一種用于分枝桿菌快速檢測與分型的引物及方法
【專利摘要】本發明屬于微生物分子檢測領域，尤其涉及一種用于分枝桿菌快速檢測與分型的引物及方法。本發明提供的用于分枝桿菌快速檢測與分型的引物，包括7對分枝桿菌的特異性引物。本發明提供的用于分枝桿菌快速檢測與分型的引物不僅可以區分結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌，還可以進一步的區分結核分枝桿菌復合群中的各成員菌，具有特異性好、準確性高的優點，可以有效的輔助結核病的臨床診斷、指導臨床開展早期有效的化療。
【專利說明】
一種用于分枝桿菌快速檢測與分型的引物及方法
技術領域
[0001] 本發明屬于微生物分子檢測領域，尤其涉及一種用于分枝桿菌快速檢測與分型的 引物及方法。
【背景技術】
[0002] 目前，結核病仍然是嚴重的公共衛生問題，其在全世界范圍內出現不斷上升的趨 勢。結核分枝桿菌復合群(Mycobacterium tuberculosis complex，MTC)是引起人類結核病 的主要病原菌。MTC包括結核分枝桿菌（M. Tuberculosis)、非洲分枝桿菌（I型和II型） (M. AfricanumI型和II型）、牛分枝桿菌(M. Bovis)、卡介苗(M.bovis BCG)、田鼠分枝桿菌 (M.Microti)、山羊分枝桿菌(M.Caprae)以及肯尼迪分枝桿菌(M.Canettii)。
[0003] 在檢測分枝桿菌時，非結核分枝桿菌(Μ0ΤΤ)與結核分枝桿菌很難區分，但是結核 分枝桿菌與非結核分枝桿菌在治療上存在極大的差異，若對結核病患者盲目的用藥，容易 導致耐藥菌株的產生，加重病情。因此，在臨床上建立一種快速、準確的檢測結核與非結核 分枝桿菌菌種，同時還能進一步區分鑒定結核分枝桿菌復合群中各成員菌的方法，是有效 治療或控制結核病的重要提前。
[0004] 目前，檢測分枝桿菌的方法主要有：限制性片段長度多態性分析（IS6110-RFLP)、 間隔寡核苷酸分型技術(Spoligotyping)、可變數目的串聯重復序列(MIRU)、以及可變數目 串聯重復序列分型方法(VNTR)。IS6110-RFLP具有較高的分辨率和較好的重復性，但對于攜 帶1個或較少的IS6110拷貝數的菌株來說其鑒別能力較低；另外在一些非結核分枝桿菌菌 株中也發現有IS6110拷貝。Spoligotyping不需要大量DNA，可對分枝桿菌進一步分型到亞 種水平，但其分辨率低，成本較高，檢測效率與預期尚有差距。MIRU也不需要大量高質量的 DNA，試驗結果可以進行數字化編碼，便于各個實驗室之間結果的比較，VNTR分型重復性、敏 感性、特異性均為1 〇〇 %，但與MIRU和VNTR不同位點的多態性決定了該方法的分辨率，限制 了上述兩種方法的使用。
[0005] 為了解決上述問題，越來越多的分枝桿菌檢測方法應運而生。中國專利 CN102304575B公開了 一種快速鑒定結核分枝桿菌與非結核分枝桿菌的方法，具體涉及一種 用環介導等溫基因擴增技術(LAMP技術），其原理是根據結核分枝桿菌與非結核分枝桿菌 16SRNA的特異性設計4條特異性引物，進行PCR擴增，通過SYBRGreenI觀察顏色變化來判斷 結果。該鑒定方法具有方便快捷，靈敏度高，特異性高等優點，對于結核分枝桿菌或非結核 分枝桿菌感染的診斷與臨床用藥具有較高的參考價值，適于推廣應用。但是該鑒定方法只 能區分結核分枝桿菌與非結核分枝桿菌，不能進一步對結核分枝桿菌進行分型，不利于該 鑒定方法的推廣和應用。

【發明內容】

[0006] 為了解決現有技術中分枝桿菌檢測方法存在的檢測范圍窄、特異性不強的缺陷， 本發明的目的在于提供一種用于分枝桿菌快速檢測與分型的引物及方法，以解決上述問 題。
[0007] 本發明提供了一種用于分枝桿菌快速檢測與分型的引物，包括以下7對分枝桿菌 特異性引物：
[0008] MycoFl:5'-GGCAAGGTCACCCCGAAGGG-3'（SEQ ID N0.1)，
[0009] MycoRl:5'-AGCGGCTGCTGGGTGATCATC-3'（SEQ ID N0.2);
[0010] MycoF2:5'-TCGCGTGATCCTTCGAAACG-3'（SEQ ID N0.3)，
[0011] MycoR2:5'-GCCGTTGCGCTGATTGGACC-3'（SEQ ID N0.4);
[0012] MycoF3:5'-GACCTGACGCCGCTGACAC-3'（SEQ ID N0.5)，
[0013] MycoR3:5，-CACCTACACCGCTTCCTGCC-3，（SEQ ID N0.6);
[0014] MycoF4:5'-GACATGTACGAGAGACGGCATGAG-3'（SEQ ID N0.7)，
[0015] MycoR4:5'-AATCCAACACGCAGCAACCAG-3'（SEQ ID N0.8);
[0016] MycoF5:5，-AGGGATTCGGCGTTCGGGATTCCTG-3，（SEQ ID N0.9)，
[0017] MycoR5:5'-GATCGCGATCGCCAACGATTCAGTGTATG-3'（SEQ ID N0.10);
[0018] MycoF6:5'-GGGTCTGACGGCCAAACTC-3'（SEQ ID N0.11)，
[0019] MycoR6:5'-CTCGGTGGCCGGTTTTTC-3'（SEQ ID N0.12);
[0020] MycoF7:5，-CGATAGACCATGAGTCCGTCTC-3，（SEQ ID N0.13)，
[0021] MycoR7:5'-GTGGGCGGATGCCAGAATAG-3'（SEQ ID N0.14)。
[0022 ]進一步地，所述分枝桿菌特異引物的上游引物與下游引物的濃度比為1:1。
[0023] 另外，本發明還提供了一種用于分枝桿菌快速檢測與分型的方法，包括如下步驟：
[0024] S1應用細菌基因組DNA提取液提取待測標本中的細菌基因組DNA;
[0025] S2以待測標本中的細菌基因組DNA為模板，采用權利要求1所述的7對分枝桿菌特 異引物分別進行PCR擴增；
[0026] S3將所得的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳。
