結核桿菌CFP10?38kD?19kD融合蛋白構建及鑒定的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種結核分枝桿菌三聯重組融合蛋白CFP10?38kD?19kD，并將其應用于肺結核的臨床診斷。選用結核分枝桿菌的三個強抗原表位，利用PCR方法，以H37RV為模板構建的一種結核分枝桿菌三聯重組融合蛋白，利用DNA?水凝膠無細胞體外蛋白表達系統表達融合蛋白，利用金屬螯合親和層析技術對得到的重組蛋白進行純化，最后以其為抗原，利用斑點金免疫滲濾技術制備新型結核分枝桿菌血清學檢測試劑盒。與市場上的同類試劑盒相比，具有特異性強、敏感性高等優點，為結核病的篩查和診斷提供更可靠的工具，亦可用于制備蛋白芯片、疫苗、單抗和多抗等。
【專利說明】
結核桿菌CFP10-38kD-19kD融合蛋白構建及鑒定
技術領域
[0001] 本發明設及基因工程領域，具體地設及一種結核分枝桿菌=聯重組融合蛋白的構 建及其應用。
【背景技術】
[0002] 結核病是由結核分枝桿菌感染所致的一種慢性傳染病，W肺結核(Tuberculosis, TB)最為常見，呈世界性分布，是當今世界由單一致病菌感染引起的死亡率最高的疾病，嚴 重威脅人類健康。據統計，全世界每年的新增病例約800萬，死亡人數達200-300萬。全球結 核病負擔最終的是亞洲和非洲，我國屬于世界結核病高負擔國家之一，位居世界第2位，全 國接近有50 %的人感染過結核病，年發病人數約100萬，每年死于結核病的人數達13萬。其 中只有少部分患者夠得到正規的診斷，多數結核病患者因缺乏有效的檢查而造成誤診和漏 診，延誤治療。
[0003] 由于結核病主要通過飛沫傳播，因此結核病的早期診斷非常重要，采用簡單、快 速、準確的檢查盡早對結核病做出診斷對結核病疫情的控制至關重要。目前常見的結核分 枝桿菌檢測方法主要包括細菌學、免疫學、分子生物學和最近發展的細胞生物學四大塊，其 中細菌學中的疲涂片法是臨床最常用的檢測方法之一，也是是臨床診斷和鑒別結核病的 "金標準"，是發現肺結核傳染源的直接手段，但缺點為檢出率較低，而疲培養耗時時間太 長，需要1個月W上，很可能會延誤TB的最佳治療時間，延長感染傳染期，遠不能滿足臨床需 要。因此，迫切需要尋找新的、快速、特異的檢測方法W彌補傳統方法的不足，從而有效控制 結核分枝桿菌的傳播。
[0004] 血清學檢測是指在體外進行的抗原抗體反應，即利用已知的抗原來檢查血清或其 它樣品如卵黃、牛奶中是否含有相應的抗體。目前已有關于TB抗原血清學技術診斷方法，具 有操作簡單、快捷、所需耗材少等優點，在TB快速篩查和診斷中具有明顯的技術優勢，應用 前景較好，因此尋找理想的祀抗原，一直是眾多學者研究的熱點。然而，近年研究表明，單一 的結核桿菌抗原在血清學診斷中的敏感性及特異性往往不夠，難W有效區分結核桿菌感染 人群及患病人群，因此國內外學者嘗試將單一抗原聯合應用到結核病患者血清抗體檢測 中。
[0005] CFP10的編碼基因位于RD1區，是重要的T細胞抗原，具有良好的免疫原性，能夠誘 導機體產生特異性免疫應答，是結核病診斷和預防的研究熱點；38kD是結核桿菌蛋白抗原 之一，有研究證實，38kD抗原的免疫活性最強，缺乏抗38kD蛋白抗體的血清很難與結核菌其 它抗原發生反應；1化D是結核桿菌細胞壁上的一種脂蛋白，其已經被證明是具有免疫原性 的的抗原，可W被TB患者血清中的抗體所識別，一直W來被廣泛研究，Lyashchenko等的研 究表明，19kD作為抗原診斷結核病可W增加檢測的靈敏度。目前國內外關于19kD融合蛋白 的報道較少，因此本研究WCFP10、38kD、19kD在結核病血清學檢測方面的優勢，利用基因工 程技術構建了CFP10-38kD-19kDS聯融合蛋白，同時結合斑點金免疫滲濾技術制備了血清 學檢測試劑盒，期望能為結核病感染的診斷提供更為特異、準確的工具。

