杏仁蛋白特異性序列及基于其的快速鑒定二聯檢測卡的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及食品檢測，具體涉及現場快速鑒定食品中的扁桃仁蛋白和杏仁蛋白。
【背景技術】
[0002] 在上世紀70年代美國扁桃仁出口到我國時，被誤譯成"美國大杏仁"，并廣泛傳 播，這使得大多數消費者根本不知道扁桃仁、杏仁是兩種完全不同的產品，造成了長期的誤 導。很多消費者都認為美國大杏仁就是產自美國的大杏仁，甚至因為美國大杏仁圓潤飽滿 顆粒大而中國杏仁相對扁平顆粒小，從而認為美國大杏仁比中國杏仁質量好。中國杏仁行 業遭遇不公平競爭，由興轉衰。
[0003] "美國大杏仁"也就是扁桃仁和中國產杏仁分別為扁桃（Primus armeniaca)和杏 (Prunus amygdalus dulcis)的果實，兩者均屬于李屬（Prunus sp.)植物。
[0004] 美國大杏仁具有豐富的營養物質，如維生素 E和類黃酮植物化合物等抗氧化劑， 能防止細胞受到氧化損傷，預防心臟病、中風和慢性疾病的發生；含有豐富的維生素 E，這 種營養素對保持皮膚健康非常重要；膽固醇含量低，含不飽和脂肪酸，可以降低體內膽固醇 水平，不會導致肥胖和高脂血癥；有膳食纖維豐富，減低脂肪的消化和吸收，緩解便秘；含 有鐵、鎂、鋅、磷等微量元素，補充人體的營養素。相比較來說，美國大杏仁更多是作為食物 應用。
[0005] 中國杏仁分為兩種，藥用多用苦杏仁（俗稱北杏仁），它性微溫，味苦，可降氣平喘 止咳，潤腸通便，但略微有毒性，不可多服；食用多用甜杏仁（俗稱南杏仁）。甜杏仁是一種 健康食品，適量食用不僅可以有效控制人體內膽固醇的含量，還能顯著降低心臟病和多種 慢性病的發病危險。素食者食用甜杏仁可以及時補充蛋白質、微量元素和維生素，例如鐵、 鋅及維生素 E。甜杏仁中所含的脂肪是健康人士所必需的，是一種對心臟有益的高不飽和脂 肪。研宄發現，每天吃50?100克杏仁（大約40?80粒杏仁），體重不會增加。甜杏仁中 不僅蛋白質含量高，其中的大量纖維可以讓人減少饑餓感，這就對保持體重有益。纖維有益 腸道組織并且可降低腸癌發病率、膽固醇含量和心臟病的危險。所以，肥胖者選擇甜杏仁作 為零食，可以達到控制體重的效果。最近的科學研宄還表明，甜杏仁能促進皮膚微循環，使 皮膚紅潤光澤，具有美容的功效。
[0006] 扁桃仁和杏仁（甜杏仁）均為受消費者喜愛的核果，被加工成植物蛋白飲料或作 為蛋糕、面包、餅干以及巧克力等食品的輔料。由于其外觀，口感非常相近，導致通過感官較 難分辨。然而兩者之間存在價格差，標簽上對原料的錯誤標準，所以目前市場上對兩種產品 的標示比較混亂，暫時沒有快速便捷的方法來鑒定杏仁蛋白和扁桃仁蛋白。

【發明內容】

[0007] 本發明的一個目的在于提供一種杏仁蛋白特異性氨基酸序列。
[0008] 本發明的另一個目的在于提供一種杏仁蛋白特異性抗體。
[0009] 本發明的再一個目的在于一種鑒定杏仁蛋白和扁桃仁蛋白二聯快速檢測卡。
[0010] 本發明所采取的技術方案是： 一種杏仁蛋白的特異性氨基酸序列，其氨基酸序列是：RQQRQQPFGRPG(SEQ ID ΝΟ:1)。
[0011] -種杏仁蛋白特異性抗體，由杏仁蛋白特異性抗原直接或間接誘導產生。
[0012] 進一步的，杏仁蛋白特異性抗體為單克隆抗體。
[0013] 一種鑒定杏仁蛋白和扁桃仁蛋白二聯快速檢測卡，所述快速檢測卡中含有扁桃仁 蛋白特異性抗體和杏仁蛋白特異性抗體，其中杏仁蛋白特異性抗體如前所述。
[0014] 進一步的，所述快速檢測卡為膠體金快速檢測卡。
[0015] 本發明的有益效果是： 發明人通過自行測序，首次確定了杏仁蛋白prunin-Ι的全序列，并從中選擇了杏仁蛋 白的特異性氨基酸序列，其氨基酸序列是：RQQRQQPFGRPG(SEQ ID ΝΟ:1)。該序列具有很好 的免疫原性，可以誘導出效價很好的杏仁蛋白特異性抗體。
[0016] 通過對比序列，確定了杏仁蛋白prunin-Ι與扁桃仁蛋白prunin-Ι之間的異同，為 制備鑒定杏仁蛋白和扁桃仁蛋白的檢測試劑提供了條件。
