273] 將PPD皮試陰性的豚鼠隨機分為13組，每組6只，雌雄各半。每組豚鼠分別注射1種 步驟一得到的滅活的分枝桿菌菌液。注射部位:大腿內側腹股溝區；注射劑量:〇.5ml(5mg); 注射次數:一周致敏一次，共致敏四次。分別制備得到滅活的結核分枝桿菌H37Rv組致敏豚 鼠、滅活的卡介菌(BCG)組致敏豚鼠、滅活的牛結核分枝桿菌組致敏豚鼠、滅活的猿分枝桿 菌組致敏豚鼠、滅活的蘇加分枝桿菌組致敏豚鼠、滅活的戈登分枝桿菌組致敏豚鼠、滅活的 胞內分枝桿菌組致敏豚鼠、滅活的淺黃分枝桿菌組致敏豚鼠、滅活的不產色分枝桿菌組致 敏豚鼠、滅活的金色分枝桿菌組致敏豚鼠、滅活的堪薩斯分枝桿菌組致敏豚鼠、滅活的微黃 分枝桿菌組致敏豚鼠和滅活的草分枝桿菌組致敏豚鼠。最后一次致敏后一周再進行如下步 驟2的pro皮試。
[0274] 2、輪圈法皮膚試驗
[0275] 為排除豚鼠個體差異，參照《中國生物制品規程》，采用輪圈法進行皮膚試驗。
[0276] 分別將步驟1制備的各組的6只致敏豚鼠，背部剃凈毛后，依次作好5個皮膚試驗點 標記，采用體積均為0.1ml的無菌PBS(陰性對照）、5IU PPD(陽性對照）標準液、l.Oyg重組 CFP10蛋白的稀釋液、1. Oyg重組ESAT6蛋白的稀釋液、1. Oyg實施例1制備的純化的重組融合 蛋白CE的稀釋液(均用無菌PBS稀釋)在每只豚鼠背部皮膚試驗點依次輪圈進行皮內注射。 分別于2處、481 1、7211，雙盲法測量注射局部皮膚紅斑的縱、橫直徑，并計算兩者的平均值。 [0277]三、實驗結果
[0278] roS (陰性對照)注射點局部在24、48、72h均無紅斑反應，72h時大部分豚鼠注射點 的遲發型超敏反應(delayed type hypersensitivity，DTH)直徑已小于5mm，失去統計意 義，因此不再對PBS注射點及72h的縱、橫直徑進行數據統計。滅活的結核分枝桿菌H37Rv組 及滅活的卡介菌(BCG)組致敏豚鼠24h、48h DTH反應直徑結果如表7和表8所示，13組滅活的 分枝桿菌組致敏豚鼠24h DTH反應平均直徑結果如表9所示。
[0279] 表7滅活的結核分枝桿菌H37Rv組致敏豚鼠24h、48h DTH反應（cm)
[0280]
[0281] 表8滅活的卡介菌(BCG)組致敏豚鼠24h、48h DTH反應(cm)
[0282]
[0283]
[0284] 表9不同蛋白抗原皮試24h各組致敏豚鼠的DTH反應結果（叉±SD, cm)
[0286] 時間效應
[0287] 對表7的結果進行分析，采用SPSS軟件分別對PPD、CFP10、ESAT6、CE抗原24h、48h的 數據進行配對T檢驗，結果表明：Pro、CFP10、ESAT6和CE抗原24h的DTH反應平均直徑均大于 其48h的DTH反應平均直徑(？〈0.05)，4811的01'!1反應平均直徑均大于其7211的01'!1平均直徑。 可見注射后24h為豚鼠皮試的最佳觀測時間。
[0288] 性別效應
[0289]對表7和表8的結果進行分析。采用SPSS軟件對滅活的結核分枝桿菌H37Rv組豚鼠 雌雄個體間進行Wilks'Lambda分析，結果表明：無論是對單抗原進行考察還是同時考察四 個抗原，性別之間均沒有顯著性差異(Wilks'Lambda結果P = 0.6547>0.05)。對滅活的卡介 菌組進行同樣的分析，得到相同的結論，即性別之間沒有顯著性差異(Wilks'Lambda結果P =0.7119>0.05)。
[0290]重組蛋白抗原誘發滅活的不同分枝桿菌致敏豚鼠的DTH反應 [0291] PPD(陽性對照）及各重組蛋白抗原的豚鼠局部DTH反應平均直徑>5mm的為陽性反 應。表9表明，PH)可誘導滅活的結核分枝桿菌復合群(包括結核分枝桿菌H37Rv、卡介菌和牛 結核分枝桿菌)和大多數滅活的非結核分枝桿菌致敏的豚鼠產生強的皮膚反應，只有少數 滅活的非結核分枝桿菌(包括堪薩斯分枝桿菌、微黃分枝桿菌和草分枝桿菌)致敏的豚鼠產 生弱的皮膚反應。而重組CE、ESAT6和CFP10蛋白均只誘導滅活的結核分枝桿菌H37Rv組致敏 豚鼠、滅活的牛結核分枝桿菌組致敏豚鼠產生強的皮膚反應，而對滅活的卡介菌和其它10 種受試的非結核分枝桿菌致敏的豚鼠都只產生弱的皮膚反應。
