專利名稱：特定融合疫苗的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種疫苗的制備方法。
背景技術：
疫苗是一個古老的名詞，傳統疫苗的概念局限于對體外病原體(如細菌，病毒等)的預防，免于受其感染。由于近年來對腫瘤免疫的突破性進展，治療性癌癥疫苗給癌癥患者帶來了新的希望。從此，疫苗從它的傳統概念中解放出來，不僅用于被動的預防，而且用于主動的治療了。隨著疫苗概念的進展，疫苗的物質基礎也隨之發生了改變預防性疫苗由原來用滅活病原體作疫苗，發展到合成多肽作疫苗和合成核酸(DNA和RNA)作疫苗。其原理是合成的多肽抗原和核酸抗原直接或間接地刺激機體免疫細胞產生免疫預防作用。無論上述合成性多肽疫苗還是核酸疫苗，大都是針對病原體某一兩個蛋白質的已知抗原為目標設計的，雖然較傳統的用整個病原體作疫苗來得安全，無毒性和致感染性，所面臨的問題是抗原表達率低；效價低。
治療性疫苗目前最大的突破是將上述的多肽或和核酸抗原在體外和機體樹狀細胞(dendritic cell)先作用，使樹狀細胞變成所謂抗原攜帶細胞(antigen presenting cell)，進而刺激機體免疫細胞產生免疫治療作用。目前已用于癌癥和病毒的治療。但有待進一步突破。即是否能用特定融合疫苗的形式，結合抗原攜帶細胞為媒介，刺激機體細胞毒T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte)產生更有效的免疫治療作用呢？

發明內容
本發明的目的在于提供一種免疫效果好的特定融合疫苗的制備方法。
本發明的技術解決方案是一種特定融合疫苗的制備方法，依次包括下列步驟①用PCR方法合成靶基因或靶抗原；②將抗原在基因內和/或基因間易位重組；
③克隆到表達載體，表達融合抗原；④篩選高效融合抗原克隆；⑤制取特定融合疫苗。
步驟②的具體方法是采用限制性內切酶，將消化的片段再連接，完成重組。
上述將抗原在基因內和/或基因間易位重組主要包括1)抗原隨意易位重組方法由于靶基因是已知的，可根據重組的要求，按常規方法選用限制性內切酶，將消化的片斷再連接，完成重組；2)形式(a)抗原在基因內隨意易位重組(如下圖所示，+表示抗原決定基，A、B、C、D代表4個不同的抗原決定基)A B基因甲5′＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝3′B A抗原易位 5′＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝3′C D基因乙5′000+00000000+000 3′DC抗原易位 5′000+00000000+000 3′如基因具有兩個以上抗原可以類推。(b)抗原在基因內和基因間隨意易位重組各易位重組模式如下圖所示(如下示意圖是是以上兩個基因四個抗原為例排列的，如為兩個基因和四個抗原以上者，可以類推)A B CD1 5′＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝000+00000000+000 3′A B DC2 5′＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝000+00000000+000 3′
B A CD3 5′＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝000+00000000+000 3′B A DC4 5′＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝000+00000000+000 3′CD A B5 5′000+00000000+000＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝3′CD B A6 5′000+00000000+000＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝3′DC A B7 5′000+00000000+000＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝3′DC B A8 5′000+00000000+000＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝3′A B C9 5′＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′A B D10 5′＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′B A C11 5′＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′B A D12 5′＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′C D A13 5′000+00000000+000＝＝+＝＝＝＝＝3′C D B14 5′000+00000000+000＝＝+＝＝＝＝＝3′DC A15 5′000+00000000+000＝＝+＝＝＝＝＝3′
