一種結核分枝桿菌感染診斷試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明屬于生物醫學檢驗領域，涉及一種結核分枝桿菌感染診斷試劑盒。本發明提供的結核分枝桿菌感染診斷試劑盒包括如下組分：抗原刺激物、捕獲抗體預包被的ELISPOT板、胰島素樣生長因子、檢測抗體、辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素、3?氨基?9?乙基咔唑顯色液、抗體稀釋液和陽性對照刺激物；所述抗原刺激物選自SEQ ID NO.1～12所示序列中的一條或多條多肽。本發明提供的結核分枝桿菌感染診斷試劑盒靈敏性和特異性高，性質穩定，同時，應用本發明提供的結核分枝桿菌感染診斷試劑盒在體外檢測結核分枝桿菌感染時，可節省檢測時間，簡化檢測步驟，提高檢測效率。
【專利說明】
-種結核分枝桿菌感染診斷試劑盒
技術領域
[0001] 本發明屬于生物醫學檢驗領域，尤其設及一種結核分枝桿菌感染診斷試劑盒。
【背景技術】
[0002] 結核病是威脅人類健康的最主要的感染性疾病之一，而中國是全球22個結核病流 行嚴重的國家之一，結核病每年發病人數近130萬，占全球結核病發病人數的14.3%，位居 全球第二，僅次于印度。全國第五次結核病流行病學調查顯示，目前我國有活動性結核病患 者超過500萬名，超過5億人感染結核分枝桿菌，占全國總人口的45 %。在最近的10年傳染病 學統計中發現，結核病的死亡率僅次于艾滋病。
[0003] 結核病的臨床表現多樣，可累及全身各器官系統，病變往往十分隱匿，給結核病的 診斷及治療帶來了很大的障礙。因此，結核病的早期準確診斷及治療是結核病疫情控制的 關鍵措施之一。目前結核病已有的檢查方法包括結核分枝桿菌涂片抗酸染色、結核分枝桿 菌培養、組織病理學檢查、皮膚結核菌素試驗、結核抗體檢測和DNA分子檢測等。但結核分枝 桿菌涂片抗酸染色法的靈敏性和特異性差;結核分枝桿菌培養法檢查時間長，易延誤有效 診治;組織病理學檢查創傷大，適用范圍小;而DNA分子檢測法假陽性較高。目前篩查結核分 枝桿菌感染應用最廣泛的是結核菌素試驗，其操作簡便易行，成本低廉，但卡介苗(BCG)接 種及非結核分枝桿菌感染均可導致其產生假陽性，而處于各種免疫抑制狀態時可導致其產 生假陰性，使其特異性和靈敏性減低。因此，臨床上仍迫切地需要尋找一種用于快速準確診 斷結核分枝桿菌感染的方法。
[0004] 結核分枝桿菌感染的免疫反應主要是細胞介導免疫反應，T淋己細胞被結核分枝 桿菌抗原致敏后，當用相同的抗原再次刺激時，活化的效應T細胞會分泌大量細胞因子或趨 化因子，并具有抗原特異性，運些由T細胞分泌的細胞因子或趨化因子具有良好的結核分枝 桿菌感染診斷潛力。中國專利CN 101367867B公開了特異性檢測結核桿菌感染的多膚及試 劑盒，該專利發明人通過反復的研發與臨床實驗，通過將CFP-IO的多膚片段51-70上的第17 個氨基酸谷氨酷胺(Q)替換成谷氨酸化），獲得了一條既能保持結核桿菌免疫原性，又能消 除人類myosin 18A蛋白抗原交叉反應的多膚，并公開了該多膚的氨基酸序列，所述多膚用 于制備結核病化ISPOT診斷試劑盒進行結核桿菌感染性檢測時，假陽性率明顯下降，而真陽 性率維持不變。
[0005] 中國專利申請CN 104020297A公開了一種用于結核分枝桿菌感染檢測及臨床治療 效果檢測的試劑盒，包括特異性抗體IP-IO抗體和/或CD14抗體，抗原刺激物和陽性對照刺 激劑;所述抗原刺激物為該專利SEQ ID NO. 1-18所示序列中的一條或多條膚，并公開了SEQ 10側.1-18多膚的氨基酸序列，如：沈9 10側.1:]\0'699胖冊40 164445419。569 10側.10: 魁6]\0〇1)441'1^\9646冊61?。其中6451'-6抗原具體可^為沈9 10^.1-9所示序列中的一條或 多條膚，CFP-IO抗原具體可W為SEQ ID NO. 10-18所示序列中的一條或多條膚。該發明公開 的抗原刺激物和試劑盒可用于診斷活動性結核病人或結核潛伏感染者而不受接種BCG的影 響，靈敏性和特異性高。