【發明內容】

[0006] (一)要解決的技術問題 本發明目的是構建結核分枝桿菌CFP10-38kD-19kDS聯重組融合蛋白，利用斑點金免 疫滲濾技術(DIGFA)生產特異性高、假陽性低的新型結核分枝桿菌血清學檢測試劑盒，為結 核病提供一種可靠、方便、快速的臨床診斷方法。
[0007] (二)技術方案 本發明根據NCBI數據庫檢索得到結核桿菌曲本V標準菌株CFP10、38kD W及19kD基因序 列，設計合成引物，經PCR、TA克隆后，酶切純化3段基因片段，與祀T28a載體進行依次重組， 首先構建祀T28a-CFP10重組質粒，鑒定成功基礎上繼續酶切與38kD片段連接，鑒定成功后， 進一步酶切與19kD片段連接，酶切鑒定，最終獲得pET-28a-CFP10-38kD-l化D重組表達載 體，測序鑒定CFP10-38kD-19kD重組融合序列重組成功。
[0008] 本發明應用DNA-水凝膠無細胞體外蛋白表達系統表達重組融合蛋白。首先合成X- DNA，應用心a /酶切對融合蛋白質粒進行線性化，同無核酸酶水、T4 DNA連接酶、T4 DNA連 接酶緩沖液等組成DNA凝膠反應混合液;然后基于磁力攬拌方式制備DNA凝膠微顆粒，并對 其進行純化和鑒定;最后按照RTS 100 ^ 試劑盒制備商業化無細胞反應液，確定無細 胞反應的最佳解育時間、X-DNAW及基因模版的最適濃度。最終獲得一種表達結核分枝桿菌 CFP10-38kD-19kDS聯重組融合蛋白的DNA-水凝膠無細胞蛋白表達系統。
[0009] 本發明應用金屬馨合親和層析介質技術(metal chelate chromatogra地y)純化 上述步驟中得到的重組融合蛋白，對純化后的融合蛋白進行氨基酸序列測定，同時應用BCA 法測定融合蛋白濃度，應用化ISA法測定融合蛋白活性。最終獲得純度大于96 %的結核分枝 桿菌CFP10-38kD-19kDS聯融合蛋白。
[0010] 本發明將上述獲得的高純度重組融合蛋白包被在硝酸纖維素膜上，用膠體金標記 葡萄球菌A蛋白（SPA)，然后組裝滲濾裝置，建立并優化斑點金免疫滲濾檢測體系，最終獲得 基于斑點金免疫滲濾技術的新型結核分枝桿菌血清學診斷試劑盒。臨床血清樣本檢測實驗 表明，該試劑盒的敏感性為(96.8 %)，假陽性為(2.8 %)。
[0011] (S)有效效益 采用本發明提供的結核分枝桿菌CFP10-38kD-19kD重組融合蛋白制備的診斷試劑盒， 與市場上的同類試劑盒相比，具有特異性強、靈敏度高等優點，更好的滿足了結核分枝桿菌 感染臨床診斷的需要。
【附圖說明】
[0012] 圖1是表達載體祀T-CFP10-38kD-19kD的構建流程圖； 圖2是表達載體祀T-CFP10-38kD-19kD的酶切電泳圖，A:單基因酶切電泳圖，l:Marker ，2:CFP10，3: 38kD，4:19kD;B:融合基因酶切電泳圖，1 :Marker，2 :酶切前的重組質粒，3 : CFP10，4:CFP10+38kD，5:CFP10+38kD+19kD; 圖3是X-DNA的4條寡核巧酸序列及檢驗電泳圖，1:XI，2:XI巧2，3:XI巧化X3，4:X1+X2+ X3 巧4; 圖4是DNA-水凝膠蛋白表達系統表達蛋白的金屬馨合層析親和純化凝膠電泳圖，1: Marker，2:純化前，3:純化后。