DC B16 5′000+00000000+000＝＝+＝＝＝＝＝3′CA B17 5′000+0000＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝3′CB A18 5′000+0000＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝3′DA B19 5′000+0000＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝3′DB A20 5′000+0000＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝3′A CD21 5′＝＝+＝＝＝＝＝000+00000000+000 3′A DC22 5′＝＝+＝＝＝＝＝000+00000000+000 3′B CD23 5′＝＝+＝＝＝＝＝000+00000000+000 3′B DC24 5′＝＝+＝＝＝＝＝000+00000000+000 3′A C B D25 5′＝＝+＝＝＝＝000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′A D B C26 5′＝＝+＝＝＝＝000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′B C A D27 5′＝＝+＝＝＝＝000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′B D A C28 5′＝＝+＝＝＝＝000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′C A DB29 5′000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000＝＝+＝＝＝＝3′
C B DA30 5′000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000＝＝+＝＝＝＝3′D A CB31 5′000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000＝＝+＝＝＝＝3′D B CA32 5′000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000＝＝+＝＝＝＝3′A C B33 5′＝＝+＝＝＝＝000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝3′A D B34 5′＝＝+＝＝＝＝000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝3′B C A35 5′＝＝+＝＝＝＝000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝3′B D A36 5′＝＝+＝＝＝＝000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝3′C A D37 5′000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′C B D38 5′000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′D A C39 5′000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′D B C40 5′000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′A D41 5′＝＝+＝＝＝＝000+0000 3′B C42 5′＝＝+＝＝＝＝000+0000 3′C A43 5′ 000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝3′
D B44 5′000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝3′以上A；B；C和D各抗原位點可以重復，如BBAAACCDD等。各易位重組體也可重復，如DAC-DAR-DB-DB-DB等。各易位重組體也可再重組，如ABCD-DCBA等等。任何重組都要確保能表達正確的蛋白質，即蛋白質閱讀框需正確無誤。
基因與基因之間的融合可以為同種之間，如人體肝臟甲胎蛋白和人體其它腫瘤表達的胚胎抗原的基因易位重組，表達融合蛋白作疫苗等等。也可以在異種之間基因之間進行。如人體基因和植物基因，人體基因和微生物的基因，植物基因和微生物的基因之間的抗原基因易位重組，表達融合蛋白制作疫苗等等。
步驟③的方法是基因易位重組后，將其克隆到哺乳動物細胞表達載體，表達融合抗原。
步驟④篩選高效融合抗原克隆的具體方法是步驟③的克隆純化質粒后，直接免疫動物，測試抗體效價，篩選出具有較強抗原性的克隆。
步驟⑤制取特定融合疫苗的方法是經步驟④篩選出的哺乳動物細胞表達質粒，即直接作為特定DNA融合疫苗。
將步驟④篩選出的哺乳動物細胞表達質粒DNA作模板進行PCR擴增，擴增時5’端質粒引物內含RNA啟動子T7或T3、SP6序列，3’端質粒引物內含POLY(T)序列；再將PCR產物用相應的RNA聚合酶把全部的克隆轉化為有義鏈RNA，外加脫氧核糖核酸酶I消化DNA模板即得特定RNA融合疫苗。
將步驟④篩選出的純化質粒DNA表達為蛋白質，并加以純化即得特定蛋白融合疫苗。
