結核分枝桿菌特異性融合蛋白及其編碼基因與應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于結核病醫學免疫學診斷技術領域，涉及一種結核分枝桿菌特異性融合 蛋白及其編碼基因與應用，具體涉及一種應用基因工程技術制備的結核分枝桿菌特異性重 組融合蛋白CE及其編碼基因與應用。
【背景技術】
[0002] 結核病是危害人類健康的主要傳染病之一，是當前急需解決的公共健康難題之 一。1985年以來艾滋病的流行、結核感染的移民和部分人群生活貧困等原因使美國等歐美 發達國家結核病發病率呈回升趨勢，尤其是結核菌耐藥和非結核分枝桿菌病發病率上升加 大和阻礙了結核病診斷、治療的難度和進度。目前全世界有結核病人約2000萬，每年新增感 染人數800-1000萬，每年死于結核病的人數約140萬。
[0003] 我國是全球22個結核病高負擔國家之一，結核病疫情和耐藥情況都相當嚴重，結 核病人數位居世界第二，僅次于印度。2010年第五次全國結核病流行病學抽樣調查初步結 果表明，現有肺結核病人500-600萬，其中傳染性肺結核病人約86萬，全國肺結核發病人數 和死亡人數位于各種法定傳染病的首位。結核病是通過呼吸道傳播的傳染性很強的疾病， 我國約有三分之一人口感染了結核菌，其中5%可能早期發病，5%可能在其一生中的任何 時候發病。因此，結核高危人群的主動發現、動態監測和預防治療可有效減少肺結核的發病 率，結核病的早期診斷、發現傳染源、有效化療對于控制結核病及結核菌傳播都有極其重要 的意義。
[0004] 目前臨床上常規應用的診斷方法中，用于檢測排菌肺結核患者的臨床標本涂片的 靈敏度低，陽性率只有20-30%，傳統的羅氏培養的陽性率也只有30%左右，而且需4-8周時 間，國際認可的分枝桿菌快速培養系統一般也需2周以上，而且試劑昂貴，檢測成本高而難 以普及。用于檢測結核感染者、輔助菌陰肺結核病患者診斷的結核菌素皮膚試驗的特異性 差，不能鑒別卡介苗接種者和部分環境分枝桿菌感染者;血清結核抗體檢測的靈敏度和特 異性不理想;近兩年開發的γ干擾素釋放試驗試劑昂貴，技術復雜，不適合于基層或現場應 用。顯然目前臨床上常規應用的診斷方法不能滿足臨床醫療的需求，尤其是基層醫療單位 可用的檢測方法極少。
[0005] 結核菌素是結核分枝桿菌培養濾液蛋白，其作用于人體會激發已致敏機體產生細 胞免疫反應，激活Τ淋巴細胞、單核細胞和巨噬細胞，釋放大量細胞因子，并使這些細胞增 殖、聚集，包裹抗原形成結節，這就是遲發型變態反應，其反應強度與細胞免疫呈平行關系。 結核菌素皮膚試驗已成為目前臨床上最常用且最簡便的一種結核菌感染診斷方法，反應越 強，表示結核感染可能性越大，我國一直使用硬結2 5mm為陽性，2 20mm或有水泡、壞死、淋 巴結炎等為強陽性，3歲以下兒童2 15mm為強陽性的標準。用于結核病皮膚試驗的主要試劑 有以下幾種：（1)舊結核菌素:不易標準化和易發生非特異性反應，目前已經很少使用。（2) 人型PPD:結核分枝桿菌強毒株培養濾液的純蛋白衍化物(PH))，由于生產菌株具有很強的 傳染性，國家要求該PPD的制備需在負壓車間進行，目前國內雖有廠家生產，但尚沒有銷售 的結核分枝桿菌PPD。（3)卡介菌PPD:是卡介苗菌株的培養濾液純蛋白衍化物，主要用于檢 測卡介苗接種是否成功。在沒有人型Pro的情況下，臨床上用卡介菌pro替代人型pro進行皮 膚試驗，但兩者pro成份并不完全一樣，因此，卡介菌pro皮膚試驗輔助結核病診斷的價值尚 需進一步研究。（4)結核分枝桿菌重組38KD蛋白：目前尚無市售產品。該抗原刺激產生的皮 膚反應較輕，一般不會產生水泡和淋巴管炎等副作用;且該蛋白存在于結核分枝桿菌復合 群中，結核感染者反應強，卡介苗接種者反應弱，因此，它不能完全鑒別結核感染者和卡介 苗接種者。
[0006] ESAT6蛋白是一種低分子量(6kDa)早期分泌性蛋白，由結核分枝桿菌、牛結核分枝 桿菌和少數致病性分枝桿菌基因組的差異區域(RD)1編碼，但所有卡介苗菌株及絕大部分 環境分枝桿菌基因組均丟失該區域，不表達ESAT6蛋白。ESAT6蛋白含有多個T淋巴細胞抗原 表位，該蛋白或其多肽可作為T細胞刺激抗原，可用作皮膚試驗抗原用于診斷結核菌感染、 輔助診斷結核病。