【具體實施方式】
[0013] W下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的保護范圍。
[0014] 實施例1:結核分枝桿菌CFP10-38kD-19kD重組融合蛋白的制備及純化 1.1基因融合 通過計算機分析TB冊7Rv基因組全序列，選擇其強抗原表位CFP10(GE肥BANK locus: NP_218391)、38kD蛋白化E肥BANK lo州s:服813240)和 19kEKGE肥BANK lo州s:CP007027)的 DM序列為模板，設計擴增引物為： CFP10擴增引物： CFP10-38-19a：GGAAGGCATATGGCAGAGATGAAGACCGATGCCGCT CFP10-38-19b:TTATTAGGATCCTCCGCCACCGAAGCCCATTTGCGA 38kD擴增引物： CFP10-38-19e：GCTGACGGATCCGTGAAAATTCGTTTGCATAC CFP10-38-19f：GTATTAGAATTCGCTGGAAATCGTCGCGATC 19kD擴增引物： CFP10-38-19c：AATAGAATTCGGAGGTGGCGGTAGTGTGAAGCGTGGACTGA CFP10-38-19d：GTCCGGAAGCTTTTAGGAACAGGTCACCTCGATTTCG 50 ml 擴增體系：d 地 2〇 31.5 miaOXbuffer 5.0 ml，4XdNTP 4.0 ml,上、下游引物 混液 4.0 ml，DNA 1.5 mljaqplus 0.2 ml(lU)。
[001引取結核分支桿菌出冰V的菌體，加100 ml蛋白酶K(10 mg/ml)，置56 °C水浴消化4 h，用常規酪/氯仿法純化，用上述引物進行PCR擴增。其中，CFP10上游引物增加 M/e I酶切位 點，下游增加姑I酶切位點；38kD上游引物增加姑I酶切位點，下游增加 I酶切位 點；19kD上游引物增加 I酶切位點，下游增加化'nc/ m酶切位點。
[0016] 將克隆片段進行修飾，產物經瓊脂糖凝膠電泳純化后切割，將含DNA條帶的膠塊按 DNA快速純化試劑盒(購自碧云天公司，產品名稱:PCR/DNA純化試劑盒)說明說明書進行操 作，回收DNA。質粒DNA和CFP10、38kD、19kD片段均經內切酶切，50 ml體系：10 X buf f er 5.0 ml，DNA 12 ml,化化/虹和M/e I各15 U，d地2〇補至50 ml;37 °C水浴6 11。50 ml酶切產物經 瓊脂糖凝膠電泳分離，切害化NA條帶瓊脂塊，利用DM快速純化試劑盒回收DM。
[0017] 將CFP10、38kD和19kD基因片段依次克隆至祀T28a質粒(具有化'nc/虹和M/e I酶切 位點，購自大連寶生物工程有限公司），即首先構建祀T28a-CFP10重組質粒，鑒定成功基礎 上繼續酶切與38kD片段連接，鑒定成功后，進一步酶切與19kD片段連接，酶切鑒定。20 ml連 接體系：(1地2〇 15.0 miaOXbuffer 2.0 ml,祀 T28a 2.0 ml,基因片段 1.0 ml，T4 DNA 連 接酶20 U。質粒自身連接對照，20 ml連接反應體系：d地2〇 16.0 ml, 10 X buffer 2.0 ml, pET28a 2.0 ml，T4 DNA連接酶20 U。按上述加樣后，混勻、稍離屯、，14 °C-16 °C連接過夜。 轉化E.coli涂平板(含有15微克/毫升卡那霉素的LB固體培養基)并挑克隆提質粒測序，確 定序列正確的克隆。重組質粒的酶切(M/e 1/化'nc/虹）電泳圖如附圖2所示。