步驟①用PCR方法合成靶基因或靶抗原，可以采用下列方法中的一種1)對屬DNA基因組的生物體(例如細菌、DNA病毒等)，抽取純化的DNA分子作模板，用PCR擴增分離出靶基因、抗原；2)對屬RNA基因組的生物體(例如RNA病毒等)，先抽取并純化雙鏈RNA分子，再將雙鏈的RNA分子逆轉錄為DNA分子，并以此作為PCR模板，用PCR擴增法分離出靶基因或抗原，整個過程稱之為RT-PCR，其中將RNA逆轉錄為DNA分子的具體步驟包括a)將雙鏈RNA分子和隨機引物按分子比1∶50或1∶100或1∶500或1∶1000或1∶10000的比例進行混合。隨機引物序列5′-----------------------XXXX-3′5′-----------------------XXXXX-3′5′-----------------------XXXXXX-3′5′-----------------------XXXXXXX-3′5′-----------------------XXXXXXXX-3′5′-----------------------XXXXXXXXX-3′5′-----------------------XXXXXXXXXX-3′5′-----------------------XXXXXXXXXXX-3′5′-----------------------XXXXXXXXXXXX-3′“X”為隨機堿基A或T或G或C。
“-----”為隨意DNA序列，其中可含有內切酶位點。引物的的熔點(Tm)為50-80℃。
b)將雙鏈RNA分子和隨機引物的混合液加熱變性(溫度85-98℃；30秒-30分鐘)。
c)迅速置于4℃到-4℃，退火3分鐘左右。
d)加逆轉錄酶、相應緩沖液和dNTP完成第一鏈的的合成。
e)用PCR完成第二鏈的合成。所用引物與第一鏈合成相同。
也可用傳統的第二鏈合成方法合成。如由大腸桿菌DNA多聚酶加大腸桿菌RNA連接酶和核糖核酸酶H(RNase H)共同完成。在此情形下，上述隨機引物的隨意DNA序列可以去除。隨機引物序列如下所示5′-XXXX-3′
5′-XXXXX-3′5′-XXXXXX-3′5′-XXXXXXX-3′5′-XXXXXXXX-3′5′-XXXXXXXXX-3′5′-XXXXXXXXXX-3′5′-XXXXXXXXXXX-3′5′-XXXXXXXXXXXX-3′“X”為隨機堿基A或T或G或C。3)如生物體是具有POLY(A)RNA的寄生蟲或哺乳動物、人體等，總體RNA的抽提可用中國專利申請號01113523.9的抽提液抽提(或用現有技術的其它方法抽提)，由總體RNA合成cDNA的方法可按中國專利申請號01113524.7的相應方法進行(或用現有技術的其它方法進行)，以此合成的cDNA為模板，用PCR擴增法分離出靶基因或抗原；如是為制備癌癥特定融合疫苗，且基因屬于稀含基因，則在上述用PCR擴增前需要加一步腫瘤相關基因的扣除性篩選步驟，去除和正常細胞相同的基因，篩選出腫瘤基因，以防疫苗產生自身免疫反應，此扣除性篩選步驟可按公開號為US6,465,219的美國專利和申請號為PCT/US01/24730的相應方法進行。
本發明方法新穎、獨特，制取的疫苗免疫效果好，能對外來的病原體入侵和自身突變細胞的繁殖和擴散進行免疫預防，還能結合抗原攜帶細胞(APC)為媒介，刺激機體的細胞毒T淋巴細胞(cytotoxic Tlymphocyte)對外來的病原體和自身突變細胞產生有效的免疫治療作用。
具體實施例方式實施例1一種特定融合疫苗的制備方法，依次包括下列步驟①用PCR方法合成靶基因或靶抗原對屬DNA基因組的生物體(例如細菌、DN病毒等)，抽取純化的DNA分子作模板，用PCR擴增分離出靶基因、抗原；②將抗原在基因內和/或基因間易位重組采用限制性內切酶，將消化的片段再連接，完成重組。
上述將抗原在基因內和/或基因間易位重組主要包括1)抗原隨意易位重組方法由于靶基因是已知的，可根據重組的要求，按常規方法選用限制性內切酶，將消化的片斷再連接，完成重組；2)形式(a)抗原在基因內隨意易位重組(如下圖所示，+表示抗原決定基，A、B、C、D代表4個不同的抗原決定基)A B基因甲5′＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝3′B A抗原易位 5′＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝3′CD基因乙5′000+00000000+000 3′DC抗原易位 5′000+00000000+000 3′如基因具有兩個以上抗原可以類推。(b)抗原在基因內和基因間隨意易位重組各易位重組模式如下圖所示(如下示意圖是是以上兩個基因四個抗原為例排列的，如為兩個基因和四個抗原以上者，可以類推)A B CD1 5′＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝000+00000000+000 3′A B DC2 5′＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝000+00000000+000 3′B A CD3 5′＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝000+00000000+000 3′