[0006] 中國專利申請CN 104597239A公開了一種用于結核分枝桿菌感染檢測的抗原刺激 物、及含有該抗原刺激物的試劑盒，所述抗原刺激物包含該專利SEQ ID NO. 1-11所示序列 中的至少一種多膚或其類似物，并公開了SEQ ID NO. 1-11多膚的氨基酸序列，其中，SEQ ID NO. 1-3和SEQ ID NO.7-8來源于結核特異性抗原多膚EAST-6,如：SEQ ID NO. 1: 八61644454196^151;569 10^.4-6和沈9 10顯.9-11來源于結核特異性抗原多膚〔尸口- 10，如SEQ ID NO.5:GAAGTAAQAAVVRFQEAA;所述試劑盒包括抗原刺激物、捕獲抗體、檢測抗 體、辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素和3-氨基-9-乙基巧挫顯色底物。該發明公開的抗原 刺激物和試劑盒在結核診斷中具有很好的臨床適用性，且特異性好，靈敏度高。
[0007] 通過比較基因組學，可W得到結核桿菌基因在BCG中缺失的部分，稱為RD區，而結 核分枝桿菌特異性抗原CFP-IO和EAST-6的編碼基因位于RDl區，在BCG和絕大多數非結核分 枝桿菌的基因組中是缺失的，理論上能夠較好地區分真性結核感染和BCG接種誘導的反應。 針對運兩種特異性抗原篩選出具較強細胞免疫原性的抗原刺激物，應用酶聯免疫斑點 化LISP0T)技術對結核分枝桿菌感染進行診斷，可W在很大程度上提高結核分枝桿菌感染 的診斷效率，特異性和靈敏性。但現有的抗原刺激物和試劑盒，其特異性和靈敏性仍有待提 高，同時現有試劑盒整個檢測過程步驟繁瑣、檢測時間長，檢測效率也有待提高。因此，現有 技術中仍需要研究和開發一種特異性高、靈敏性高和檢測效率高的結核分枝桿菌感染診斷 試劑盒。

【發明內容】

[0008] 為解決現有技術中存在的問題，發明人通過生物信息學的分析結合體外檢測T細 胞免疫反應來分析和篩選結核分枝桿菌抗原特異性T細胞抗原表位，并進行了大量的試驗， 最終篩選得到12條具有高度靈敏性和特異性的抗原表位多膚，并W運12條抗原表位多膚為 抗原刺激物制備得到一種結核分枝桿菌感染診斷試劑盒。本發明提供的結核分枝桿菌感染 診斷試劑盒，可W有效地在體外檢測結核分枝桿菌感染，而不受接種BCG的影響，同時其具 有較高的靈敏性和特異性，檢測效率高，既適用于結核分枝桿菌感染臨床診斷也適用于大 規模人群的結核分枝桿菌感染篩查。
[0009] 為實現本發明的目的，本發明技術方案如下：
[0010] -種結核分枝桿菌感染診斷試劑盒，包括如下組分:抗原刺激物、捕獲抗體預包被 的化ISPOT板、膜島素樣生長因子、檢測抗體、辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素、3-氨基- 9-乙基巧挫顯色液、抗體稀釋液和陽性對照刺激物;所述抗原刺激物選自SEQ ID NO. 1~12 所示序列中的一條或多條多膚。
[OOW 優選地，所述抗原刺激物選自SEQ ID NO. 1多膚和SEQ ID NO. 9~12多膚的組合、 沈Q ID NO.4~6多膚的組合、SEQ ID NO.5~9多膚的組合、SEQ ID NO.9~12多膚的組合和 沈Q ID NO. 1~5多膚的組合中的一種。
[0012] 本發明所述的沈Q ID NO. 1~12序列如下：
[0013] SEQ ID NO.lAliJlGSQCWLHAI^LPS
[0014] SEQ ID N0.2ALA犯ACNF邸ISGDLKTQIDS
[0015] SEQ ID N0.3AGAAAGTAAQAAWRF犯AA