[0292] 四、應用CE-ELISP0T試驗和英國牛津免疫技術公司研制的結核感染T細胞斑點實 驗(T-SP0T.TB)試劑盒分析72例結核病患者對重組融合蛋白CE、重組ESAT6蛋白、重組CFP10 蛋白的反應，其中包括45例肺結核或合并有其它部位的結核、18例骨結核和9例漿膜腔積液 患者，42例男性，30例女性，平均年齡39.6 ±18.5。結果如表10所示。
[0293] 表10應用ELISP0T試驗分析72例結核病患者對CE、ESAT6、CFP10的反應結果
[0294]
[0295] 結果表明，在72例結核病患者中，重組融合蛋白CE刺激的ELISP0T試驗陽性率為 58.3 %，重組ESAT6蛋白刺激的ELISP0T試驗陽性率為44.4 %，重組CFP10蛋白刺激的 ELI SPOT試驗陽性率為43.1 %，ESAT6和CFP10聯合陽性率為55.6 %。上述結果表明，ESAT6和 CFP10抗原均可被人T細胞識別，誘導強的細胞免疫應答，產生大量IFN-γ，說明這兩種抗原 均有較多的T細胞抗原決定簇。不同個體的抗原特異性CD4+T淋巴細胞對ESAT6和CFP10的反 應并不完全相同，說明抗原的識別受個體遺傳因素的影響，可能是個體存在HLA多態性所 致。
[0296]實施例3、用于未滅活結核分枝桿菌H37Rv致敏豚鼠的皮膚試驗
[0297] 將實施例1制備的純化的重組融合蛋白CE應用于未滅活結核分枝桿菌H37Rv致敏 豚鼠的皮膚試驗，以其作為皮膚變態反應原，獲得了理想的遲發型超敏反應。
[0298] -、菌體的培養和菌體的制備及定量 [0299]以下操作均在無菌條件下進行：
[0300] 1、種子培養
[0301 ]將結核分枝桿菌H37RV標準株干粉管用無菌水混勻，接種改良羅氏培養基，放37°C 培養3周，等生長成菜花狀，再轉種在50ml蘇通培養基的三角錐形瓶中，放37°C培養3周使其 成膜生長，如菌膜生長不多，需再轉種，直至菌膜成片浮在培養基表面時，再擴大培養。 [0302] 2、擴大培養
[0303] 500ml三角燒瓶中裝蘇通培養基200ml，將上述步驟1的種子瓶內菌膜分別轉種于 蘇通培養基液體上面，勿震蕩，盡量使菌膜浮在培養基表面，37°C培養3-4周，得培養液。 [0304] 3、菌體洗滌
[0305] 將步驟2得到的培養液于5000rpm離心10min，棄上清，用無菌PBS洗滌菌沉淀，反復 三次。在電子天平上稱取細菌重量。
[0306] 4、菌體破碎
[0307]用適量的無菌PBS混懸步驟3得到的菌沉淀，在冰浴條件下超聲破碎菌體(共15分 鐘），離心得到菌沉淀。
[0308] 5、確定菌濃度
[0309]用電子天平稱取0. lg步驟4得到的菌沉淀，用100ml的無菌PBS-Tween80混懸菌沉 淀，用無菌PBS稀釋細菌，使結核分枝桿菌H37Rv終濃度為10μg/ml，得到結核分枝桿菌H37Rv 菌液。
[0310]二、皮膚試驗 [0311] 1、豚鼠致敏
[0312] 豚鼠觀察7d后，背部剪毛，進行PPD皮試，PPD皮試方法為:皮內注射5IU PPD，注射 后24h、48h、72h觀察注射部位有無紅腫反應。若無反應或反應很弱（直徑小于5mm)的豚鼠， 則為PH)皮試陰性，用于致敏。
[0313] 選擇6只pro皮試陰性的豚鼠，雌雄各半，注射步驟一得到的結核分枝桿菌H37Rv菌 液。注射部位:大腿內側腹股溝區;注射劑量:〇. 5ml (5yg);注射次數:一周致敏一次，共致敏 四次。制備得到結核分枝桿菌H37Rv組致敏豚鼠。最后一次致敏后一周再進行如下步驟2的 PPD皮試。
[0314] 2、輪圈法皮膚試驗
[0315]為排除豚鼠個體差異，參照《中國生物制品規程》，采用輪圈法進行效價測定。
[0316]將步驟1制備的6只結核分枝桿菌H37Rv組致敏豚鼠，同一背部剃凈毛后，依次作好 6個皮膚試驗點標記，采用體積均為0.1ml的無菌PBS(陰性對照）、5IU PPD(陽性對照)標準 液、0.6yg純化的重組融合蛋白CE的稀釋液、0.8yg純化的重組融合蛋白CE的稀釋液、1 .Oyg 純化的重組融合蛋白CE的稀釋液、1.2yg純化的重組融合蛋白CE的稀釋液(均用無菌PBS稀 釋)依次輪圈進行皮內注射。分別于24h、48h、72h，雙盲法測量注射局部皮膚紅斑的縱、橫直 徑，并計算兩者的平均值(mm)。