[001引 1.2產物測序 采用T7 promoter:5-'TAATACGACTCACTATAGGG-3'和T7 terminator:5'- GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3 '通用引物。所有擴增引物和測序引物的合成W及重組質粒序列 pET28a-16kD-38kD-19kD的測定都由生工生物工程有限公司提供服務。測得目的融合基因 的核巧酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0019] 1.3目的蛋白的表達、純化 1.3.1 X-DNA的制備 X-DNA由四條末端反向互補的40 bp長的DNA分子經過一個特殊的退火程序形成。用于 合成X-DNA的寡核巧酸序列為： XI:5 '-p-CGACCGATGAATAGCGGTCAGATCCGTACCTACTCGGGCC-3, X2：5'-p-CGAGTAGGTACGGATCTGCGTATTGCGAACGACTCGGGCC-3' X3：5'-p-CGAGTCGTTCGCAATACGGCTGTACGTATGGTCTCGGGCC-3' X4：5'-p-CGAGACCATACGTACAGCACCGCTATTCATCGGTCGGGCC-3' 將根據序列合成的四條寡核巧酸分子等量混合(控制每條寡核巧酸分子的終濃度為 0.2 111]\0后置于口0?儀中。退火體系:95°(：變性2 111111，65°(：保持2 111111，60°(：保持5.5 111111， 之后每隔30 S將溫度調低1 °C，一直連續降至20 °CdX-DNA的核酸電泳圖如附圖3所示。
[0020] 1.3.2 DNA-水凝膠顆粒的制備 使用I酶將驗證正確克隆的重組質粒(pET28a-16kD-38kD-19kD)進行線性化，W用 于進行X-DNA的連接。
[0021 ]將Span 80與Tween 80兩種表面活性劑分別W4.5 %(wt/wt)W及0.5 %(wt/wt)的 比例添加到礦物油中，充分振蕩混勻。冰浴后取出1 ml置于玻璃小杯，加入一顆3 mmX8 mm 規格的磁力攬拌子，并將轉速控制為3000 rpm(最大轉速）。穩定后迅速將冰浴上配制好的 10 iil DNA凝膠反應混合液Wl:100的體積比加入，繼續攬拌1 min,使DNA凝膠反應液（水 相)均勻地分散在礦物油（油相）中，形成油包水乳液。油相中添加的表面活性劑能夠有效地 防止分散在油相中的DNA凝膠反應液的小液滴重新聚合，起到了穩定乳液的作用。將分散均 勻的乳液放置于16 °C解育過夜，分散在油相中的小液滴發生交聯反應，形成均勻的固體凝 膠微顆粒。
[0022] 10 DNA凝膠反應混合液體系:X-DNA stock solution 3.5山，線性質粒模板2 yl,Nuclease-free water 3 yl, 10 XT4 ligase buffer 1 yl ,T4 ligase(5 U/uDO.S y lo
[0023] 1.3.3 DM-水凝膠微顆粒的收集、純化 取分散在油相中合成的DNA-水凝膠樣品，W礦物油萃取殘留的表面活性劑，W正己燒 溶解殘余的礦物油。通風楓干燥15 min后，去離子水清洗，清除殘留的正己燒。