[0027] 進一步地，所述步驟S1中細菌基因組DNA提取液的配方為：Chelex 100 resin 5%;Tris-HCl 10mM，pH8.3;乙二胺四乙酸二鈉 O.lmM;疊氮鈉 0.1%;蛋白酶 K 100μg/ml。
[0028] 進一步地，所述步驟S2中的PCR擴增反應條件包括:階段1:95 °C 5min;階段2:95 °C lmin;階段 3:58 °C lmin;階段 4:72 °C lmin; 32 個循環;階段 5:72 °C 5min;在16 °C貯存。
[0029] 進一步地，所述步驟S2中分枝桿菌特異引物1擴增的序列為761bp，分枝桿菌特異 引物2擴增的序列為219bp，分枝桿菌特異引物3擴增的序列為531bp，分枝桿菌特異引物4擴 增的序列為l〇31bp，分枝桿菌特異引物5擴增的序列為666bp，分枝桿菌特異引物6擴增的序 列為991bp，分枝桿菌特異引物7擴增的序列為392bp。
[0030] 其中，所述引物對1擴增序列為761bp，具體序列如下：
[0031] ggcaaggtcaccccgaagggtgagaccgagctgacgccggaggagcggctgctgcgtgccatcttcggtgagaaggc ccgcgaggtgcgcgacacttcgctgaaggtgccgcacggcgaatccggcaaggtgatcggcattcgggtgttttccc gcgaggacgaggacgagttgccggccggtgtcaacgagctggtgcgtgtgtatgtggctcagaaacgcaagatctcc gacggtgacaagctggccggccggcacggcaacaagggcgtgatcggcaagatcctgccggttgaggacatgccgtt ccttgccgacggcaccccggtggacattattttgaacacccacggcgtgccgcgacggatgaacatcggccagattt tggagacccacctgggttggtgtgcccacagcggctggaaggtcgacgccgccaagggggttccggactgggccgcc aggctgcccgacgaactgctcgaggcgcagccgaacgccattgtgtcgacgccggtgttcgacggcgcccaggaggc cgagctgcagggcctgttgtcgtgcacgctgcccaaccgcgacggtgacgtgctggtcgacgccgacggcaaggcca tgctcttcgacgggcgcagcggcgagccgttcccgtacccggtcacggttggctacatgtacatcatgaagctgcac cacctggtggacgacaagatccacgcccgctccaccgggccgtactcgatgatcacccagcagccgct；
[0032] 所述引物對2擴增序列為219bp，具體序列如下：
[0033] cgctcatcgctgcgttcgcggtagcccgccccgcacagggcgtcggcttcagcccccatcaaggcggcgatgaacgt cgagagcagcccgcgcagcagatccgggctcgcctgtgcgagttggtcagccagaagctgctcggtgtcgataagat gagaagaggtcattgcgtcatttccttcgattgacttttgctggtcgtttcgaaggatcacgcga；
[0034] 所述引物對3擴增序列為531bp，具體序列如下：
[0035] gacctgacgccgctgacactgccgacgcccgcgcagttggcgttacgtcgatcggtgatccgacgtgccggcgcagt gattgacgcgaaccggtcctggcgtcggttgatgtcgttggcgcggtaggcgttccccgatgtgtggaccgcgttcg ccgggtcgttaccgaccgcgacagcggtgctggggcgttggcccgacatccgcttgctggccggcgcaccgacccgc cacgttgaccgccgtcatcgccgcgcacacccgcggtgtcgccgacaccccggcccggccgaggccatcaagaccgc cgcaaccggctgggccgcgttctgggacgggcacctcgacctggacgcactggccgtcgatgtcaccgagcatctca gcgacctcaccgacgaccgatgcgcgcgttggtgatgccggtgaccaagaaggtgttgatcttgggtgactagtcaa tggtggtggccagggtgagcagttcggggatctgcgagtcgatgcgccaggcaggaagcggtgtaggtg；
[0036] 所述引物對4擴增序列為1031bp，具體序列如下：
[0037] gacatgtacgagagacggcatgagcgcggaatgtgcgaccgtgccgtcgagatgaccgacgtcggcgctacggcagc ccccaccggacctatcgcgcggggcagcgtcgctcgggtcggcgcggcgaccgcgttggccgttgcctgcgtctaca cggtcatctatctggcggcccgcgacctacccccggcttgtttttcgatattcgcggtgttttggggggcgctcggc attgccaccggcgccacccacggcctcctgcaagaaacgacccgcgaggtccgctgggtgcgctccacccaaatagt tgcgggccatcgtacccatccgctgcgggtggccgggatgattggcaccgtcgcggccgtcgtaattgcgggtagct caccgctgtggagccgacagctattcgtcgaggggcgctggctgtccgtggggctactcagcgttggggtggccggg ttctgcgcgcaggcgaccctgctgggcgcgctggccggcgtcgaccggtggacacagtacgggtcactgatggtgac cgacgcggtcatccggttggcggtcgccgcggcagcggttgtgatcggatggggtctggccgggtacttgtgggccg