[0016] SEQ ID N0.4AAGIEAAASAIQGNVTSI
[0017] SEQ ID N0.5MMALEMKTDAATLA犯AGNF
[001 引 SEQ ID N0.6STGI沈AGQAMASTEGNVTGMFAS
[0019] 沈Q ID N0.7RVAVRFQEAANKQK犯LDEII
[0020] 沈Q ID N0.8QYQQGVQQKFFDATATELNNALQS
[0021] SEQ ID N0.9TMTEQQWNFAGIEAAASAIQG
[0022] SEQ ID NO.IOMAAEMKTDAATLA犯A
[0023] 沈Q ID NO.llYQGVQQKFFDATATELNNALQNL
[0024] SEQ ID N0.12TETSTNIRQAGVQYS
[0025] 其中，SEQ ID NO. I~3和沈Q ID NO.7~9為ESAT-6抗原表位多膚;SEQ ID NO.4~ 6和沈Q ID NO. 10~12為CFP-IO抗原表位多膚。
[0026] 本發明所述的多膚可W通過現有的化學合成法合成，也可W通過基因工程技術制 備得到，一種具有代表性的方法是通過固相多膚合成方法合成本發明所述抗原表位多膚。 運些技術都為本領域人員所通曉。
[0027] 本發明所提供的抗原刺激物能夠有效刺激結核分枝桿菌感染患者的T細胞分泌細 胞因子，從而能夠高靈敏性和高特異性地診斷結核分枝桿菌感染，并且不受BCG接種或者其 他基礎性疾病的影響。所述T細胞通常存在于宿主的外周血液中，也存在于肺泡灌洗液、胸 水、腦脊液、淋己結或其他包含T細胞的組織部位。
[00%]本發明膜島素樣生長因子優選膜島素生長因子-UIGF-I )。
[0029] 優選地，所述捕獲抗體為抗人IFN- 丫的單克隆抗體，所述檢測抗體為生物素標記 的抗人IFN-丫的抗體。
[0030] 優選地，所述捕獲抗體預包被的ELISPOT板的制備方法包括如下步驟，制備過程全 程需無菌操作：
[0031] SI:取底部披覆PDVF膜的化ISPOT板，每孔加15~20化體積分數為70%的乙醇室溫 解育0.5~Imin;每孔用10化L無菌的含0.05 %吐溫-20的PBS溶液洗涂2~3次，得經預處理 的化I SPOT板；
[0032] S2:用無菌PBS溶液將捕獲抗體配制成10~15iig/mL包被抗體溶液，每孔加10化L包 被抗體溶液到步驟Sl所述經預處理的ELISPOT板，4°C解育10~1化或室溫解育化；
[0033] S3 :棄包被抗體溶液，每孔用20化L無菌的含0.05 %吐溫-20的PBS溶液洗涂3~6 次，最后一次，在滅菌的吸水紙上扣干；
[0034] S4:每孔加入20化L封閉液4°C解育10~1化或室溫解育化或37°C解育化；棄封閉 液，用無菌的含0.05 %吐溫-20的PBS溶液洗涂1~2次，干燥，封板，4°C保存。
[0035] 其中，本發明所述的室溫為25±5。(：。
[0036] 優選地，所述步驟S4中，封閉液制備方法為:在無菌條件下，按0.02~0.05g/mL取 牛血清白蛋白加入含0.05%吐溫-20的細胞培養基，溶解后調節抑為7.2~7.4，先用0.6皿 的濾膜過濾，再用0.22WI1的濾膜過濾，即得。
[0037] 優選地，所述捕獲抗體預包被的化ISPOT板在使用前需要活化，具體方法為:每孔 加 200化無菌的含8~12yg/血膜島素樣生長因子和體積分數為8-10%的胎牛血清的細胞培 養基，室溫解育10~15min，傾倒。
[003引優選地，所述抗體稀釋液為含1 %牛血清白蛋白的PBS溶液。
[0039] 優選地，所述陽性對照刺激物選自葡萄球菌腸毒素 B、植物血凝素和國際標準多膚 池(EF中的一種。