[0024] 1.3.4使用DNA-水凝膠無細胞蛋白表達體系進行融合蛋白表達 使用商業化無細胞反應液試劑盒（購自Roche公司，產品名稱：RTS 100反coJi肌 kit)進行融合蛋白的無細胞表達。將10 iil體積的DNA-水凝膠加入無細胞反應液中，反應體 系在Proteomaster中24 °C、900 rpm振蕩。于無細胞反應的不同時間取合成的蛋白進行檢 測，篩選最佳無細胞反應的最佳解育時間。
[0025] 1.3.5目的蛋白純化 對收集的蛋白用Ni柱(GE公司）進行純化，用如下溶液洗脫:300 mM咪挫，50 mM化is- 肥1，500 mM化CIdI化D、38kD和19kD融合基因表達蛋白共702個氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
[0026] 1.4融合蛋白鑒定 1.4.1純度測定 經505斗466電泳檢測(蛋白上樣量6 4旨），為單一區帶，薄層掃描鑒定純度為98.2%。檢 測結果見附圖4。
[0027] 1.4.2濃度測定 經BCA法測定，W牛血清白蛋白作為標準參比品，融合蛋白濃度為7.71 mg/ml。
[002引1.4.3活性測定 W純化的融合蛋白為抗原包被于酶標板上，包被量2 yg/孔，使用確診肺結核患者和健 康者的血清測定492 nm波長處0D值。結果如下：
實例2:結核分枝桿菌抗體IgG診斷試劑盒(斑點金免疫滲濾法)的制備及性能檢定 2.1試劑盒組成及制備 本發明試劑盒W純化的結核分枝桿菌CFP10-38kD-19kD重組融合蛋白作為TB抗原，將 其包被到硝酸纖維素膜上，作為檢測點，該抗原可捕獲血清標本中的IgG結核抗體，被捕獲 的結核抗體可W與葡萄球菌A蛋白（SPA)膠體金綴合物相結合呈現紅色斑點。反應孔中間無 紅色斑點，表示血清樣品中結核抗體陰性，質控點應出現紅色。
[0029] 試劑盒主要組成成分為免疫滲濾裝置，主要由塑料小盒、吸水墊料和硝酸纖維素 膜片=部分組成，硝酸纖維素膜上包含檢測區和質控區。
[0030] 2.1.1檢測點包被重組融合蛋白CFP10-38kD-19kD，包被濃度作1:2稀釋。
[0031] 2.1.2質控點包被羊抗鼠 IgG,包被濃度作1:16稀釋。
[0032] 2.1.3免疫滲濾反應體系優化 (1)反應膜最佳干燥條件的確定 置相對濕度梯度20 %、30 %、40 %，干燥時間30 min、40 min、50 min、60 min、70 min， 干燥溫度為37 °C，采用陽性血清進行檢測，確定最佳干燥濕度及干燥時間。
[0033] 表1反應膜干燥條件選擇實驗結果
-:陰性反應，+:陽性反應，++:較強陽性反應，+++:強陽性反應 由表1可W看出：相對濕度為20 %條件下，短時間干燥會導致試劑的穩定性差，過長時 間干燥又會影響檢測結果的準確性；而在相對濕度為30 %、40 %條件下，干燥時間為40 min、50 min、60 min和70 min時，試劑的敏感性和穩定性都較好，且檢測結果比較接近。考 慮到實驗過程的易操作性，因此選擇將反應膜在相對濕度為30 %-40 %的條件下干燥60 min。
[0034] (2)最佳抗原包被濃度及最適羊抗鼠 IgG工作濃度的確定 將包被抗原稀釋為1:1、1:2、1:4、1:8共四個濃度梯度，將羊抗鼠 IgG稀釋為1:4、1:8、1: 16、1:32四個濃度梯度，將待測陽性參考血清稀釋為1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、1:10共六個濃 度梯度，W包被抗原濃度、羊抗鼠 IgG濃度為變量，配合不稀釋的金標記SPA分別對六個梯度 的待測陽性參考血清開展棋盤滴定實驗，分析實驗結果，確定最適抗原包被濃度及羊抗鼠 IgG濃度。