ccaccgcgggagcggtggcgtggctgctcatgctgatggcctcgcccaccgcgcgcagcgcggccagcctgctgacg cccgggggaatcgccacgttcgtgcgcggtgccgctcattcgataaccgccgcgggtgccagcgcgattctggtaat gggtttcccagtgttgctcaaagtgacctccgaccagttaggggcaaagggcggagcggtcatcctggctgtgacct tgacgcgtgcgccgcttctggtcccactgagcgcgatgcaaggcaacctgatcgcgcatttcgtcgaccggcgcacc caacggcttcgggcgctgatcgcaccggcgctggtcgtcggcggcatcggtgcggtcgggatgttggccgcagggct taccggtccctggttgctgcgtgttggatt；
[0038] 所述引物對5擴增序列為666bp，具體序列如下：
[0039] agggattcggcgttcgggattcctgaagtcaagcggggtctggttgccggcggcgggggattgctgcggttgccgga gcgcatcccgtatgcgatagccatggagttggcgctgaccggtgacaacctaccggccgaacgcgcgcacgagctgg ggctcgtcaacgttttggccgagccggggaccgccctcgatgctgcgatcgcgttggcggagaagatcaccgccaat gggccgctggcggtggtggccaccaagcggattatcaccgagtcgcgtgggtggagtcccgacactatgttcgctga gcagatgaagatcctggtgccggtgttcacctccaacgacgcgaaggaaggtgcgatcgcgttcgccgagaggcgcc ggccccgttggacgggcacctagcccagctacgcgacggtgtagcccatcggcagcaggacactcttttgctgggtg aagtgttcgacaccctcgggcccgttctcgcggccgattccggagttcttgtagccgccgaagggtgagccgggatc gaaggcgtaccagttgattccgtatgtcccggtgcggatctgctgcgagatcttgatgcctttgggcacgtcggtgg tccacacgctgcccgccagcccatacactgaatcgttggcgatcgcgatc；
[0040] 所述引物對6擴增序列為991bp，具體序列如下：
[0041] gggtctgacggccaaacteatcatctggtacccgcactatgcctggctgttgttgagcgtctacctcacggtagccc tggttgcgctcgtggtggtcgggtcgatggctcacgtccggcgcgtttcaccggtcgtaaaacgaactctggaattg atcgacggcgccatgatcgctgccatcattcccatgctgctgtggatcaccggggtgtacgacacggtccgcaatat ccggttctgagccggatcggctgattggcggttcctgacagaacatcgaggacacggcgcaggtttgcataccttcg gcgcccgacaaattgctgcgattgagcgtgtggcgcgtccggtaaaatttgctcgatggggaacacgtataggagat ccggcaatggctgaaccgttggccgtcgatcccaccggcttgagcgcagcggccgcgaaattggccggcctcgtttt tccgcagcctccggcgccgatcgcggtcagcggaacggattcggtggtagcagcaatcaacgagaccatgccaagca tcgaatcgctggtcagtgacgggctgcccggcgtgaaagccgccctgactcgaacagcatccaacatgaacgcggcg gcggacgtctatgcgaagaccgatcagtcactgggaaccagtttgagccagtatgcattcggctcgtcgggcgaagg cctggctggcgtcgcctcggtcggtggtcagccaagtcaggctacccagctgctgagcacacccgtgtcacaggtca cgacccagctcggcgagacggccgctgagctggcaccccgtgttgttgcgacggtgccgcaactcgttcagctggct ccgcacgccgttcagatgtcgcaaaacgcatcccccatcgctcagacgatcagtcaaaccgcccaacaggccgccca gagcgcgcagggcggcagcggcccaatgcccgcacagcttgccagcgctgaaaaaccggccaccgag；
[0042] 所述引物對7擴增序列為392bp，具體序列如下：
[0043] cgatagaccatgagtccgtctccatcggccctgctcgccgaccacccggaccgcattcgttggaacgcgaaatacga gtgcgctgaccccacggaggcggtatttgcgcccatatcctggctcggcgacgtgctgcagttcggggtgccagaag ggccggttctggaactggcgtgcggtcggtccggcaccgcgctggggctagccgcggcgggccgctgcgtgactgcg atcgacgtttccgataccgcgttggttcagctcgagctcgaagcgacccgacgggaattggccgatcgcctcacact ggtgcacgccgatctctgctcctggcagtcgggggatggacgctttgctctggtactttgccgactattctggcatc cgcccac〇
[0044] 進一步地，所述分枝桿菌為結核分枝桿菌或非洲分枝桿菌II型、肯尼迪分枝桿菌、 非洲分枝桿菌I型、山羊分枝桿菌、牛型分枝桿菌、卡介苗、田鼠分枝桿菌和非結核分枝桿 菌。