[0007] CFP10是一個由RV3874基因編碼的100個氨基酸的蛋白，其基因位于ESAT6基因的 上游，與ESAT6編碼基因均位于RD1，屬于同一個lhp-exe操縱子，由同一個啟動子調節轉錄， 兩者分布于相同的分枝桿菌中，其基因存在于結核分枝桿菌復合群和少數其他分枝桿菌 (如胃、堪分枝桿菌）中，但在BCG所有菌株中均未發現其基因。CFP10序列與ESAT6基因有約 40%的同源性，其蛋白也屬于ESAT6家族的成員之一，兩者具有相同的免疫學特性。CFP10蛋 白也含有多個T淋巴細胞抗原表位，該蛋白或其多肽均可作為T細胞刺激抗原。
[0008] ESAT6蛋白和CFP10蛋白所具有的T淋巴細胞抗原表位不同，不同遺傳背景的結核 感染者對這兩種抗原的反應也不完全相同，一部分結核感染者對這兩種抗原的刺激均產生 反應，而部分結核感染者只對ESAT6蛋白或CFP10蛋白起反應。單獨應用ESAT6蛋白作為刺激 抗原，部分結核感染者由于對ESAT6蛋白不反應而造成漏診。因此，提供一種高靈敏度、高特 異性、制備簡便、高產的用于診斷結核感染的皮膚變態反應原就成為本技術領域急需解決 的問題。

【發明內容】

[0009] 本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足之處，提供一種高靈敏度、高 特異性、制備簡便、高產的結核分枝桿菌特異性重組融合蛋白，用于人類或動物結核分枝桿 菌引起的感染和疾病的檢測。
[0010] 為解決以上技術問題，本發明提供一種蛋白，名稱為重組融合蛋白CE，是如下a)或 b)的蛋白質：
[0011] a)SEQIDNo·2所示的蛋白質；
[0012] b)將SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加且功能相同的蛋白質。
[0013] 所述重組融合蛋白CE可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。 所述b)中的蛋白質的編碼基因可通過將SEQ ID No. 1中第4-612位所示的DNA序列缺失或添 加一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變得到。
[0014] 為解決以上技術問題，本發明還提供與所述蛋白相關的生物材料，為如下B1)或 B2)：
[0015] B1)編碼所述蛋白的核酸分子；
[0016] B2)含有B1)所述核酸分子的表達盒、重組載體、重組微生物或轉基因細胞系；
[0017] 所述核酸分子可以是DNA，如CDNA、基因組DNA或重組DNA;所述核酸分子也可以是 RNA，如 mRNA 或 hnRNA 等。
[0018] 上述生物材料中，B1)所述的核酸分子為如下1)或2)或3)所示的基因：
[0019] 1)SEQ ID No.l中第4-612位所示的DNA分子；
[0020] 2)在嚴格條件下與1)限定的DNA分子雜交且編碼所述蛋白質的DNA分子；
[0021] 3)與1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且所述蛋白質的DNA分子。
[0022] 本領域普通技術人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進化和點突變的方 法，對本發明的編碼重組融合蛋白CE的核苷酸序列進行突變。那些經過人工修飾的，具有與 本發明的編碼重組融合蛋白CE的核苷酸序列有一定同一性的核苷酸，只要編碼重組融合蛋 白 CE且具有重組融合蛋白CE的功能，均是衍生于本發明的核苷酸序列并且等同于本發明的 序列。
[0023] 這里使用的術語"同一性"指與核酸序列的序列相似性。"同一性"可以用肉眼或計 算機軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比（％)表 示，其可以用來評價相關序列之間的同一性。
[0024] 上述生物材料中，B2)所述的含有編碼重組融合蛋白CE的核酸分子的表達盒，是指 能夠在宿主細胞中表達重組融合蛋白CE的DNA，該DNA不但可包括啟動編碼重組融合蛋白CE 的基因轉錄的啟動子，還可包括終止編碼重組融合蛋白CE的基因轉錄的終止子。進一步，所 述表達盒還可包括增強子序列；
[0025] 可用現有的表達載體構建含有編碼重組融合蛋白CE的核酸分子的重組載體，現有 的表達載體如pET系統、pGEX;
