨基酸序列為SEQ. NO. 6。
[0011] 優選地，本發明提供的預防和/或治療豬多殺性己氏桿菌病的疫苗組合物包含的 豬己氏桿菌免疫抗原OmpA蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0012] 優選地，本發明提供的預防和/或治療豬多殺性己氏桿菌病的疫苗組合物包含的 豬己氏桿菌免疫抗原OmpH蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示。
[0013] 優選地，本發明提供的預防和/或治療豬多殺性己氏桿菌病的疫苗組合物包含的 豬己氏桿菌免疫抗原Pl祀蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示。
[0014] 作為本發明的一種優選實施方式，本發明的疫苗組合物中，所述編碼豬己氏桿菌 抗原OmpA蛋白的核巧酸序列為SE化NO. 1，所述編碼豬己氏桿菌抗原OmpH蛋白的核巧酸序 列為SEQ. NO. 2,所述編碼豬己氏桿菌抗原Pl祀蛋白的核巧酸序列為SEQ. NO. 3。
[0015] 本發明提供的預防和/或治療豬多殺性己氏桿菌病的疫苗組合物包含的豬己氏 桿菌免疫抗原OmpA蛋白、Om抑蛋白、Pl祀蛋白還可W是與其功能衍生物基本相同的氨基酸 序列的多膚。
[0016] 術語"功能衍生物"指具有與完整蛋白/膚序列的生物活性基本類似的功能生物 活性的蛋白/膚序列。換言之，其優選地指當將所述功能衍生物施用于動物時，基本上保留 了激發免疫應答，如針對豬己氏桿菌菌株攻擊的保護性反應的能力的多膚或其片段。
[0017] 術語"片段"指送樣的多核巧酸序列，其是人工構建（例如通過化學合成）或通過 將天然產物裂解成多個小片段（使用限制性內切酶，或機械剪切）構建的本發明核酸的分 離的部分，或通過PCR、DNA聚合酶或本領域公知的任何其他聚合技術合成的核酸的部分， 或通過本領域技術人員公知的重組核酸技術在宿主細胞中表達的核酸部分。
[001引術語"保護性反應"意為在動物中預防豬己氏桿菌相關疾病或由豬己氏桿菌導致 的感染的發作或減輕存在的送樣的疾病的嚴重性。
[0019] 本發明涉及的豬己氏桿菌多膚，其有利地激發動物中的保護性反應。具體地，本發 明實施方式的多膚包含與其功能衍生物基本相同的氨基酸序列。
[0020] 如本文一般理解和使用，"功能性片段"指編碼與完整核酸序列的生物活性基本相 似的功能生物活性的核酸序列。換言之，在本發明的上下文中，其優選地指基本上保留了編 碼送樣的多膚/蛋白質能力的核酸或其片段，所述多膚/蛋白質當施用于動物時，激發針對 豬己氏桿菌菌株攻擊的免疫應答，和更優選地保護性反應。
[0021] 當指氨基酸序列時，"基本上相同"可W理解為本發明的多膚優選地具有送樣的氨 基酸序列，其與SEQ ID NO ;4-6中所示的序列的部分或全部具有至少70%同源性，或甚至 優選地80%同源性，或甚至更優選地90%同源性，或最優選地95%同源性。
[0022] 在本文中術語"同源性"還包括與參比序列相同或類似，同時提供任何氨基酸的簡 單替換/修飾。可W用BLAST-P (基本局部排比檢索工具），本領域技術人員公知的程序進 行該方面的同源性檢索。對于相應的核酸序列，同源性涉及在本領域中已知的BLASTX和 BLASTN 程序。
[0023] 作為本發明的一種優選實施方式，本發明的疫苗組合物中，所述豬己氏桿菌抗原 OmpA蛋白含量為50-150 U g/ml，所述豬己氏桿菌抗原OmpH蛋白含量為50-150 U g/ml，所述 豬己氏桿菌抗原Pl祀蛋白含量為100-400 U g/ml。