[0045] 除此之外，本發明還提供了所述的用于分枝桿菌快速檢測與分型的引物在制備用 于檢測分枝桿菌試劑盒中的應用。
[0046] 本發明提供的用于分枝桿菌快速檢測與分型的方法:是利用不同類型的分枝桿菌 菌株含有不同的特異基因，或相同的基因，而這些相同的基因其片段在不同菌種間的變異 性，設計出針對不同類型菌株的7對特異性引物。將這7對特異性引物分別對待測菌株進行 PCR擴增，對各引物得到的對應的PCR擴增產物的有無及大小進行檢測，并最終判定待測標 本的菌種類別。
[0047]本發明提供的用于分枝桿菌快速檢測與分型方法的結果判定方法是:對PCR產物 的瓊脂糖凝膠電泳結果進行分析：
[0048] A)若標本中7對引物為陽性擴增結果，且引物1的PCR擴增產物出現大小為761bp的 片段，引物2的PCR擴增產物出現大小為219bp的片段，引物3的PCR擴增產物出現大小為 531bp的片段，引物4的PCR擴增產物出現大小為1031bp的片段，引物5的PCR擴增產物出現大 小為666bp的片段，引物6的PCR擴增產物出現大小為991bp的片段，引物7的PCR擴增產物出 現大小為3 9 2 b p的片段，則說明檢出了結核分枝桿菌復合群中的結核分枝桿菌 (M.Tuberculosis)或非洲分枝桿菌II型（M.africanum subtype II);
[0049 ] B)若標本中7對引物PCR擴增產物結果為：引物1 -6為陽性擴增結果，且引物1的PCR 擴增產物出現大小為761bp的片段，引物2的PCR擴增產物出現大小219bp的片段，引物3的 PCR擴增產物出現大小為531bp的片段，引物4的PCR擴增產物出現大小為1031bp的片段，弓丨 物5的PCR擴增產物出現大小為666bp的片段，引物6的PCR擴增產物出現大小為991bp的片 段;而引物7的PCR擴增產物不含有大小為392bp的片段，則說明檢出了結核分枝桿菌復合群 中的肯尼迪分枝桿菌(M.Canettii);
[0050] C)若標本中7對PCR擴增產物結果為：引物1-4和引物6、7為陽性擴增結果，且引物1 的PCR擴增產物出現大小為761bp的片段，引物2的PCR擴增產物出現大小為219bp的片段，弓丨 物3的PCR擴增產物出現大小為531bp的片段，引物4的PCR擴增產物出現大小為1031bp的片 段，引物6的PCR擴增產物出現大小為991bp的片段，引物7的PCR擴增產物出現大小為392bp 的片段;而引物5的PCR擴增產物不含有大小為666bp的片段，貝lj說明檢出了結核分枝桿菌復 合群中的非洲分枝桿菌I型(M.africanum subtype I);
[0051 ] D)若標本中的7對PCR擴增產物結果為：引物1-4和引物6為陽性擴增結果，且引物1 的PCR擴增產物出現大小為761bp的片段，引物2的PCR擴增產物出現大小為219bp的片段，弓丨 物3的PCR擴增產物出現大小為531bp的片段，引物4的PCR擴增產物出現大小為1031bp的片 段，引物6的PCR擴增產物出現大小為991bp的片段;而引物5的PCR擴增產物不含有大小為 666bp的片段，引物7的PCR擴增產物不含有大小為392bp的片段，則說明檢出了結核分枝桿 菌復合群中的山羊分枝桿菌(M. Caprae);
[0052] E)若標本中的7對PCR擴增產物結果為：引物1-3和引物6為陽性擴增結果，且引物1 的PCR擴增產物出現大小為761bp的片段，引物2的PCR擴增產物出現大小為219bp的片段，弓丨 物3的PCR擴增產物出現大小為531bp的片段，引物6的PCR擴增產物出現大小為991bp的片 段;而引物4的PCR擴增產物不含有大小為1031bp的片段，引物5的PCR擴增產物不含有大小 為666bp的片段，引物7的PCR擴增產物不含有大小為392bp的片段，則說明檢出了結核分枝 桿菌復合群中的牛型分枝桿菌(M.Bovis);
[0053] F)若標本中的7對PCR擴增產物結果為：引物1 -3為陽性擴增結果，且引物1的PCR擴 增產物出現大小為761bp的片段，引物2的PCR擴增產物出現大小為219bp的片段，引物3的 PCR擴增產物出現大小為531bp的片段;而引物4的PCR擴增產物不含有大小為1031bp的片 段，引物5的PCR擴增產物不含有大小為666bp的片段，引物6的PCR擴增產物不含有大小為 991bp的片段，引物7的PCR擴增產物不含有大小為392bp的片段，則說明檢出了結核分枝桿 菌復合群中的卡介苗(M.bovis BCG);
[0054] G)若標本中的7對PCR擴增產物結果為：引物1、引物2、引物4、引物6和引物7為陽性 擴增結果，即引物1的PCR擴增產物出現大小為761bp的片段，引物2的PCR擴增產物出現大小 為219bp的片段，引物4的PCR擴增產物出現大小為1031bp的片段，引物6的PCR擴增產物出現 大小為991bp的片段，引物7的PCR擴增產物出現大小為392bp的片段;而引物3的PCR擴增產 物不含有大小為531bp的片段，引物5的PCR擴增產物不含有大小為666bp的片段，則說明檢 出了結核分枝桿菌復合群中的田鼠分枝桿菌(M.Microti);
[0055] Η)若標本中的7對PCR擴增產物結果為:僅引物1為陽性擴增結果，且引物1的PCR擴 增產物出現大小為761bp的片段;而引物2的PCR擴增產物不含有大小為219bp的片段，引物3 的PCR擴增產物不含有大小為531bp的片段，引物4的PCR擴增產物不含有大小為1031bp的片 段，引物5的PCR擴增產物不含有大小為666bp的片段，引物6的PCR擴增產物不含有大小為 991bp的片段，引物7的PCR擴增產物不含有大小為392bp的片段，則說明檢出了非結核分枝 桿菌（M.Fortuitum) 〇
[0056] 本發明提供的用于分枝桿菌快速檢測與分型的引物不僅可以區分結核分枝桿菌 和非結核分枝桿菌，還可以進一步的區分結核分枝桿菌復合群中的各成員菌。將本發明提 供的7對引物采用相同的擴增反應條件，可一次性完成7個不同引物對的PCR反應，觀察凝膠 電泳結果即可快速鑒別結核與非結核分枝桿菌，以及結核分枝桿菌復合群各成員菌，具有 操作簡便快捷、特異性好和準確度高的優點，可以有效的輔助結核病的臨床診斷、指導臨床 開展早期有效的化療。