[0017] 本發明的二聯快速檢測卡，能快速檢測分辨出扁桃仁蛋白和杏仁蛋白，特異性高， 準確性尚，彌補了市場上的空白。
【附圖說明】
[0018] 圖1為杏仁蛋白和扁桃仁蛋白 >聯檢測卡結構不意圖； 圖2為杏仁蛋白和扁桃仁蛋白二聯檢測卡結果判斷示意圖。
【具體實施方式】
[0019] 以下結合具體實驗操作，對本發明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0020] 抗原多肽的選取： 根據自行測得的杏仁蛋白prunin-Ι序列進行Blast比對，綜合特異性，抗原性分析，選 擇杏仁蛋白prunin-Ι的特異性氨基酸序列RQQRQQPFGRPG(SEQ ID NO :1)作為杏仁蛋白特 異性抗原多肽； 根據NCBI扁桃仁prunin-Ι的蛋白序列進行Blast比對，綜合特異性，抗原性分析，選 擇多肽RQGRQQGRQQQEEGR(SEQ ID NO :2)作為扁桃仁蛋白特異性抗原多肽； 根據NCBI杏仁prunin-l的蛋白序列進行Blast比對，綜合特異性，抗原性分析，選 擇多肽AFVFSLCLLLVFNGCL(SEQ ID N0:3)作為同時識別杏仁和扁桃仁prunin-Ι蛋白的 AFVFSLCLLLVFNGCL 氨基酸序列。
[0021] 免疫原的制備： 分別將上述3個多肽通過Cys偶聯鑰孔血藍蛋白作為免疫原，偶聯載體蛋白牛血清白 蛋白作為包被原。偶聯方法如下： 5. 8mg 3-(2-卩比啶二疏基）丙酸N-輕基琥泊酰亞胺醋溶解于ImL二甲亞砜中，逐步滴 加至溶解有〇. Ig鑰孔血藍蛋白或牛血清白蛋白的ImL 0. OlM pH7.4PBS中，室溫反應12小 時。透析過夜除去游離的3-(2-吡啶二巰基）丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯。將4mg多肽加 入上述活化好的蛋白溶液中。反應12小時后透析過夜，凍干保存。
[0022] 抗體的制備和純化： 1) 分別用制備得到的抗原免疫6周雌性balb/c鼠，每組3只。首次免疫注射時，分別 100 μ g/mL的免疫抗原100 μ L，與等量弗氏完全佐劑充分乳化，腹腔直接注射。間隔兩周 后，取用樣的抗原，與100 μ L不完全佐劑乳化，同樣方法注射； 2) 在細胞融合前Id或當天拉頸處死昆明鼠，浸泡在70%酒精中，體表消毒；用大頭針 固定昆明鼠在蠟板上，超凈工作臺上剪開腹部，用小鑷子挑起腹膜，注入5mL RPMI-1640完 全培養液（由GIBICO RPMI-1640基礎培養液加入15%胎牛血清而得），用手輕輕揉動腹腔， 將其體內液體用無菌吸管移入75mL HAT完全培養液（由74. 25mL RPMI-1640完全培養液 加入0. 75mL 100XHAT液而得）中，用吸管混勻，鋪24孔板，每孔加0. 5mL，置于37°C C02 培養箱中； 3) 小鼠眼眶放血，收集血清，拉頸處死，70%酒精浸泡消毒體表，無菌取出脾臟，放入 RPMI-1640基礎培養液（購自GIBIC0,貨號為A10491-01)中，并小心剔除筋膜及脂肪，剪 碎，置于100目的不銹鋼篩內，無菌研磨，釋放出單個脾細胞，吸取含有脾細胞的液體置于 50mL無菌離心管中，離心； 4) 將骨髓瘤細胞和上述制備好的脾細胞以個數5 :1的比例加入同一 50mL的離心管 中，加入37°C溫浴的RPMI-1640不完全培養液（購自GIBIC0,貨號為61870-036) 20mL，混 合均勻，1500r/min離心6min，棄去上清，用手指輕擊離心管底部，使沉淀混勻如糊狀；用 移液管取37°C預熱的PEG lmL，滴入離心管，靜置Imin后，于37°C水浴中在2min內滴加 RPMI-1640完全培養液10mL，lOOOr/min離心6min，棄去上清，加75mL HAT培養液，輕輕混 勻，將混勻懸液分裝于有飼養細胞的24孔板中，每孔0. 5mL，于37°C、5% C