[0040] 本發明診斷試劑盒的的檢測原理為:通過本發明提供的抗原刺激物，刺激T細胞， 如果T細胞在體內曾被來自結核分枝桿菌的抗原預先致敏，那么當其在體外或體內與抗原 刺激物接觸時，會被抗原刺激物激活，分泌大量細胞因子，如IFN- 丫、化-2或TNF-a等，通過 ELISPOT法檢巧m田胞分泌的細胞因子，可W確定T細胞能否識別所述抗原刺激物，從而間接 反映宿主是否感染過結核分枝桿菌。本發明優選檢測細胞因子IFN-T。本發明診斷試劑盒 使用穩定性良好的捕獲抗體預包被的化ISPOT板，檢測時經簡單的活化步驟即可加入抗原 刺激物和細胞進行檢測，不需要再進行預潤濕、洗涂、解抗、封閉等過程，使用方便，節省了 檢測時間，簡化了檢測步驟，提高了檢測效率;同時本發明試劑盒通過在檢測體系中加入膜 島素樣生長因子，增強了檢測的靈敏度和特異性，也提高了檢測效率。本發明抗原刺激物用 于檢測時，其添加濃度為0.1~10化g/mL，優選為1~lOiig/mL，與細胞共同解育的時間為9~ 12h，有效縮短了整個檢測過程所需要的時間，提高了檢測效率。
[0041] 與現有技術相比，本發明的有益效果在于：
[0042] 1)本發明提供的結核分枝桿菌感染診斷試劑盒可W有效的在體外檢測結核分枝 桿菌感染，而不受接種BCG的影響，靈敏性和特異性高，既適用于結核分枝桿菌感染臨床診 斷也適用于大規模人群的結核分枝桿菌感染篩查；
[0043] 2)應用本發明提供的結核分枝桿菌感染診斷試劑盒在體外檢測結核分枝桿菌感 染時，可節省檢測時間，簡化檢測步驟，提高檢測效率；
[0044] 3)本發明結核分枝桿菌診斷試劑盒性質穩定，存儲6個月和存儲12個月后用于結 核分枝桿菌感染檢測的陽性符合率與剛制備的試劑盒結果無異，特異性和靈敏性高，同時， 試劑盒的斑點顯色效果也于剛制備的試劑盒無異。
【具體實施方式】
[0045] W下通過【具體實施方式】的描述對本發明作進一步的詳細說明，但運并非是對本發 明的限制，本領域技術人員根據本發明的基本思想，可W做出各種修改或改進，但是只要不 脫離本發明的基本思想，均在本發明的范圍之內。
[0046] 本發明實施例中，所用材料、試劑等，如無特別說明，均可通過市場渠道購買，如有 未盡之處，可W參考相應的分子克隆和細胞生物學等實驗手冊。本發明所述實驗方法，如無 特別說明，均為常規方法。
[0047] 實施例1捕獲抗體預包被的化ISPOT板的制備
[004引Sl:取底部披覆PDVF膜的ELISPOT板，每孔加1祉L體積分數為70%的乙醇室溫解育 Imin;每孔用I(K)化無菌的含0.05%吐溫-20的PBS溶液洗涂3次，得經預處理的化ISPOT板； [0049] S2:用無菌PBS溶液將抗人IFN- 丫的單克隆抗體配制成15iig/mL包被抗體溶液，每 孔加10化L包被抗體溶液到步驟S1所述經預處理的化I SPOT板，4 °C解育1 Oh;
[0化0] S3:棄包被抗體溶液，每孔用20化L無菌的含0.05%吐溫-20的PBS溶液洗涂5次，最 后一次，在滅菌的吸水紙上扣干；
[0化1 ] S4:每孔加入20化L封閉液4r解育IOh;棄封閉液，用無菌的含0.05 %吐溫-20的 PBS溶液洗涂2次，干燥，封板，4 °C保存。
[0052] 其中，所述封閉液制備方法為:在無菌條件下，按0.05g/mL取牛血清白蛋白加入含 0.05%吐溫-20的細胞培養基，溶解后調節pH為7.4，先用0.6皿的濾膜過濾，再用0.22WI1的 濾膜過濾，即得。
[0053] 實施例2本發明結核分枝桿菌感染診斷試劑盒的使用方法
[0054] 本發明結核分枝桿菌診斷試劑盒包括如下組分:抗原刺激物、實施例1制備的人 IFN- 丫的單克隆抗體預包被的化ISPOT板、膜島素樣生長因子、生物素標記的抗人IFN- 丫的 抗體、辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素、3-氨基-9-乙基巧挫顯色液、抗體稀釋液和陽性 對照刺激物。