B A DC4 5′＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝000+00000000+000 3′CD A B5 5′000+00000000+000＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝3′CD B A6 5′000+00000000+000＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝3′DC A B7 5′000+00000000+000＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝3′DC B A8 5′000+00000000+000＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝3′A B C9 5′＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′A B D10 5′＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′B A C11 5′＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′B A D12 5′＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′CD A13 5′000+00000000+000＝＝+＝＝＝＝＝3′CD B14 5′000+00000000+000＝＝+＝＝＝＝＝3′DC A15 5′000+00000000+000＝＝+＝＝＝＝＝3′DC B16 5′000+00000000+000＝＝+＝＝＝＝＝3′CA B17 5′000+0000＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝3′
CB A18 5′000+0000＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝3′DA B19 5′000+0000＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝3′DB A20 5′000+0000＝＝+＝＝＝＝＝＝＝+＝＝＝＝＝3′A CD21 5′＝＝+＝＝＝＝＝000+00000000+000 3′A DC22 5′＝＝+＝＝＝＝＝000+00000000+000 3′B CD23 5′＝＝+＝＝＝＝＝000+00000000+000 3′B DC24 5′＝＝+＝＝＝＝＝000+00000000+000 3′A C B D25 5′＝＝+＝＝＝＝000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′A D B C26 5′＝＝+＝＝＝＝000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′B C A D27 5′＝＝+＝＝＝＝000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′B D A C28 5′＝＝+＝＝＝＝000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′C A DB29 5′000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000＝＝+＝＝＝＝3′C B DA30 5′000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000＝＝+＝＝＝＝3′D A CB31 5′000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000＝＝+＝＝＝＝3′
D B CA32 5′000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000＝＝+＝＝＝＝3′A C B33 5′＝＝+＝＝＝＝000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝3′A D B34 5′＝＝+＝＝＝＝000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝3′B C A35 5′＝＝+＝＝＝＝000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝3′B D A36 5′＝＝+＝＝＝＝000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝3′C A D37 5′000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′C B D38 5′000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′D A C39 5′000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′D B C40 5′000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝000+0000 3′A D41 5′＝＝+＝＝＝＝000+0000 3′B C42 5′＝＝+＝＝＝＝000+0000 3′C A43 5′000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝3′D B44 5′000+0000＝＝＝+＝＝＝＝＝3′以上A；B；C和D各抗原位點可以重復，如BBAAACCDD等。各易位重組體也可重復，如DAC-DAR-DB-DB-DB等。各易位重組體也可再重組，如ABCD-DCBA等等。任何重組都要確保能表達正確的蛋白質，即蛋白質閱讀框需正確無誤。
基因與基因之間的融合可以為同種之間，如人體肝臟甲胎蛋白和人體其它腫瘤表達的胚胎抗原的基因易位重組，表達融合蛋白作疫苗等等。也可以在異種之間基因之間進行。如人體基因和植物基因，人體基因和微生物的基因，植物基因和微生物的基因之間的抗原基因易位重組，表達融合蛋白制作疫苗等等。