[0057] 與現有技術相比，本發明的有益效果是:本發明提供的用于分枝桿菌快速檢測與 分型的引物，可以區分結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌，同時還可以進一步的區分結核分 枝桿菌復合群中的各成員菌，具有特異性好和準確性高的優點，極大的提高了檢測效率。此 外，本發明還提供了用于分枝桿菌快速檢測與分型的方法，通過使用本發明提供的特異性 的引物，操作簡便快捷、特異性好，可以有效的輔助結核病的臨床診斷、指導臨床開展早期 有效的化療，是一種理想的分枝桿菌快速檢測與分型的方法。
【附圖說明】
[0058] 圖1為引物對1-7對結核分枝桿菌（M. Tuberculosis)或非洲分枝桿菌II型 (M.africanum subtype II)擴增結果圖；
[0059]圖2為引物對1-7對肯尼迪分枝桿菌(M.Canettii)擴增結果圖；
[0060] 圖3為引物對1-7對非洲分枝桿菌I型(M.africanum subtype I)擴增結果圖；
[0061 ]圖4為引物對1 -7對山羊分枝桿菌(M. Caprae)擴增結果圖；
[0062] 圖5為引物對1-7對牛型分枝桿菌(M.Bovis)擴增結果圖；
[0063] 圖6為引物對1-7對卡介苗(M.bovis BCG)擴增結果圖；
[0064]圖7為引物對1 -7對田鼠分枝桿菌(M. Mi crot i)擴增結果圖；
[0065]圖8為引物對1-7對非結核分枝桿菌(M.Fortuitum)的擴增結果圖。
【具體實施方式】
[0066]以上內容是結合具體的優選實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定 本發明的具體實施只局限于這些說明。對于本發明所屬技術領域的普通技術人員來說，在 不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發明的 保護范圍。其中，Chelex 100 resin購買自bio-rad公司（貨號：1432832)。
[0067]實施例1、引物
[0068] 本發明提供一種用于分枝桿菌快速檢測與分型的引物。
[0069] 表1本發明提供的引物
[0070]
[0071] 實施例2、引物的配對及其擴增片段大小
[0072] 本發明提供的分枝桿菌特異引物1擴增的序列為761bp，分枝桿菌特異引物2擴增 的序列為219bp，分枝桿菌特異引物3擴增的序列為531bp，分枝桿菌特異引物4擴增的序列 為103lbp，分枝桿菌特異引物5擴增的序列為666bp，分枝桿菌特異引物6擴增的序列為 991bp，分枝桿菌特異引物7擴增的序列為392bp。
[0073] 表2引物的配對及其擴增片段大小
[0074]
[0075] 其中，所述引物對1擴增序列為761bp，具體序列如下：
[0076] ggcaaggtcaccccgaagggtgagaccgagctgacgccggaggagcggctgctgcgtgccatcttcggtgagaaggc ccgcgaggtgcgcgacacttcgctgaaggtgccgcacggcgaatccggcaaggtgatcggcattcgggtgttttccc gcgaggacgaggacgagttgccggccggtgtcaacgagctggtgcgtgtgtatgtggctcagaaacgcaagatctcc gacggtgacaagctggccggccggcacggcaacaagggcgtgatcggcaagatcctgccggttgaggacatgccgtt ccttgccgacggcaccccggtggacattattttgaacacccacggcgtgccgcgacggatgaacatcggccagattt tggagacccacctgggttggtgtgcccacagcggctggaaggtcgacgccgccaagggggttccggactgggccgcc aggctgcccgacgaactgctcgaggcgcagccgaacgccattgtgtcgacgccggtgttcgacggcgcccaggaggc cgagctgcagggcctgttgtcgtgcacgctgcccaaccgcgacggtgacgtgctggtcgacgccgacggcaaggcca tgctcttcgacgggcgcagcggcgagccgttcccgtacccggtcacggttggctacatgtacatcatgaagctgcac cacctggtggacgacaagatccacgcccgctccaccgggccgtactcgatgatcacccagcagccgct；
[0077] 所述引物對2擴增序列為219bp，具體序列如下：
[0078] cgctcatcgctgcgttcgcggtagcccgccccgcacagggcgtcggcttcagcccccatcaaggcggcgatgaacgt cgagagcagcccgcgcagcagatccgggctcgcctgtgcgagttggtcagccagaagctgctcggtgtcgataagat gagaagaggtcattgcgtcatttccttcgattgacttttgctggtcgtttcgaaggatcacgcga；
[0079] 所述引物對3擴增序列為531bp，具體序列如下：
[0080] gacctgacgccgctgacactgccgacgcccgcgcagttggcgttacgtcgatcggtgatccgacgtgccggcgcagt gattgacgcgaaccggtcctggcgtcggttgatgtcgttggcgcggtaggcgttccccgatgtgtggaccgcgttcg ccgggtcgttaccgaccgcgacagcggtgctggggcgttggcccgacatccgcttgctggccggcgcaccgacccgc cacgttgaccgccgtcatcgccgcgcacacccgcggtgtcgccgacaccccggcccggccgaggccatcaagaccgc cgcaaccggctgggccgcgttctgggacgggcacctcgacctggacgcactggccgtcgatgtcaccgagcatctca gcgacctcaccgacgaccgatgcgcgcgttggtgatgccggtgaccaagaaggtgttgatcttgggtgactagtcaa tggtggtggccagggtgagcagttcggggatctgcgagtcgatgcgccaggcaggaagcggtgtaggtg；
