一株特異性拮抗黃單胞菌的變棕溶桿菌oh21的分離鑒定的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物領域，具體涉及一株對植物病原黃單胞菌具有特異性拮抗活性 的生防細菌菌株的分離鑒定。 (二）
【背景技術】
[0002] 黃單胞菌是一類重要的植物病原細菌，能侵染400多種植物，包括許多重要的農 作物和經濟作物，如水稻、棉花、大豆、十字花科植物、柑橘、香蕉和木薯等。其中水稻白葉 枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae)、野油菜黃單胞菌（Xanthomonas campestris pathovars)和地毯草黃單胞菌（Xanthomonas axonopodis pathovars)在全球前十位最重 要的植物病原細菌中分別排在第四位、第五位和第六位。
[0003] 目前，生產上對黃單胞菌病害的防治主要依靠抗病品種和化學防治。化學防治所 用的農藥包括一些農用抗生素（如農用鏈霉素）、銅制劑（如絡氨銅、喹啉銅）和一些保護 性殺菌劑（如葉枯靈、葉枯凈）等。總體來說，防治黃單胞菌病害的農藥種類較少，而且這 些農藥有些使用受到限制，有些防治效果一般，因此，生產上迫切需要開發更多新型、高效、 安全的農藥品種。
[0004] 溶桿菌（Lysobacter spp.)屬于y-變形菌門，黃單胞科，溶桿菌屬。該細菌屬 的一些種能產生不同的小分子抗菌次生代謝物質，并具有高效抗菌活性和植物病害生防潛 力，是一類新型植物病害生防細菌。因此，分離鑒定對黃單胞菌具有特異性拮抗活性的溶桿 菌菌株，從中獲得其合成的特異性抗菌活性物質，可為新型農用抗生素的開發和黃單胞菌 病害的防治提供新的手斷和途徑。 (三）

【發明內容】

[0005] 本發明利用稀釋涂布的方法，以野油菜黃單胞菌野油菜致病變種作為靶標菌， 從植物根際土壤中篩選到一株對黃單胞菌具有特異性拮抗活性的菌株0H21，經形態學、 16SrDNA等方法鑒定為變棕溶桿菌（Lysobacter brunescens)。該菌對黃單胞菌具有特異 的拮抗活性。
[0006] 本發明提供的拮抗細菌0H21，已于2013年12月27日保藏在位于北京市朝陽區 北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研宄所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心（簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC No. 8650,分類命名為變棕溶桿菌Lysobacter brunescens〇 (四）
【附圖說明】
[0007] 圖10H21在不同培養基上的菌落形態
[0008] 圖20H21的電鏡觀察圖片（0H21在電鏡下菌體形態如圖2所示）
[0009] 圖30H21對黃單胞菌拮抗效果圖（0H21對病原細菌的拮抗活性測定如圖3所示）
[0010] 圖40H21的16S rDNA PCR電泳圖（0H21 16S rDNA序列PCR擴增的電泳圖如圖4 所示）
[0011] 圖50H21的系統發育樹 (五）【具體實施方式】
[0012] 以下通過具體實施對本發明作進一步闡述，但不限制本發明。
[0013] 1材料和方法
[0014] 1. 1試驗菌株、培養基
[0015] 試驗菌株：野油菜黃單胞菌野油菜致病變種（Xanthomonas campestris pv. campestris)、水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae)PX099A 菌株、水 稻細菌性條斑病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)RS105菌株、水稻白葉枯病菌 (Xanthomonas oryzae pv.oryzae)KACC菌株、地毯草黃單胞菌大豆致病變種（Xanthomonas axonopodis pv. glycines)、丁香假單胞菌大豆致病變種（Pseudomonas syringae pv. glycinea);嗜酸菌西瓜亞種（Acidovorax citrulli) ;丁香假單胞桿菌黃瓜角斑致病 變種（Pseudomonas syringae pv. lachrymans);梨火疫病菌（Erwinia amylovora);大腸桿 菌（E.coli)、抗生素溶桿菌（Lysobacter antibioticus)0H13(見專利 CN 103667136 A)〇