[0055] 其中，所述抗原刺激物選自SEQ ID NO.1~12所示序列中的一條或多條多膚;所述 抗體稀釋液為含1 %牛血清白蛋白的PBS溶液;所述陽性對照刺激物選自葡萄球菌腸毒素 B、 植物血凝素和國際標準多膚池 CEF中的一種。
[0056] 需另外準備的試劑包括胎牛血清、細胞培養基、DMSO和含0.05%吐溫-20的PBS溶 '濃等。
[0057] 使用方法包括如下步驟：
[0化引 1、取抗人IFN-丫的單克隆抗體預包被的ELISPOT板，按100化/well加入無菌的含8 ~12yg/mL膜島素樣生長因子和體積分數為8-10%的胎牛血清的細胞培養基，室溫解育10 ~15min，傾倒；
[0059] 2、將細胞重懸于含10%胎牛血清的細胞培養基，細胞計數，然后調整細胞懸液的 細胞密度為2.0-2.5 X IO7Ce 11 s/mL，實驗組、陽性對照組和陰性對照組按100化/Ve 11加入 細胞懸液，背景對照組按10化L/well加入含10%胎牛血清的細胞培養基；其中，每組可設3 ~5個實驗復孔；
[0060] 3、抗原刺激物用DMSO溶解，配置成IOmg/血的儲存液，使用前用細胞培養基稀釋至 1~1化g/血，按10化/Ve 11加入到實驗組各孔中；陽性對照組按10化/Ve 11加入陽性對照刺 激物，陽性對照刺激物濃度為2-20iig/mL陰性對照組按10化/Ve 11加入細胞培養基或用于 溶解多膚的DMSO;
[006。 4、加完所有的樣品后，蓋上板蓋，放入37°C，5%C02培養箱培養9-12小時;培養過 程應避免移動、碰撞化I SPOT板；
[0062] 5、取出ELI SPOT板，傾倒孔內的細胞和培養基；
[0063] 6、按20化L/wel 1加入含0.05 %吐溫-20的PBS溶液洗涂2-4次，每次30秒，最后一 次，在吸水紙上扣干；
[0064] 7、按10化L/well加入用抗體稀釋液按1:100稀釋好的檢測抗體，室溫解育2小時， 傾倒；
[00化]8、按20化L/wel 1加入含0.05 %吐溫-20的PBS溶液洗涂4-6次，每次30秒，最后一 次，在吸水紙上扣干；
[0066] 9、按10化L/well加入用抗體稀釋液按1:1000稀釋好的辣根過氧化物酶標記的鏈 霉親和素，室溫解育1小時，傾倒；
[0067] 10、按20化L/we 11加入含0.05 %吐溫-20的PBS溶液洗涂4-6次，每次30秒，最后一 次，在吸水紙上扣干；
[0068] 11、按10化L/well加入3-氨基-9-乙基巧挫顯色液，室溫避光靜置25min或37°C避 光靜置12-18min;
[0069] 12、待斑點生長到適合的大小之后，W去離子水洗涂2次，終止顯色反應；
[0070] 13、結果在化ISPOT讀板機上讀取;結果判定:斑點數>10個，且大于2倍陰性對照 組斑點數判斷為陽性結果;斑點數<10個，或小于2倍陰性對照組斑點數判斷為陰性結果。
[0071] 實施例3本發明結核分枝桿菌感染診斷試劑盒應用于結核分枝桿菌疑似患者的臨 床診斷
[0072] 1、試驗目的:檢驗本發明結核分枝桿菌感染診斷試劑盒在結核診斷中的臨床適用 性、特異性、靈敏性及與其他診斷技術的符合率。其中，所述試劑盒中，抗原刺激物為本發明 SEQ ID NO.5~9多膚的組合;所述陽性對照刺激物為植物血凝素。
[0073] 2、試驗方法:收集78名結核分枝桿菌高度疑似感染者的血液標本，每份2~5mL，用 Ficoll淋己細胞分離液分離外周血單核細胞(PBMC) ,PBMC經5~IOmL細胞培養基洗涂2次 后，重懸于含10%胎牛血清的細胞培養基，細胞計數，然后調整細胞懸液的細胞密度為2.5 X107cells/mL，備用。使用本發明提供的試劑盒按實施例2所述方法進行檢測。