[0081] 所述引物對4擴增序列為1031bp，具體序列如下：
[0082] gacatgtacgagagacggcatgagcgcggaatgtgcgaccgtgccgtcgagatgaccgacgtcggcgctacggcagc ccccaccggacctatcgcgcggggcagcgtcgctcgggtcggcgcggcgaccgcgttggccgttgcctgcgtctaca cggtcatctatctggcggcccgcgacctacccccggcttgtttttcgatattcgcggtgttttggggggcgctcggc attgccaccggcgccacccacggcctcctgcaagaaacgacccgcgaggtccgctgggtgcgctccacccaaatagt tgcgggccatcgtacccatccgctgcgggtggccgggatgattggcaccgtcgcggccgtcgtaattgcgggtagct caccgctgtggagccgacagctattcgtcgaggggcgctggctgtccgtggggctactcagcgttggggtggccggg ttctgcgcgcaggcgaccctgctgggcgcgctggccggcgtcgaccggtggacacagtacgggtcactgatggtgac cgacgcggtcatccggttggcggtcgccgcggcagcggttgtgatcggatggggtctggccgggtacttgtgggccg ccaccgcgggagcggtggcgtggctgctcatgctgatggcctcgcccaccgcgcgcagcgcggccagcctgctgacg cccgggggaatcgccacgttcgtgcgcggtgccgctcattcgataaccgccgcgggtgccagcgcgattctggtaat gggtttcccagtgttgctcaaagtgacctccgaccagttaggggcaaagggcggagcggtcatcctggctgtgacct tgacgcgtgcgccgcttctggtcccactgagcgcgatgcaaggcaacctgatcgcgcatttcgtcgaccggcgcacc caacggcttcgggcgctgatcgcaccggcgctggtcgtcggcggcatcggtgcggtcgggatgttggccgcagggct taccggtccctggttgctgcgtgttggatt；
[0083] 所述引物對5擴增序列為666bp，具體序列如下：
[0084] agggattcggcgttcgggattcctgaagtcaagcggggtctggttgccggcggcgggggattgctgcggttgccgga gcgcatcccgtatgcgatagccatggagttggcgctgaccggtgacaacctaccggccgaacgcgcgcacgagctgg ggctcgtcaacgttttggccgagccggggaccgccctcgatgctgcgatcgcgttggcggagaagatcaccgccaat gggccgctggcggtggtggccaccaagcggattatcaccgagtcgcgtgggtggagtcccgacactatgttcgctga gcagatgaagatcctggtgccggtgttcacctccaacgacgcgaaggaaggtgcgatcgcgttcgccgagaggcgcc ggccccgttggacgggcacctagcccagctacgcgacggtgtagcccatcggcagcaggacactcttttgctgggtg aagtgttcgacaccctcgggcccgttctcgcggccgattccggagttcttgtagccgccgaagggtgagccgggatc gaaggcgtaccagttgattccgtatgtcccggtgcggatctgctgcgagatcttgatgcctttgggcacgtcggtgg tccacacgctgcccgccagcccatacactgaatcgttggcgatcgcgatc；
[0085] 所述引物對6擴增序列為991bp，具體序列如下：
[0086] gggtctgacggccaaacteatcatctggtacccgcactatgcctggctgttgttgagcgtctacctcacggtagccc tggttgcgctcgtggtggtcgggtcgatggctcacgtccggcgcgtttcaccggtcgtaaaacgaactctggaattg atcgacggcgccatgatcgctgccatcattcccatgctgctgtggatcaccggggtgtacgacacggtccgcaatat ccggttctgagccggatcggctgattggcggttcctgacagaacatcgaggacacggcgcaggtttgcataccttcg gcgcccgacaaattgctgcgattgagcgtgtggcgcgtccggtaaaatttgctcgatggggaacacgtataggagat ccggcaatggctgaaccgttggccgtcgatcccaccggcttgagcgcagcggccgcgaaattggccggcctcgtttt tccgcagcctccggcgccgatcgcggtcagcggaacggattcggtggtagcagcaatcaacgagaccatgccaagca tcgaatcgctggtcagtgacgggctgcccggcgtgaaagccgccctgactcgaacagcatccaacatgaacgcggcg gcggacgtctatgcgaagaccgatcagtcactgggaaccagtttgagccagtatgcattcggctcgtcgggcgaagg cctggctggcgtcgcctcggtcggtggtcagccaagtcaggctacccagctgctgagcacacccgtgtcacaggtca cgacccagctcggcgagacggccgctgagctggcaccccgtgttgttgcgacggtgccgcaactcgttcagctggct ccgcacgccgttcagatgtcgcaaaacgcatcccccatcgctcagacgatcagtcaaaccgcccaacaggccgccca gagcgcgcagggcggcagcggcccaatgcccgcacagcttgccagcgctgaaaaaccggccaccgag；
