一種結核分枝桿菌KatG耐藥突變位點檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種結核分枝桿菌KatG耐藥突變位點檢測試劑盒，特別設及一種結 核分枝桿菌KatG耐藥突變位點檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002] 結核病是一種嚴重危害人類健康的慢性呼吸道傳染病，其病原體是結核分枝桿 菌，是人類所知的最古老的一種傳染病。結核分枝桿菌（妳coAacteriiw MTB)的耐藥性問題已成為新世紀結核病控制的難題之一。隨著抗結核藥物的廣泛使用，W及結核分枝桿菌染色體的突變，導致結核耐藥問題日益嚴重。
[0003] 異煙阱（Isoniazid, INH)是結核化療方案中的一線藥物之一，可通過氧依賴途徑 抑制結核分枝桿菌胞壁酸的合成，從而起到殺菌作用。目前已發現結核分枝桿菌對異煙阱 耐藥設及多個基因變化：katG, inM, kasA, n化，及OxyR-址pC基因連接區。而研究證 明，katG突變導致的結核分枝桿菌觸酶-過氧化物酶活性降低或缺失可W解釋90% W上的 INH耐藥。最普遍的katG突變是發生在第315位密碼子，而其它位點密碼子突變造成INH 耐藥也有陸續報道。因此，建立方便快捷經濟的katG突變檢測方法，對實現早期迅速對結 核患者的結核分枝桿菌異煙阱耐藥鑒定非常重要。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的在于提供一種檢測結核分枝桿菌新型KatG耐藥突變位點的試劑 盒。
[0005] 通過與結核分枝桿菌標準株H37RV序列（NC_000962. 3)的比對，發明人從臨床分 離的耐異煙阱結核分枝桿菌katG基因中發現了未報道的2個突變位點：294GGG和296ATC。 同時，該耐藥株katG基因有且僅有此2個突變位點。通過克隆質粒及MIC值測定證實katG 基因294GGG，296ATC，590AGG，690GCC位點的突變可W導致顯著異煙阱耐藥。其中590AGG， 690GCC位點突變的發生是在質粒克隆過程中自發發生的，經過生物信息學分析，運兩個位 點突變也未有研究報道。針對運4種突變位點，發明人研發結核分枝桿菌katG耐藥突變位 點檢測試劑盒，如PCR-巧光探針法，為耐異煙阱結核患者的早期診斷提供分子檢測基礎。
[0006] 本發明的有益效果是： 本發明的結核分枝桿菌KatG耐藥突變位點檢測試劑盒，為耐異煙阱結核患者的早期 診斷提供分子檢測基礎。有利于對結核患者進行個性化治療，達到更好的治療效果。
【具體實施方式】
[0007] 下面結合實驗，進一步說明本發明的技術方案。
[0008] 結核分枝桿菌的藥敏實驗 參照結核分枝桿菌藥敏實驗標準比例法。從培養平板或者培養管中挑選適量的菌體移 到磨菌器底部，攬動均勻成為乳酪狀，W 0.5%Tween80生理鹽水溶解后，將菌懸液與標準 麥氏比濁管比濁，即配成Img/ml的菌懸液。靜置片刻，使菌液中的顆粒或菌塊沉淀后，將 其依舊用0.5%Tween80生理鹽水倍比稀釋，稀釋為兩種濃度，分別為：10-2mg/ml，10-4mg/ ml的菌懸液。將上述兩個濃度的菌懸液0.1ml接種于含藥及對照培養基斜面或表面。接 種時，使菌液盡可能均勻分散于培養基表面。37 °C培養，4-6周觀察結果。計算耐藥百分 比。耐藥百分比=含藥培養基上生長菌落數/對照培養基生長菌落數*1〇〇%，〉1%者為耐藥， <1 %為敏感。本實驗所使用的抗結核藥物及濃度為：異煙阱，0.2yg/mL;利福平，40yg/ 血；鏈霉素，4Jig/mL;乙胺下醇，2Jig/血。
[000引質粒構建 質粒載體為pMV306整合質粒（pMV361的衍生質粒)。pMV306克隆質粒電轉入恥垢分 枝桿菌（MS)后，不能自主復制。根據位點特異性重組原理，PMV306克隆質粒會被整合入的 恥垢分枝桿菌基因組中，外源基因從而被高效表達，可用卡那霉素平板來篩選重組子。本實 驗通過基因克隆方法，把臨床耐異煙阱結核分枝桿菌必姑M35的katG基因W及katG野生 型基因分別克隆在PMV306載體上。所使用的酶切位點為：HindIII和化nl。