[0074] 3、結果分析:78名疑似結核分枝桿菌感染患者中，根據結核分枝桿菌涂片抗酸染 色、結核分枝桿菌培養檢測結果和臨床癥狀確診為結核分枝桿菌感染的患者62名，運62名 患者中，經本發明結核分枝桿菌感染診斷試劑盒判斷為陽性結果的為60名，陽性符合率為 96.77%;根據結核分枝桿菌涂片抗酸染色、結核分枝桿菌培養檢測結果和臨床癥狀診斷為 陰性結果的16名患者中，經本發明結核分枝桿菌感染診斷試劑盒判斷全部為陰性結果，陰 性符合率為100%。試驗結果說明本發明結核分枝桿菌感染診斷試劑盒在結核診斷中具有 良好的臨床適用性，特異性和靈敏性高，與其他診斷技術的符合率高。
[0075] 實施例4本發明結核分枝桿菌感染診斷試劑盒在未知人群結核篩查中的適用性
[0076] 1、試驗目的:檢驗本發明結核分枝桿菌感染診斷試劑盒在未知人群結核篩查中的 適用性、特異性和靈敏性。
[0077] 2、試驗樣品：本發明實施例2結核分枝桿菌診斷試劑盒，其中，所述抗原刺激物為 本發明SEQ ID NO. 1~5多膚的組合;所述陽性對照刺激物為植物血凝素；
[0078] 對比試劑盒:抗原刺激物為專利CN 104597239A中SEQ ID NO.4~6多膚的組合，其 氨基酸序列為：569 10腸.4:]^6]\1訂044化4犯46^;569 10^.5:6446144944^1?。46八八； SEQ ID N0.6:WRFQEAANKQK犯LDEI;試劑盒其余成分同本發明結核分枝桿菌診斷試劑盒。
[0079] 3、試驗方法:收集95名HIV檢測陰性的志愿者的血液標本，其中，82名志愿者接種 過BCG;每份血液標本4~10血，用Ficoll淋己細胞分離液分離外周血單核細胞(PBMC) ,PBMC 經5~IOml細胞培養基洗涂2次后，重懸于含10 %胎牛血清的細胞培養基，細胞計數，然后調 整細胞懸液的細胞密度為2.5X107cells/mL，備用。每名志愿者的標本均分別用本發明結 核分枝桿菌感染診斷試劑盒W及對比試劑盒按實施例2所述方法進行檢測。
[0080] 4、結果分析:95名志愿者中，有2名志愿者經本發明結核分枝桿菌感染診斷試劑盒 判斷為陽性結果，其中運2名志愿者有1名未接種過BCG，1名接種過BCG，經進一步檢測，2名 志愿者均被確診為結核分枝桿菌感染。而2名結核分枝桿菌感染志愿者中，對比試劑盒只有 接種過BCG的志愿者的檢測結果為陽性結果，另外一名志愿者的檢測結果為陰性結果。試驗 結果說明本發明結核分枝桿菌感染診斷試劑盒可適用于大規模人群結核普查，靈敏性和特 異性高，且不受BCG接種或其他基礎性疾病等的影響。
[0081 ]實施例5本發明結核分枝桿菌感染診斷試劑盒穩定性試驗
[0082] 1、試驗樣品：
[0083] 試驗組:本發明實施例2結核分枝桿菌診斷試劑盒，其中，所述抗原刺激物為本發 明SEQ ID NO. 1多膚和SEQ ID NO.9~12多膚的組合;所述陽性對照刺激物為植物血凝素。
[0084] 對比例1:捕獲抗體預包被的化ISPOT板的制備過程中，封閉液為含0.05g/mL牛血 清白蛋白的PBS溶液，其余同試驗組；
[0085] 對比例2:捕獲抗體預包被的ELISPOT板的制備過程中，封閉液為含10%胎牛血清 的細胞培養基，其余同試驗組；
[0086] 對比例3:試劑盒不含膜島素樣生長因子，其余同試驗組。
[0087] 試劑盒的存儲條件為4°C。
[0088] 2、試驗方法:對20名確診為結核分枝桿菌感染患者的PBMC分別用剛制備（即0個 月）、存儲6個月和存儲12個月的試劑盒進行檢測，檢測方法參考實施例2，檢測結果見表1。
[0089] 表1本發明結核分枝桿菌診斷試劑盒用于結核分枝桿菌感染檢測的陽性符合率
[0091] ~由試驗結果可知，本發明結核分枝桿菌診斷試劑盒性質穩定，存儲6個月和存儲1之| 個月后用于結核分枝桿菌感染檢測的陽性符合率與剛制備的試劑盒結果無異，特異性高， 同時，試劑盒的斑點顯色效果也與剛制備的試劑盒無異。而對比例組的試劑盒存儲6個月和 存儲12個月后，斑點顯色效果較差，膜背景較差，用于結核分枝桿菌感染檢測的陽性符合率 均有所下降，穩定性不理想。