③克隆到表達載體，表達融合抗原基因易位重組后，將其克隆到哺乳動物細胞表達載體，表達融合抗原。
④篩選高效融合抗原克隆的具體方法是步驟③的克隆純化質粒后，直接免疫動物，測試抗體效價，篩選出具有較強抗原性的克隆。
⑤制取特定融合疫苗經下列方法之一，制取特定DNA融合疫苗或特定RNA融合疫苗、特定蛋白融合疫苗1)經步驟③篩選出的哺乳動物細胞表達質粒，即直接作為特定DNA融合疫苗。
2)將步驟③篩選出的哺乳動物細胞表達質粒DNA作模板進行PCR擴增，擴增時5’端質粒引物內含RNA啟動子T7或T3、SP6序列，3’端質粒引物內含P0LY(T)序列；再將PCR產物用相應的RNA聚合酶把全部的克隆轉化為有義鏈RNA，外加脫氧核糖核酸酶I消化DNA模板即得特定RNA融合疫苗。
3)將步驟③篩選出的純化質粒DNA表達為蛋白質，并加以純化即得特定蛋白融合疫苗。
實施例2用PCR方法合成靶基因或靶抗原對屬RNA基因組的生物體(例如RNA病毒等)，先抽取并純化雙鏈RNA分子，再將雙鏈的RNA分子逆轉錄為DNA分子，并以此作為PCR模板，用PCR擴增法分離出靶基因或抗原，整個過程稱之為RT-PCR，其中將RNA逆轉錄為DNA分子的具體步驟包括a)將雙鏈RNA分子和隨機引物按分子比1∶50(或1∶100或1∶500或1∶1000或1∶10000)的比例進行混合。隨機引物序列5′-----------------------XXXX-3′5′-----------------------XXXXX-3′5′-----------------------XXXXXX-3′5′-----------------------XXXXXXX-3′5′-----------------------XXXXXXXX-3′5′-----------------------XXXXXXXXX-3′5′-----------------------XXXXXXXXXX-3′5′-----------------------XXXXXXXXXXX-3′5′-----------------------XXXXXXXXXXXX-3′“X”為隨機堿基A或T或G或C。
“-----”為隨意DNA序列，其中可含有內切酶位點。引物的的熔點(Tm)為50-80℃(例50、60、70、80℃)。
b)將雙鏈RNA分子和隨機引物的混合液加熱變性，溫度；85-98℃(例85、90、93、98C)，時間30秒-30分鐘(例30秒、1分鐘、5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘)。
c)迅速置于4℃到-4℃(例4、2、0、-2、-4℃)，退火2～4分鐘(可以是2、3、4分鐘)。
d)加逆轉錄酶、相應緩沖液和dNTP完成第一鏈的的合成。
e)用PCR完成第二鏈的合成。所用引物與第一鏈合成相同。
也可用傳統的第二鏈合成方法合成。如由大腸桿菌DNA多聚酶加大腸桿菌RNA連接酶和核糖核酸酶H(RNase H)共同完成。在此情形下，上述隨機引物的隨意DNA序列可以去除。隨機引物序列如下所示5′-XXXX-3′5′-XXXXX-3′5′-XXXXXX-3′5′-XXXXXXX-3′5′-XXXXXXXX-3′
5′-XXXXXXXXX-3′5′-XXXXXXXXXX-3′5′-XXXXXXXXXXX-3′5′-XXXXXXXXXXXX-3′“X”為隨機堿基A或T或G或C。其余步驟均同實施例1。
權利要求
1.一種特定融合疫苗的制備方法，其特征是依次包括下列步驟①用PCR方法合成靶基因或靶抗原；②將抗原在基因內和/或基因間易位重組；③克隆到表達載體，表達融合抗原；④篩選高效融合抗原克隆；⑤制取特定融合疫苗。
2.根據權利要求1所述的特定融合疫苗的制備方法，其特征是步驟②的具體方法是采用限制性內切酶，將消化的片段再連接，完成重組。
3.根據權利要求1或2所述的特定融合疫苗的制備方法，其特征是步驟③的方法是基因易位重組后，將其克隆到哺乳動物細胞表達載體，表達融合抗原。
4.根據權利要求1或2所述的特定融合疫苗的制備方法，其特征是步驟④篩選高效融合抗原克隆的具體方法是；步驟③的克隆純化質粒后，直接免疫動物，測試抗體效價，篩選出具有較強抗原性的克隆。
5.根據權利要求1或2所述的特定融合疫苗的制備方法，其特征是步驟⑤制取特定融合疫苗的方法是經步驟④篩選出的哺乳動物細胞表達質粒，即直接作為特定DNA融合疫苗。
6.據權利要求1或2所述的特定融合疫苗的制備方法，其特征是步驟⑤制取特定融合疫苗的方法是將步驟④篩選出的哺乳動物細胞表達質粒DNA作模板進行PCR擴增，擴增時5’端質粒引物內含RNA啟動子T7或T3、SP6序列，3’端質粒引物內含POLY(T)序列；再將PCR產物用相應的RNA聚合酶把全部的克隆轉化為有義鏈RNA，外加脫氧核糖核酸酶I消化DNA模板即得特定RNA融合疫苗。
7.據權利要求1或2所述的特定融合疫苗的制備方法，其特征是步驟⑤制取特定融合疫苗的方法是將步驟④篩選出的純化質粒DNA表達為蛋白質，并加以純化即得特定蛋白融合疫苗。
全文摘要
本發明公開了一種特定融合疫苗的制備方法，依次包括①用PCR方法合成靶基因或靶抗原；②將抗原在基因內和/或基因間易位重組；③克隆到表達載體，表達融合抗原；④篩選高效融合抗原克隆；⑤制取特定融合疫苗。本發明方法新穎、獨特，制取的疫苗免疫效果好，能對外來的病原體入侵和自身突變細胞的繁殖和擴散進行免疫預防，還能結合抗原攜帶細胞為媒介，刺激機體的細胞毒T淋巴細胞對外來的病原體和自身突變細胞產生有效的免疫治療作用。
文檔編號A61K45/00GK1416898SQ0214843
公開日2003年5月14日 申請日期2002年12月2日 優先權日2002年12月2日
發明者朱遠源 申請人:朱遠源