[0087] 所述引物對7擴增序列為392bp，具體序列如下：
[0088] cgatagaccatgagtccgtctccatcggccctgctcgccgaccacccggaccgcattcgttggaacgcgaaatacga gtgcgctgaccccacggaggcggtatttgcgcccatatcctggctcggcgacgtgctgcagttcggggtgccagaag ggccggttctggaactggcgtgcggtcggtccggcaccgcgctggggctagccgcggcgggccgctgcgtgactgcg atcgacgtttccgataccgcgttggttcagctcgagctcgaagcgacccgacgggaattggccgatcgcctcacact ggtgcacgccgatctctgctcctggcagtcgggggatggacgctttgctctggtactttgccgactattctggcatc cgcccac〇
[0089]實施例3、一種用于分枝桿菌快速檢測與分型的方法
[0090] 1)應用細菌基因組DNA提取液提取待測標本中的細菌基因組DNA:選取標本進行預 處理，再使用細菌基因組DNA提取液提取細菌基因組DNA，其中，所述DNA提取液的成分如表3 所示：
[0091] 表3 DNA提取液的成分
[0092]
[0094] 2)以提取待測標本中的細菌基因組DNA為模板，采用實施例1中表1所述的7對引物 分別進行PCR擴增，所述的PCR反應混合液組分如表4所示：
[0095] 表4 PCR反應混合液組分
[0096]
[0097]其反應條件為：階段 1:95 °C 5min;階段 2:95 °C lmin;階段 3:58 °C lmin;階段 4:72 °C 111^11;32個循環;階段5:721€511^11 ;在16°(：貯存。
[0098] 3)將所得的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳。
[0099] 4)凝膠成像結果如表5所示。
[0100]表5 PCR瓊脂糖凝膠電泳圖譜
[0101]
[0102]
[0103] A)若標本中7對引物為陽性擴增結果，且引物1的PCR擴增產物出現大小為761bp的 片段，引物2的PCR擴增產物出現大小為219bp的片段，引物3的PCR擴增產物出現大小為 531bp的片段，引物4的PCR擴增產物出現大小為1031bp的片段，引物5的PCR擴增產物出現大 小為666bp的片段，引物6的PCR擴增產物出現大小為991bp的片段，引物7的PCR擴增產物出 現大小為3 9 2 b p的片段，則說明檢出了結核分枝桿菌復合群中的結核分枝桿菌 (M.Tuberculosis)或非洲分枝桿菌II型(M.africanum subtype II)，試驗結果如圖1所示； [0104] B)若標本中7對引物PCR擴增產物結果為：引物1 -6為陽性擴增結果，且引物1的PCR 擴增產物出現大小為761bp的片段，引物2的PCR擴增產物出現大小219bp的片段，引物3的 PCR擴增產物出現大小為531bp的片段，引物4的PCR擴增產物出現大小為1031bp的片段，弓丨 物5的PCR擴增產物出現大小為666bp的片段，引物6的PCR擴增產物出現大小為991bp的片 段;而引物7的PCR擴增產物不含有大小為392bp的片段，則說明檢出了結核分枝桿菌復合群 中的肯尼迪分枝桿菌(M. Canettii)，試驗結果如圖2所示；
[0105] C)若標本中7對PCR擴增產物結果為：引物1-4和引物6、7為陽性擴增結果，且引物1 的PCR擴增產物出現大小為761bp的片段，引物2的PCR擴增產物出現大小為219bp的片段，弓丨 物3的PCR擴增產物出現大小為531bp的片段，引物4的PCR擴增產物出現大小為1031bp的片 段，引物6的PCR擴增產物出現大小為991bp的片段，引物7的PCR擴增產物出現大小為392bp 的片段;而引物5的PCR擴增產物不含有大小為666bp的片段，貝lj說明檢出了結核分枝桿菌復 合群中的非洲分枝桿菌I型(M.africanum subtype I)，試驗結果如圖3所示；
[0106] D)若標本中的7對PCR擴增產物結果為：引物1-4和引物6為陽性擴增結果，且引物1 的PCR擴增產物出現大小為761bp的片段，引物2的PCR擴增產物出現大小為219bp的片段，弓丨 物3的PCR擴增產物出現大小為531bp的片段，引物4的PCR擴增產物出現大小為1031bp的片 段，引物6的PCR擴增產物出現大小為991bp的片段;而引物5的PCR擴增產物不含有大小為 666bp的片段，引物7的PCR擴增產物不含有大小為392bp的片段，則說明檢出了結核分枝桿 菌復合群中的山羊分枝桿菌(M.Caprae)，試驗結果如圖4所示；
[0107] E)若標本中的7對PCR擴增產物結果為：引物1-3和引物6為陽性擴增結果，且引物1 的PCR擴增產物出現大小為761bp的片段，引物2的PCR擴增產物出現大小為219bp的片段，弓丨 物3的PCR擴增產物出現大小為531bp的片段，引物6的PCR擴增產物出現大小為991bp的片 段;而引物4的PCR擴增產物不含有大小為1031bp的片段，引物5的PCR擴增產物不含有大小 為666bp的片段，引物7的PCR擴增產物不含有大小為392bp的片段，則說明檢出了結核分枝 桿菌復合群中的牛型分枝桿菌(M.Bovis)，試驗結果如圖5所示；