[0010] 質粒電轉 分別把pMV306-iW7 M35 katG和pMV306-katG Wt質粒電轉入恥垢分枝桿菌(非條件致 病菌，能夠進行高頻率的外源性DNA轉化)，用含異煙阱8y g/mL及卡那霉素40 y g/mL的抗 性平板篩選電轉子，得到克隆菌株。
[0011] MIC實驗 分別表達必姑M35 katG基因W及katG野生型基因的克隆菌株，用7H9液體培養基過 夜培養，制備成1mg/ml菌懸液。菌懸液稀釋10倍后取10iiL菌液，加入含不同異煙阱藥 物濃度梯度的7H9液體培養基中。37°C培養4周，肉眼觀察菌液是否渾濁，判斷MIC值。本 實驗所用異煙阱藥物濃度梯度為：〇, 1，2,4,8,16, 32,64,128, 256, 512yg/mL。
[001引 PCR-巧光探針法 PCR-巧光探針法是在PCR基礎上加入一種與祀基因序列互補的巧光雙標記的寡核巧 酸探針，探針的5'端標記巧光報告基團，3'端標記巧光澤滅基團。利用化q DNA聚合酶和 根據祀序列設計的特異性引物、探針，特異識別祀序列區域，在化q DNA聚合酶的作用下，能 將已跟祀序列互補配對的探針酶切降解，使報告基團和澤滅基團分離，從而產生巧光信號， 進而對SNPs進行很好的區分，并通過巧光擴增曲線客觀判斷突變類型的存在。
[0013] 實驗結果 臨床耐異煙阱結核分枝桿菌必M35耐藥表型
臨床耐異煙阱結核分枝桿菌必姑M35 katG基因測序

[001引 INH的MIC值測定
KatG結核分枝桿菌KatG耐藥突變位點檢測試劑盒 在確定上述突變位點之后，通過現有技術即可制備得到其檢測試劑盒。如PCR-巧 光探針試劑盒，該試劑盒中主要原材料有：TaqDNA聚合酶、引物、Taqman-MGB探針、 lOXbuffer、dNTPs、MgClz、甜菜堿、DMS0、陰性對照和陽性對照等。試劑盒中陽性對照來源 于人工構建的含祀序列片段的大腸桿菌工程菌DNA，無感染活性，無潛在的生物安全危險。 陰性對照為超純水。
[0017] 也可W采用其他公開的SNP檢測方法原理，設計出對應的檢測試劑盒。
【主權項】
1. 一種結核分枝桿菌KatG耐藥突變位點檢測試劑盒，其特征在于：其包括可以檢測出 KatG294GGG，296ATC，590AGG，690GCC4 個點突變中至少一個試劑。2. 根據權利要求1所述的KatG結核分枝桿菌KatG耐藥突變位點檢測試劑盒，其特征 在于：其包括可以檢測出KatG294GGG，296ATC兩個點突變位點的試劑。3. 根據權利要求1所述的KatG結核分枝桿菌KatG耐藥突變位點檢測試劑盒，其特征 在于：其包括可以檢測出KatG294GGG，296ATC，590AGG，690GCC4個點突變的試劑。4. 根據權利要求1所述的KatG結核分枝桿菌KatG耐藥突變位點檢測試劑盒，其特征 在于：可以檢測出KatG294GGG，296ATC，590AGG，690GCC4個點突變的試劑相互獨立。5. 根據權利要求1所述的KatG結核分枝桿菌KatG耐藥突變位點檢測試劑盒，其特征 在于：可以檢測出KatG294GGG，296ATC，590AGG，690GCC4個點突變試劑為PCR-熒光探針。
【專利摘要】本發明公開了一種結核分枝桿菌KatG耐藥突變位點檢測試劑盒。通過與結核分枝桿菌標準株H37Rv序列（NC_000962.3）的比對，發明人從臨床分離的耐異煙肼結核分枝桿菌katG基因中發現了未報道的2個突變位點：294GGG和296ATC。同時，該耐藥株katG基因有且僅有此2個突變位點。通過克隆質粒及MIC值測定證實katG基因294GGG，296ATC，590AGG，690GCC位點的突變可以導致顯著異煙肼耐藥。其中590AGG，690GCC位點突變的發生是在質粒克隆過程中自發發生的，經過生物信息學分析，這兩個位點突變也未有研究報道。針對這4種突變位點，發明人研發結核分枝桿菌katG耐藥突變位點檢測試劑盒，如PCR-熒光探針法，為耐異煙肼結核患者的早期診斷提供分子檢測基礎。
【IPC分類】C12Q1/04, C12Q1/68, C12R1/32
【公開號】CN105219860
【申請號】CN201510678805
【發明人】田國寶, 黃曦, 鐘蘭蘭
【申請人】中山大學
【公開日】2016年1月6日
【申請日】2015年10月20日