[0016] 培養基：
[0017] NA培養基：牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，Yeast extract lg，鹿糖10g，蒸餾水1L， pH7. 2,固體培養基分裝后另加瓊脂1. 5g/100mL。
[0018] 10% TSA :胰蛋白胨大豆肉湯培養基（Tryptic-Soytone-Broth-Medium)3g，蒸餾 水1L，分裝后另加瓊脂1. 88g/100mL。
[0019] TSA :胰蛋白胨大豆肉湯培養基（Tryptic-Soytone-Broth_Medium)30g，蒸餾水 1L，分裝后另加瓊脂1. 88g/100mL。
[0020] LB :Tryptone 10g，NaCl 10g，Yeast Extract 5g/L，加入水溶解，最后定容至 1L， 調節pH = 7. 0-7. 2,分裝后，LB固體培養基另加瓊脂粉1. 5g/100mL。
[0021] 1. 2根際土壤細菌的分離
[0022] 取作物根際土樣10份，將采集的土樣經2mm 土壤篩過篩，稱取10g于裝有90mL無 菌水的三角瓶中，搖床振蕩30min后10倍梯度稀釋5次。吸取稀釋液100 y 1于NA平板上 涂布，每個稀釋度重復涂布于3塊平板，28°C培養2天。稀釋度以每個平板上菌落數100-300 個為宜，挑取不同類型的菌落于NA平板進行純化，純化3次后-70°C保存。
[0023] 1. 3拮抗細菌對病原細菌拮抗活性的測定
[0024] 挑取單菌落在NA液體培養基中培養24_48h，獲得0D_= 1. 0的細菌菌液。取 50 y 1病原菌菌液，稀釋100倍后鋪于NA平板上，將多余菌液吸出，吹干待用。吸取3 y 1拮 抗細菌菌液（〇D_= 1.0)滴于鋪有病原菌的平板上，三次重復，以0H13菌株作對照。28°C 培養2-5d，觀察并拍照。
[0025] 1. 4拮抗細菌菌株的鑒定
[0026] 1. 4. 1菌落形態觀察與電鏡觀察
[0027]菌落形態：取0H21菌液3 y 1分別點于10% TSA、TSA、NA、LB培養基中央，28°C培 養2-4d，觀察形態。在NA培養基上，菌落由嫩黃色變為金黃色，最后變成棕褐色，表面平坦， 邊緣光滑；在10% TSA上，菌落金黃色，菌體表面凹陷，邊緣呈擴散狀；在100% TSA上，菌落 金黃色，邊緣不擴散；在LB上基本不生長。
[0028] 電鏡觀察：
[0029] (1)將OH21劃線于NA培養基（菌齡不能過大），在菌落生長新鮮處，用少量滅菌 水，沖洗菌落，并輕輕晃動培養皿，使滅菌水在新鮮菌落周圍反復沖洗，配制成菌懸液。
[0030] (2)在石蠟板上滴加1~2滴新鮮的PTA負染液。
[0031] (3)取新的銅網片吸附菌懸液，置于干凈的濾紙上晾干。
[0032] (4)待銅網片上的菌懸液七八成干時，將銅網片吸附菌懸液的一面接觸負染液，漂 浮染色15s (時間過長則染色顏色深）。
[0033] (5)從負染液中取出銅網片，用濾紙吸干多余的負染液，日光燈下烤45s，使其干 燥。
[0034] (6)將制作好的樣品，放置于透射電鏡日立H-650中，在80千伏下觀察細胞形態。
[0035] OH21呈現桿狀，無鞭毛。
[0036] 1. 4. 2 16S rDNA 鑒定
[0037] 利用TIANGEN細菌基因組DNA提取試劑盒提取OH21的DNA，作為16S rDNA擴 增的模板。應用Primer5. 0軟件設計引物，上游引物16S-F :AGAGITTGATCATGGCTCAG，下 游引物16S-R :ACGGTTACCTTGTTACGACTT，引物序列由英濰捷基（上海）貿易有限公司合 成，擴增條帶約 1500bp。PCR 反應體系（25yl) :10Xbuffer2.5yL;Mg2+(25mM)2yL; dNTP (1. 25mM) 2 y L ;正向引物（20pmol/ y L) 0? 5 y L ;反向引物（20pmol/ y L) 0? 5 y L ; 1'四118-了39聚合酶0.31^出0嫩（10叩/1^)0.51^;(1(111 2016.711匕？0?反應條件：95。預 變性5min，94°變性30s、55。退火30s、72。延伸lmin 30s、30個循環，72°后延伸8min。 PCR反應產物經1%瓊脂糖凝聚電泳檢測，與DL2000marker比較，片段大小正確，為目的片 段，見圖4。