[0092] W上內容是結合具體的優選實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定 本發明的具體實施只局限于運些說明。對于本發明所屬技術領域的普通技術人員來說，在 不脫離本發明構思的前提下，還可W做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發明的 保護犯i圍。
【主權項】
1. 一種結核分枝桿菌感染診斷試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括如下組分:抗原刺 激物、捕獲抗體預包被的ELISPOT板、胰島素樣生長因子、檢測抗體、辣根過氧化物酶標記的 鏈霉親和素、3-氨基-9-乙基咔唑顯色液、抗體稀釋液和陽性對照刺激物;所述抗原刺激物 選自SEQ ID NO. 1~12所示序列中的一條或多條多肽。2. 根據權利要求1所述的結核分枝桿菌感染診斷試劑盒，其特征在于，所述抗原刺激物 選自SEQ ID NO. 1多肽和SEQ ID NO. 9~12多肽的組合、SEQ ID NO. 4~6多肽的組合、SEQ ID NO.5~9多肽的組合、SEQ ID NO.9~12多肽的組合和SEQ ID NO. 1~5多肽的組合中的 一種。3. 根據權利要求1所述的結核分枝桿菌感染診斷試劑盒，其特征在于，所述捕獲抗體為 抗人IFN-γ的單克隆抗體，所述檢測抗體為生物素標記的抗人IFN-γ的抗體。4. 根據權利要求1所述的結核分枝桿菌感染診斷試劑盒，其特征在于，所述捕獲抗體預 包被的ELISPOT板的制備方法包括如下步驟，制備過程全程需無菌操作： Sl:取底部披覆H)VF膜的ELISPOT板，每孔加15~20yL體積分數為70 %的乙醇室溫孵育 0.5~Imin;每孔用IOOyL無菌的含0.05 %吐溫-20的PBS溶液洗滌2~3次，得經預處理的 ELI SPOT板； S2:用無菌PBS溶液將捕獲抗體配制成10~15yg/mL包被抗體溶液，每孔加 IOOyL包被抗 體溶液到步驟S1所述經預處理的ELI SPOT板，4 °C孵育10~12h或室溫孵育2h; S3:棄包被抗體溶液，每孔用200yL無菌的含0.05 %吐溫-20的I3BS溶液洗滌3~6次，最 后一次，在滅菌的吸水紙上扣干； S4:每孔加入200yL封閉液4 °C孵育10~12h或室溫孵育2h或37 °C孵育Ih;棄封閉液，用 無菌的含0.05 %吐溫-20的PBS溶液洗滌1~2次，干燥，封板，4°C保存。5. 根據權利要求4所述的結核分枝桿菌感染診斷試劑盒，其特征在于，所述步驟S4中， 封閉液的制備方法為:在無菌條件下，按0.02~0.05g/mL取牛血清白蛋白加入含0.05 %吐 溫-20的細胞培養基，溶解后調節pH為7.2~7.4，先用0.6μπι的濾膜過濾，再用0.22μπι的濾膜 過濾，即得。6. 根據權利要求1所述的結核分枝桿菌感染診斷試劑盒，其特征在于，所述捕獲抗體預 包被的ELISPOT板在使用前需要活化，具體方法為:每孔加200yL無菌的含8~12yg/mL胰島 素樣生長因子和體積分數為8-10%的胎牛血清的細胞培養基，室溫孵育10~15min，傾倒。7. 根據權利要求1所述的結核分枝桿菌感染診斷試劑盒，其特征在于，所述抗體稀釋液 為含1 %牛血清白蛋白的PBS溶液。8. 根據權利要求1所述的結核分枝桿菌感染診斷試劑盒，其特征在于，所述陽性對照刺 激物選自葡萄球菌腸毒素 B、植物血凝素和國際標準多肽池 CEF中的一種。
【文檔編號】G01N33/577GK105954521SQ201610537305
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年7月8日
【發明人】陳立國
【申請人】廣州華弘生物科技有限公司