[0317] 三、實驗結果
[0318] 72h時大部分豚鼠的DTH反應直徑已小于5mm，失去統計意義，因此不再對72h的縱、 橫直徑進行數據統計。PBS(陰性對照)注射點局部無紅斑反應。結核分枝桿菌H37Rv組致敏 豚鼠24h、48h的DTH反應直徑結果如表11所示。
[0319]表11純化的重組融合蛋白CE誘發未滅活結核分枝桿菌致敏豚鼠 DTH反應
[0322] 表11表明，0.6yg、0.8yg、1. Oyg和1.2yg的純化的重組融合蛋白CE均能誘導未滅活 分枝桿菌H37Rv致敏的豚鼠產生強的皮膚反應。
[0323] 上述實驗結果表明，實施例1制備的純化的重組融合蛋白CE作為皮膚變態反應原， 用于結核分枝桿菌、牛結核分枝桿菌致敏的豚鼠，可特異地誘導產生強的遲發型超敏反應； 而用于卡介菌、大多數環境中非結核分枝桿菌致敏的豚鼠，只誘導產生弱的遲發型超敏反 應;并且其對結核分枝桿菌的特異性強于現有商品化的皮膚診斷試劑PPD，可用于制備診斷 結核分枝桿菌感染的藥物。因此，本發明在結核感染的診斷及結核病的輔助診斷方面將具 有廣闊的應用前景。
【主權項】
1. 一種蛋白，是如下a)或b)的蛋白質： a) SEQIDN0.2所示的蛋白質； b) 將SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加且功能相同的蛋白質。2. 與權利要求1所述的蛋白相關的生物材料，為如下B 1)或B 2): B1)編碼權利要求1所述蛋白的核酸分子； B2)含有B1)所述核酸分子的表達盒、重組載體、重組微生物或轉基因細胞系。3. 根據權利要求2所述的生物材料，其特征在于:B1)所述核酸分子為如下1)或2)或3) 所示的基因： 1. SEQ ID No.l中第4-612位所示的0嫩分子； 2) 在嚴格條件下與1)限定的DNA分子雜交且編碼權利要求1所述蛋白質的DNA分子； 3) 與1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼權利要求1所述蛋白質的DNA 分子。4. 權利要求1所述蛋白的制備方法，包括如下步驟:將編碼權利要求1所述蛋白的核酸 分子導入宿主菌中得到重組菌，誘導所述重組菌表達權利要求1所述的蛋白。5. 根據權利要求4所述的方法，其特征在于:所述核酸分子是通過重組表達載體導入所 述宿主菌的； 所述誘導所述重組菌表達包括將所述重組菌在發酵培養基中進行發酵培養，并用IPTG 誘導使所述重組菌表達權利要求1所述的蛋白。6. 根據權利要求4或5所述的方法，其特征在于:所述IPTG誘導使所述重組菌表達權利 要求1所述的蛋白之后還包括純化所述蛋白的步驟。7. 權利要求1所述的蛋白和/或權利要求2或3所述的生物材料在制備檢測或輔助檢測 結核分枝桿菌感染的產品中的應用。8. 權利要求1所述的蛋白和/或權利要求2或3所述的生物材料在制備檢測或輔助檢測 結核分枝桿菌引起的疾病的產品中的應用。9. 根據權利要求8所述的應用，其特征在于:所述疾病為結核病。10. 根據權利要求9所述的應用，其特征在于:所述結核病為肺結核或肺外結核。
【專利摘要】本發明公開了一種結核分枝桿菌特異性融合蛋白及其編碼基因與應用。本發明公開一種蛋白，是如下a)或b)的蛋白質：a)SEQ？ID？No.2所示的蛋白質；b)將SEQ？ID？No.2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質。本發明公開的重組融合蛋白CE作為皮膚變態反應原可以特異地誘導結核分枝桿菌致敏后產生強的遲發型變態反應，其特異性強于現有商品化的皮膚診斷試劑PPD。本發明公開的重組融合蛋白CE可用于制備診斷結核感染的藥物。
【IPC分類】G01N33/569, C07K19/00, G01N33/68, C12N15/62
【公開號】CN105524177
【申請號】CN201610011926
【發明人】吳雪瓊, 蔡小波, 張俊仙, 李征, 陽幼榮, 徐學鵬, 梁艷, 王海彬, 白驊
【申請人】中國人民解放軍第三O九醫院, 浙江海正藥業股份有限公司
【公開日】2016年4月27日
【申請日】2016年1月8日