[0038] 含有目的片段的PCR產物利用AXYGEN PCR clean up試劑盒進行純化回收，將純 化產物送往英濰捷基（上海）貿易有限公司測序，所得序列長度為1463bp。
[0039] 將所得序列與NCBI核酸數據庫進行同源性比對分析，結果顯示，與該菌株16S rDNA序列相近的菌株多為已知的Lysobacter brunescens菌株，基本無其他種屬菌株，表 明該種屬序列較為特殊，很少有其他種屬菌株與之相似。在這些Lysobacter brunescens 菌株中，Lysobacter brunescens KCTC 12130菌株與菌株0H21的16S rDNA序列相似性高 達99%。挑選部分相似性高的菌株與0H21菌株進行系統發育分析，用MEGA軟件中的鄰接 法（Neighbor-Joining)構建系統發育樹，見圖5,由圖可知0H21與Lysobacter brunescens 遺傳距離最近，根據同源性比對和系統發育分析結果表明，0H21為變棕溶桿菌。
[0040] 0H21 16S rDNA 序列，長度為 1463bp :
[0041]
[0042]
【主權項】
1. 一株對植物病原黃單胞菌具有特異性拮抗活性的生防細菌菌株，其特征在于該細菌 是變棕溶桿菌，保藏登記號為：CGMCC No. 8650,命名為Lysobacter brunescens 0H21〇
2. 權利要求1所述的細菌的應用，其特征在于對測試的野油菜黃單胞菌野油菜致病 變種（Xanthomonas campestris pv. campestris)、水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae)PX099A 菌株、水稻細菌性條斑病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola)RS 105菌株、水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae)KACC菌株、地毯草黃單胞菌 大豆致病變種（Xanthomonas axonopodis pv. glycines)等植物黃單胞菌具有較強的措抗 活性，而對測試的丁香假單胞菌大豆致病變種（Pseudomonas syringae pv.glycinea);嗜 酸菌西瓜亞種（Acidovoraxcitrulli) ;丁香假單胞桿菌黃瓜角斑致病變種（Pseudomonas syringae pv. lachrymans);梨火疫病菌（Erwinia amylovora);大腸桿菌（E. coli)沒有措 抗活性。
【專利摘要】本發明涉及一株對植物病原黃單胞菌具有特異性拮抗活性的生防細菌菌株OH21。該菌株的特征在于：所述菌株為變棕溶桿菌(Lysobacter brunescens)，屬于黃單胞科(Xanthomonadaceae)、溶桿菌屬(Lysobacter)，CGMCC No.8650。菌落形態：在不同培養基上呈現不同形態，在NA培養基上，菌落由嫩黃色變為金黃色，最后變成棕褐色，表面平坦，邊緣光滑；在10％TSA上，菌落金黃色，菌體表面凹陷，邊緣呈擴散狀；在100％TSA上，菌落金黃色，邊緣不擴散；在LB上基本不生長。生理特征：革蘭氏陰性，桿狀，無鞭毛；最適生長溫度：28℃。該菌株對植物病原黃單胞菌具有特異性拮抗活性。
【IPC分類】A01P1-00, C12N1-20, C12R1-01
【公開號】CN104651265
【申請號】CN201410814500
【發明人】劉鳳權, 錢國良, 胡逸群
【申請人】南京農業大學
【公開日】2015年5月27日
【申請日】2014年12月22日