結核分枝桿菌RpsL突變基因及其用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種結核分枝桿菌RpsL突變基因及其用途，以及用于檢測導致結核 分枝桿菌鏈霉素耐藥基因 RpsL上游調控區突變-6C>T的試劑盒，屬于結核病耐藥基因突變 檢測技術領域。
【背景技術】
[0002] 結核病是由結核分枝桿菌引起的人畜共患病。對人類而言，結核分枝桿菌主要感 染青壯年人群，病程長，嚴重影響患者的正常生活和工作，對社會和家庭也帶來極大危害。 近年，隨著耐藥結核桿菌株的出現，結核感染者數量呈增多趨勢，結核病的發病率和死亡率 均有所上升，特別是多耐藥、耐多藥和廣泛耐藥結核患者的出現，更是給治療帶來極大困 難。超過半數的臨床治療結核花費用于5-20%的耐藥結核患者，因此，對耐藥結核分枝桿菌 耐藥機制的研究亟待解決。目前臨床抗結核一線用藥主要為異煙肼、利福平、吡嗪酰胺和乙 胺丁醇。此外，鏈霉素也作為抗結核聯合用藥常用在臨床治療中。
[0003] 鏈霉素是氨基糖苷類抗生素，是治療結核病的常用臨床藥物。鏈霉素不可逆的結 合核糖體蛋白S12和16S rRNA，影響mRNA轉錄的起始，抑制蛋白質的合成。耐鏈霉素的主 要基因為rpsL基因。rpsL基因編碼核糖體蛋白S12,易發生錯義突變，常見的突變為43位 的賴氨酸突變為精氨酸和88位的賴氨酸突變為谷氨酸。Pelchovich等在結核菌耐鏈霉素 研究中，檢測到rpsL基因的新突變91位的脯氨酸突變為組氨酸，該突變不僅導致鏈霉素耐 藥的發生，還會使其它以核糖體為靶標的抗生素如慶大霉素耐藥性增強。我們的研究中，發 現了一個新的突變位點，該突變位于rpsL基因上游6位堿基由C突變為T，該突變可能導致 rpsL基因的轉錄和翻譯受到影響。
[0004] 由于各種耐藥結核患者的出現及其數量的增多，對耐藥結核分枝桿菌致病機制的 深入研究也越來越迫切。大量篩查耐藥基因突變，豐富其突變譜，不僅為耐藥結核菌試劑盒 的研發奠定基礎，也為該類患者用藥方針的調整提供依據。鏈霉素是臨床常用抗結核藥物 之一，也是常規聯合用藥之一，因此對結核桿菌耐鏈霉素 RpsL基因的突變熱點區進行基因 檢測，將有利于臨床快速診斷和治療。
[0005] 經文獻檢索，未見與本發明檢測突變位點相同的公開報道。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的在于提供一種檢測結核分枝桿菌RpsL突變基因的方法，該結核分 枝桿菌RpsL突變基因具有-6C>T突變位點，其核苷酸序列如SEQ ID N0 :3所示。
[0007] 本發明另一目的是提供用于檢測結核分枝桿菌rpoB突變基因的試劑盒，該試劑 盒包括用于檢測結核分枝桿菌RpsL基因-6C>T突變的試劑。
[0008] 本發明通過檢測來自耐鏈霉素結核菌株的樣本中是否存在RpsL基因的-6C>T突 變，從而判斷該患者耐鏈霉素藥物的耐藥分子機制，其中-6C>T突變位點為RpsL基因的突 變，該突變導致RpsL基因編碼區上游第六位堿基發生變化，這個突變影響了 RpsL基因基因 的表達，從而發揮其抗鏈霉素的作用，進而使該菌株產生耐藥。
[0009] 發明人用候選基因篩查的方法，在中國23株耐鏈霉素結核菌株中進行檢測，在一 株耐藥結核菌種發現與耐鏈霉素相關的RpsL基因新突變-6C>T ;該突變的頻率為4. 3%，這 說明在耐鏈霉素的結核菌株中，RpsL基因突變-6C>T具有一定的發生頻率，因此RpsL基因 突變-6C>T可以作為臨床鏈霉素耐藥菌株耐藥分子機制的診斷依據；并且目前，在國際和 國內均未見該突變的報道。
[0010] 本發明用于檢測RpsL基因突變-6C>T的試劑盒，包括用于檢測RpsL基因的突 變-6C>T所需的試劑和能選用的用于擴增RpsL基因的試劑和PCR引物。