[0035] 表2最佳抗原包被濃度及羊抗鼠 IgG工作濃度選擇實驗結果
+:陽性，+/-:弱陽性，-:陰性 由表2確定抗原作1:2稀釋進行包被，羊抗鼠 IgG作1:16稀釋后作為工作濃度使用。
[0036] (3)最適金標SPA濃度確定 將金標SPA稀釋為1:1、1:2、1:4、1:8、1:10五個濃度梯度，W其為變量，結合已確定的最 適抗原包被濃度和最佳羊抗鼠 IgG工作濃度，分別對六個梯度的待測陽性參考血清開展棋 盤滴定實驗，分析實驗結果，確定最適金標稀釋度。
[0037] 親罵活金;fcixSPA狄原說搖選輪結要
+:陽性，+/-:弱陽性，陰性 由表3可W看出，金標SPA作1:2稀釋為最適工作濃度。
[0038] (4)反應膜最佳封閉方式的選擇 將羊抗鼠 IgG點樣于硝酸纖維素膜中央作為檢測點，分四種不同方式進行封閉后開展 免疫滲濾試驗，觀察不同封閉方式對反應效果的影響。
[0039] ① W含1 % BSA的0.01 M TBST于室溫下置于圓周振蕩搖床上封閉4 h; ② W含5 %脫脂奶粉的0.01 M TBST于室溫下置于圓周振蕩搖床上封閉4 h; ③ W含1 % BSA的0.01 M TBST于4 °C條件下過夜封閉； ④ W含5 %脫脂奶粉的0.01 M TBST于4 °C條件下過夜封閉； ⑤ W含 1 % BSA的0.01 M TBST于37 °C下封閉45 min; ⑥W含5 %脫脂奶粉的0.01 M TBST于37 °C下封閉45 min。
[0040] 根據實驗結果得出：6組檢測點均顯色且能夠與背景有效區分，但相對于其它組 另IJ，④組中不僅背景低，且顯色更加均勻。因此選擇含5 %脫脂奶粉的0.01 M TBST作為封閉 液，封閉條件為4 °C下過夜封閉。
[0041] 2.1.4試劑盒的制造 (1)抗原的包被 取1山的抗原蛋白（1:2稀釋)點樣于1X1 cm2大小的硝酸纖維素膜中屯、偏左位置作為 檢測點，取1 iil的羊抗鼠 IgG(l: 16稀釋)點樣于硝酸纖維素膜中屯、偏右位置作為質控點，30 %-40 %的條件下干燥60 min。
[0042] (1)封閉 將點樣后的抗原膜浸于含有5 %脫脂奶粉的0.01 M TBST封閉液中，4 °C條件下靜置過 夜封閉。
[00創 （2)洗膜 棄去封閉液，用超純水快速洗膜一次，然后將膜浸于0.01 M TBS溶液中，轉移到圓周搖 床上，120巧m震蕩洗膜5 min,取出后自然驚干。
[0044] (3)組裝滲濾裝置 將吸水材料置于免疫滲濾卡中，最上層覆蓋濾紙，將抗原膜轉移到濾紙上，壓緊滲濾卡 蓋，使滲濾卡孔對準抗原膜中央，完成免疫滲濾裝置的組裝。成品試劑盒包括反應板、封閉 液、洗涂液、金標液、陽性對照和陰性對照。
[0045] 2.1.5操作方法及結果判定 (1)操作方法 ① 向檢測板的反應孔中間加3滴封閉液，待薄膜吸入； ② 取20山血清樣本，加入反應孔中間，待薄膜吸入； ③ 在反應孔中間加7滴洗涂液，待薄膜吸入； ④ 在反應孔中間加2滴金標液，待薄膜吸入； ⑤ 在反應孔中間加7滴洗涂液，待薄膜吸入，目測結果。
[0046] (2)結果判定 陽性-質控點顯示紅色，反應孔中間有紅色斑點出現； 陰性-質控點顯示紅色，反應孔中間無紅色斑點出現或僅痕跡。