[0024] 本發明的組合物的成分或組分的量優選地是治療有效量。所述治療有效量是指在 組合物施用的宿主中發揮它們的免疫學作用而不導致過度副作用所必需量。所用的成分 和待施用的組合物的精確的量將根據因素如治療的疾病的類型，待治療的動物的類型和年 齡，施用的方式，W及組合物中的其它成分而變化。
[00巧]優選地，對于動物豬而言，本發明疫苗組合物OmpA蛋白抗原含量為50-100 Ji g/ ml ;0mpH蛋白抗原含量為50-100U g/ml ;P1祀蛋白抗原含量為100-400U g/ml。
[0026] 更優選地，所述疫苗組合物OmpA蛋白抗原含量為100 y g/ml ;0mpH蛋白抗原含量 為IOOy g/ml ;PlpE蛋白抗原含量為200U g/ml。
[0027] 作為本發明的一種最優選實施方式，本發明的疫苗組合物中，所述豬己氏桿菌抗 原OmpA蛋白含量為100 U g/ml，所述豬己氏桿菌抗原OmpH蛋白含量為100 U g/ml，所述豬 己氏桿菌抗原Pl祀蛋白含量為200 U g/ml。
[0028] 作為本發明的一種優選實施方式，本發明的疫苗組合物中，所述豬己氏桿菌抗原 OmpA蛋白含量為50 y g/ml，所述豬己氏桿菌抗原OmpH蛋白含量為50 y g/ml，所述豬己氏桿 菌抗原Pl祀蛋白含量為IOOy g/ml。
[0029] 作為本發明的一種優選實施方式，本發明的疫苗組合物中，所述豬己氏桿菌抗原 OmpA蛋白含量為150 U g/ml，所述豬己氏桿菌抗原OmpH蛋白含量為150 U g/ml，所述豬己氏 桿菌抗原Pl祀蛋白含量為400 U g/ml。
[0030] 作為本發明的一種優選實施方式，本發明的疫苗組合物中，所述疫苗組合物還包 含佐劑，所述佐劑包括油佐劑，水溶性佐劑，鉛鹽佐劑，細胞因子佐劑。
[0031] 術語"佐劑"指加入到本發明的組合物中W增加組合物的免疫原性的物質。已知 的佐劑包括，但不限于；油佐劑，水溶性佐劑，鉛鹽佐劑，細胞因子佐劑。
[0032] 本發明所用術語"油佐劑"又稱"油性佐劑"或"油乳佐劑"，是由包括植物油、動 物油、礦物油中的一種或幾種組成，用于延緩免疫原在機體內的存留時間，使之持續緩慢釋 放，增強巨瞻細胞的吞瞻與殺菌能力。
[0033] 本發明所用術語"水溶性佐劑"又稱"水基佐劑"或"水佐劑"，是一種聚合物水溶 性分散體，用于提高水溶性疫苗的功效和安全性，可W由高分子量聚丙帰酸類合成聚合物 組成。
[0034] 本發明所用術語"鉛鹽佐劑"，又稱"鉛膠佐劑"或"鉛佐劑"，包括氨氧化鉛佐劑和 磯酸鉛佐劑，其主要功能為緩釋，但同時具有對免疫細胞的激活作用。將抗原和氨氧化鉛或 磯酸鉛混合注射，能夠使抗原保存在注射部位，具有抗原緩釋和非特異免疫刺激作用。
[0035] 本發明所用術語"細胞因子佐劑"，包括比-1、比-2、比-3、比-4、比-5、比-6、比-7、 IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、INF- Y、GM-CSF、TNF- a、TNF-目、TCA-3 等，又稱"細胞因子" 或"細胞素"，是活體宿主細胞分泌的通過擴散、細胞間接觸或血液循環到達宿主其他細胞， 在體液中W極低濃度發揮作用的一類非免疫球蛋白、局部天然蛋白或糖蛋白，也是一類由 機體活化的免疫細胞和某些非免疫細胞產生、分泌，能調節細胞生長、分化，與造血、炎癥反 應、免疫應答反應和創傷愈合等密切相關的高活性多功能小分子蛋白的統稱，可W刺激或 抑制免疫功能，在免疫應答中促進細胞發育分化、調節細胞生理功能和細胞間信息傳遞，在 免疫系統中起著非常重要的調控作用。
[0036] 作為本發明的一種優選實施方式，本發明的疫苗