[0108] F)若標本中的7對PCR擴增產物結果為：引物1 -3為陽性擴增結果，且引物1的PCR擴 增產物出現大小為761bp的片段，引物2的PCR擴增產物出現大小為219bp的片段，引物3的 PCR擴增產物出現大小為531bp的片段;而引物4的PCR擴增產物不含有大小為1031bp的片 段，引物5的PCR擴增產物不含有大小為666bp的片段，引物6的PCR擴增產物不含有大小為 991bp的片段，引物7的PCR擴增產物不含有大小為392bp的片段，則說明檢出了結核分枝桿 菌復合群中的卡介苗(M.bovis BCG)，試驗結果如圖6所示；
[0109] G)若標本中的7對PCR擴增產物結果為：引物1、引物2、引物4、引物6和引物7為陽性 擴增結果，即引物1的PCR擴增產物出現大小為761bp的片段，引物2的PCR擴增產物出現大小 為219bp的片段，引物4的PCR擴增產物出現大小為1031bp的片段，引物6的PCR擴增產物出現 大小為991bp的片段，引物7的PCR擴增產物出現大小為392bp的片段;而引物3的PCR擴增產 物不含有大小為531bp的片段，引物5的PCR擴增產物不含有大小為666bp的片段，則說明檢 出了結核分枝桿菌復合群中的田鼠分枝桿菌(M.Microti)，試驗結果如圖7所示；
[0110] H)若標本中的7對PCR擴增產物結果為:僅引物1為陽性擴增結果，且引物1的PCR擴 增產物出現大小為761bp的片段;而引物2的PCR擴增產物不含有大小為219bp的片段，引物3 的PCR擴增產物不含有大小為531bp的片段，引物4的PCR擴增產物不含有大小為1031bp的片 段，引物5的PCR擴增產物不含有大小為666bp的片段，引物6的PCR擴增產物不含有大小為 991bp的片段，引物7的PCR擴增產物不含有大小為392bp的片段，則說明檢出了非結核分枝 桿菌(M.Fortuitum)，試驗結果如圖8所示。 與現有技術相比，本發明的有益效果是:本發明提供的用于分枝桿菌快速檢測與 分型的引物，可以區分結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌，同時還可以進一步的區分結核分 枝桿菌復合群中的各成員菌，具有特異性好和準確性高的優點，極大的提高了檢測效率。此 外，本發明還提供了用于分枝桿菌快速檢測與分型的方法，通過使用本發明提供的特異性 的引物，操作簡便快捷、特異性好，可以有效的輔助結核病的臨床診斷、指導臨床開展早期 有效的化療，是一種理想的分枝桿菌快速檢測與分型的方法。
【主權項】
1. 一種用于分枝桿菌快速檢測與分型的引物，其特征在于，包括以下7對分枝桿菌特異 性引物： MycoFl:5 '-GGCAAGGTCACCCCGAAGGG-3 '， MycoRl:5 '-AGCGGCTGCTGGGTGATCATC-3 '； MycoF2:5 '-TCGCGTGATCCTTCGAAACG-3 '， MycoR2:5 '-GCCGTTGCGCTGATTGGACC-3 '； MycoF3:5 '-GACCTGACGCCGCTGACAC-3 '， MycoR3:5 '-CACCTACACCGCTTCCTGCC-3 '； MycoF4:5 '-GACATGTACGAGAGACGGCATGAG-3 '， MycoR4:5 '-AATCCAACACGCAGCAACCAG-3 '； MycoF5:5 '-AGGGATTCGGCGTTCGGGATTCCTG-3 '， MycoR5:5 '-GATCGCGATCGCCAACGATTCAGTGTATG-3 '； MycoF6:5 '-GGGTCTGACGGCCAAACTC-3 '， MycoR6:5 '-CTCGGTGGCCGGTTTTTC-3 '； MycoF7:5 '-CGATAGACCATGAGTCCGTCTC-3 '， MycoR7:5 '-GTGGGCGGATGCCAGAATAG-3 '。2. 如權利要求1所述的用于分枝桿菌快速檢測與分型的引物，其特征在于，所述分枝桿 菌特異引物的上游引物與下游引物的濃度比為1:1。3. -種用于分枝桿菌快速檢測與分型的方法，其特征在于，包括如下步驟： S1應用細菌基因組DNA提取液提取待測標本中的細菌基因組DNA; S2以待測標本中的細菌基因組DNA為模板，采用權利要求1所述的7對分枝桿菌特異引 物分別進行PCR擴增； S3將所得的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳。4. 如權利要求3所述的用于分枝桿菌快速檢測與分型的方法，其特征在于，所述步驟Sl 中細菌基因組DNA提取液的配方為：Chelex IOOresin 5% ;Tris-HCl 10mM，pH8.3;乙二胺 四乙酸二鈉0 · ImM;疊氮鈉0 · 1 % ;蛋白酶K 100μg/ml。5. 如權利要求3所述的用于分枝桿菌快速檢測與分型的方法，其特征在于，所述步驟S2 中的PCR擴增反應條件包括:階段1:95 °C5min;階段2:95°C Imin;階段3:58 °C Imin;階段4:72 °C Imin; 32 個循環;階段 5:72°C 5min;在16°C貯存。6. 如權利要求3所述的用于分枝桿菌快速檢測與分型的方法，其特征在于，所述步驟S2 中分枝桿菌特異引物1擴增的序列為76 Ibp，分枝桿菌特異引物2擴增的序列為219bp，分枝 桿菌特異引物3擴增的序列為531bp，分枝桿菌特異引物4擴增的序列為1031bp，分枝桿菌特 異引物5擴增的序列為666bp，分枝桿菌特異引物6擴增的序列為991bp，分枝桿菌特異引物7 擴增的序列為392bp。7. 如權利要求3所述的用于分枝桿菌快速檢測與分型的方法，其特征在于，所述分枝桿 菌為結核分枝桿菌或非洲分枝桿菌II型、肯尼迪分枝桿菌、非洲分枝桿菌I型、山羊分枝桿 菌、牛型分枝桿菌、卡介苗、田鼠分枝桿菌和非結核分枝桿菌。8. 如權利要求1所述的用于分枝桿菌快速檢測與分型的引物在制備用于檢測分枝桿菌 試劑盒中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK105907861SQ201610292154
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月5日
【發明人】嚴慧, 朱慶義, 范曉姍, 胡朝暉, 梁耀銘
【申請人】廣州金域醫學檢驗中心有限公司