[0011] 用于檢測RpsL基因突變-6C>T的試劑盒，包括以下一種或幾種試劑的組合： (1) 從待檢樣品中提取DNA的試劑； (2) 用于擴增結核菌樣本DNA的RpsL基因 -6C>T突變的PCR引物和相關的PCR反應試 劑； (3) PCR產物純化試劑； (4) 對PCR產物進行直接測序的試劑。
[0012] 用于檢測RpsL基因突變-6C>T的試劑盒，所用的PCR引物為： RpsL-F :5' -ATGAGACGAATCGAGTTTGAGG-3， RpsL-R :5' -GATCGGTGCCGGTCTTGTCG-3' 用于檢測RpsL基因突變-6C>T的試劑盒，所述檢測PCR擴增產物的試劑選自測序檢測 試劑、限制性內切酶長度多態性檢測試劑、序列特異性引物檢測試劑、探針雜交檢測試劑及 SNP分型檢測試劑。
[0013] 采用PCR擴增-直接測序的方法來檢測樣本的突變情況，具體操作步驟如下： (1) 采集待測個體的樣本，為培養的結核菌樣本，提取全基因組DNA ; (2) 以提取的DNA為模板，以本發明設計的針對RpsL基因-6C>T突變的引物進行突變 區段DNA序列的擴增，得到相應的PCR擴增產物； (3) 將得到的PCR產物純化后，進行直接測序分析，將所測得的序列與RpsL基因的正常 序列進行比對，確定-6C>T突變是否存在； (4) 根據以上實驗結果分析患者是否為RpsL基因突變-6C>T導致的耐鏈霉素結核分枝 桿菌菌株。
[0014] 發明人在收集耐藥結核分枝桿菌進行實驗的過程中，收集到23株耐鏈霉素的結 核菌株，在取得患者同意的前提下，對患者感染的結核分枝桿菌進行基因檢測。同時，我們 還收集了患者的基本信息和臨床信息，詳細詢問了其感染和發病過程，建立了結核分枝桿 菌耐藥株的樣本庫。將滅活的結核分枝桿菌凍存于-80°C冰箱。用柱吸附的方法提取結核 菌的基因組DNA，保存于-40°C冰箱，每份DNA樣本具有對應的患者資料和耐藥信息。用引 物設計軟件Primer5和01ig〇6設計PCR擴增引物，包括了結核菌RpsL基因編碼區上游113 位堿基到編碼區下游171位堿基的DNA片段，用于PCR擴增。PCR擴增產物直接用PCR引物 進行正反向測序(測序所用儀器為ABI公司3730型DNA測序儀)。將得到的序列與GenBank 中的序列進行比對，確定RpsL基因突變-6C>T的存在。
[0015] RpsL基因 -6C>T突變的核苷酸和氨基酸序列如下： GCATGGCCGACAAACAGAAC GTGAAAGCGCCCAAGA.TAGA AAGC0GGTAGATGC CAACC A ; TCCAGCAGCTGGTCCGCAAG GGTCGT CGGGACAAGATCAG RpsL基因-6C>T突變的核苷酸和氨基酸序列中，用方框標出的是突變的堿基。該突變 位于RpsL基因編碼序列前的第6位堿基，由野生型的胞嘧啶（C)變為胸腺嘧啶（T)，該突變 使RpsL蛋基因上游的調控序列發生變化，導致RpsL蛋白的轉錄和翻譯發生改變，進而引起 鏈霉素的耐藥。RpsL基因突變-6C>T的檢測能夠用遺傳領域的任意一種點突變檢測方法進 行，如PCR (聚合酶鏈反應）-RFLP法(限制性內切酶片段多態性)、PCR-測序法、DNA探針雜 交法、位點特異性PCR法、PCR-dHPLC (變性高效液相色譜)、及PCR-SSCP (單鏈構象多態性） 法。
[0016] 上述方法中得到的PCR產物還能用其他方法進行檢測，如DNA雜交探針法。所用 探針能是與突變RpsL基因核苷酸序列雜交，也可以有兩個探針分別與正常或突變的RpsL 基因核苷酸序列雜交。探針能夠選擇同位素標記、有色物質標記或熒光物質標記。此外，還 能夠