[0026] 所述載體可為質粒、黏粒、噬菌體或病毒載體；
[0027] 所述重組微生物具體可為細菌、藻和真菌，其中，細菌可為大腸桿菌；
[0028] 所述轉基因細胞系為非繁殖材料。
[0029] 為解決以上技術問題，本發明還提供所述蛋白的制備方法，包括如下步驟:將編碼 所述蛋白的核酸分子導入宿主菌中得到重組菌，誘導重組菌表達所述蛋白。
[0030] 上述方法中，所述核酸分子是通過重組表達載體導入所述宿主菌的；
[0031 ] 所述重組表達載體具體是將SEQIDNo.3所示的DNA分子替換pET-30a( + )的NdeI 和Xho頂每切位點間序列，pET-30a( + )的其余序列不變得到的；
[0032] 所述宿主菌具體為大腸桿菌；
[0033] 所述表達包括將所述重組菌在發酵培養基中進行發酵培養，并用IPTG誘導使所述 重組菌表達所述蛋白；
[0034]所述發酵培養基具體包括蛋白胨8-128/1、氯化鈉1.5-2.58/1，磷酸二氫鉀6.0-7.5g/L，三水合磷酸氫二鉀11.0-12. Og/L，硫酸銨1.8-2.2g/L，消泡劑0.4-0.6ml/L;再具體 包括蛋白胨l〇g/L、氯化鈉2. Og/L，磷酸二氫鉀6.8g/L，三水合磷酸氫二鉀11.4g/L，硫酸銨 2.(^/1，消泡劑0.51111/1;
[0035] 所述發酵培養的條件具體為:溫度36.5-37.5°C，pH 6.7-6.9,溶氧30-80%;
[0036] 所述溫度具體為37°C，pH具體為6.8;
[0037] 所述IPTG誘導具體是在發酵培養的培養液的0D6Q()達到20-40時開始誘導，IPTG終 濃度為〇. 4-0.6mM;再具體是在發酵培養的培養液的OD600達到25-35時開始誘導，IPTG終濃 度為0.5mM;
[0038] 所述發酵培養還可以采用指數流加補料策略，以發酵培養的培養液的糖含量小于 lg/L為標準調節補料培養基的補加速度；
[0039]所述補料培養基具體包括葡萄糖350-370g/L、七水合硫酸鎂12-18g/L、酵母抽提 物470-490g/L;再具體包括葡萄糖360g/L、七水合硫酸鎂15g/L、酵母抽提物480g/L;
[0040]所述表達之后還包括純化的步驟，所述純化包括將所述發酵培養的重組菌進行破 碎、收集上清、超濾和/或離子交換層析的步驟；
[0041]所述離子交換層析具體為陰離子交換層析，再具體為DEAE sepharose Fast Flow 柱層析、Aminobutyl Sepharose 6Fast Flow柱層析和/或Q Sepharose High Performance 柱層析。
[0042] 為解決以上技術問題，本發明還提供上述蛋白和/或上述任一所述的生物材料在 制備檢測或輔助檢測結核分枝桿菌感染的產品中的應用。
[0043] 上述應用中，所述產品為變態反應原；
[0044] 所述變態反應原具體為皮膚變態反應原。
[0045] 為解決以上技術問題，本發明還提供上述蛋白和/或上述任一所述的生物材料在 制備檢測或輔助檢測結核分枝桿菌引起的疾病的產品中的應用。
[0046] 上述應用中，所述疾病為結核病；
[0047] 上述應用中，所述結核病為肺結核或肺外結核；
[0048]所述肺結核具體為菌陰肺結核。
[0049]上述任一所述的應用中，所述結核分枝桿菌為結核分枝桿菌Η 3 7 R v (]\1.1：油61'(3111〇818)或牛結核分枝桿菌(]\1.130￥18)。
[0050] 上述任一所述的應用中，所述產品在結核分枝桿菌感染者或結核病患者的皮膚試 驗中能導致遲發型超敏反應。
[0051] 本發明通過分析結核分枝桿菌CFP10和ESAT6的基因序列和蛋白質結構，確定兩個 蛋白抗原表位融合的區域、組合和順序，根據大腸桿菌的密碼子使用頻率，選擇其中高頻率 的密碼子即最佳密碼子或偏愛密碼子，去除一些稀有或利用率低的密碼子，通過同義密碼 子替換原有密碼子進行優化，設計出重組融合蛋白CE的編碼基因；進一步利用載體pET-30a (+ )構建含有融合蛋白CE的編碼基因的重組表達載體CE/pET-30a，并制備得到CE/pET-30a 大腸桿菌工程菌；IPTG誘導CE/pET-30a大腸桿菌工程菌表達重組融合蛋白CE并對其進行進 一步純化。本發明提供的重組融合蛋白CE是將結核分枝桿菌兩種蛋白CFP10和ESAT6關鍵的 抗原表位依次連接構成，其中CFP10蛋白的抗原表位