[0047] 2.2試劑盒性能評價 2.2.1血清樣本檢測 應用實驗制備的試劑盒對臨床參比血清樣本進行檢測(60份），根據實驗結果判定此檢 測系統是否可行。檢測結果見表4。
[004引表4 60份血清樣本檢測結果
-:陰性反應，+:陽性反應，++:較強陽性反應，+++:強陽性反應。
[0049] 從實驗統計結果可W看出：陰性和陽性符合率均達100 %，因此我們認為采用運一 檢測系統是可行的。
[0050] 2.2.2皿V、肥V等抗體陽性血清交叉反應檢測 采用本發明試劑盒對皿V(乙型肝炎）、HCV(丙型肝炎）患者的血清進行檢測，從而進一 步評價試劑盒的特異性，檢測結果見表5。
[0化1] 表5皿V、HCV尊抗陽性血清的巧義反應槍測結果
從檢測結果看出：該試劑盒與上述患者血清均無交叉反應發生。
[0化2] 2.2.3同已經商品化的同類產品進行比較 取經商品化試劑盒檢測的陽性及陰性血清樣本30例，采用本試劑盒進行檢測，統計檢 測結果，計算試劑盒的靈敏度、特異度、假陽性率、假陰性率W及檢測符合率等，實驗結果見 表6。
[0053] 表6-1與廣州健侖生物科技有限公司試劑盒的比較測試結果
' 從表格可W看出，本發明試劑盒與參比品廣州健侖生物科技有限公司試劑盒的檢測符' 合率為96.7 %。
[0054] 表6-2與艾康生物技術(杭州)有限公司試劑盒的比較測試結果
從表格可w看出，本發明試劑盒與參比品上海奧普生物醫藥有限公司試劑盒的檢測符
【主權項】
1. 一種編碼結核分枝桿菌三聯重組融合蛋白CFP10-38kD-19kD的融合基因，其特征在 于:它的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。2. -種結核分枝桿菌三聯重組融合蛋白CFP10-38kD-19kD，其特征在于:它是由權利要 求1中的融合基因編碼，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。3. -種結核分枝桿菌三聯重組融合蛋白的表達載體，其特征在于:它是將權利要求1中 的融合基因按照圖1所示的構建方式連接到pET28a載體上，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所 不。4. 一種DNA-水凝膠無細胞蛋白表達系統，其特征在于：它是以由四條寡核苷酸序列退 火結合而成的X-DNA為骨架的水凝膠結構，其合成后驗證結果如圖3所示。5. -種結核分枝桿菌抗原斑點金免疫快速檢測試劑盒，含有滲濾測定裝置、點樣膜、標 記物和洗脫液，其特征在于:所述的點樣膜是點有結核分枝桿菌抗原(三聯重組融合蛋白） 的硝酸纖維素膜;所述的標記物為膠體金標記葡萄球菌A蛋白結合物;所述的洗脫液為pH 7.4的0.01 M TBS緩沖液;抗原和標記物之間采用血清中的連接抗體進行搭橋。6. 根據權利要求5所述的結核分枝桿菌抗原斑點金免疫快速檢測試劑盒，其特征在于： 抗原包被濃度作1: 2稀釋，膠體金標記葡萄球菌A蛋白工作濃度作1:2稀釋，質控點羊抗鼠 IgG包被濃度作1:16稀釋，反應膜的封閉條件為4 °C過夜封閉，反應膜的干燥條件為在相對 濕度為30 %_40 %的環境中干燥60 min。
【文檔編號】C07K19/00GK106047910SQ201510791218
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2015年11月17日
【發明人】馬曉蕾, 王興, 馮書陽
【申請人】沈陽萬類生物科技有限公司