一種抗結核分枝桿菌感染的蛋白trim27的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種抗結核分枝桿菌感染的蛋白TRIM27，屬于細胞生物學領域。本發明提供的抗結核分枝桿菌感染的蛋白TRIM27，可以用于開發治療肺結核的藥物，或者JNK/p38信號通路激活劑，或者NF?κB信號通路抑制劑，為新型抗結核藥物的研究提供新的思路和分子靶標，尤其在抗結核等多種藥物的開發方面將有著廣闊的前景。
【專利說明】
一種抗結核分枝桿菌感染的蛋白TRIM27
技術領域
[0001 ]本發明涉及一種抗結核分枝桿菌感染的蛋白TRIM27，屬于細胞生物學領域。
【背景技術】
[0002] 20世紀90年代，由于耐多藥結核病(mul-tidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)和廣泛耐藥結核病（Extensively Drug-Resistant Tuberculosis，XDR TB)的出現和全 球性播散，使全球結核病疫情出現回升勢頭。目前MDR-TB的診斷和治愈率低，同時相當一部 分MDR-TB患者具有很強的傳染性，因此全球的MDR-TB防控工作正面臨嚴峻挑戰。結核病原 菌結核分枝桿菌(M. tuberculosis，Mtb)是一種典型的胞內菌，它進化出了高效復雜的逃避 或干擾宿主免疫信號通路的方法，只有深入探究結核分枝桿菌胞內存活的分子機制才能為 抗結核藥物的研發提供新的作用靶點。
[0003] TRIM27蛋白是TRIM家族中的一員，它擁有RING finger、B-box和coiled-coil三個 保守結構域。該蛋白在細胞質和細胞核中都有定位，其中定位于細胞核的TRIM27蛋白常作 為轉錄抑制因子抑制目的基因轉錄。TR頂27蛋白也可在細胞質中起作用，比如作為E3連接 酶介導底物泛素化，進而抑制其下游信號通路等。TRM27蛋白在分枝桿菌感染宿主過程中 發揮怎樣的作用，目前尚不清楚。

【發明內容】

[0004] 本發明首先提供了一種抗結核分枝桿菌感染藥物，其有效成分是以下(a)或(b)或 (c)：
[0005] (a)SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；
[0006] (b)在(a)中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個氨基酸或幾個氨基酸且具有 抗病原菌胞內存活活性的由(a)衍生的多肽或其類似物；
[0007] (C)與(a)、（b)中氨基酸序列整體相似度在85%以上的由（a)衍生的多肽或其類似 物。
[0008] 本發明通過實驗證明：（1)TR頂27能夠抑制病原菌結核分枝桿菌的胞內存活。CFU 結果顯示，當敲除巨噬細胞U937中TRIM27的編碼基因后，結核分枝桿菌在巨噬細胞U937胞 內的存活能力增強；而且，正常的巨噬細胞U937中TRM27的蛋白水平變化趨勢與胞內結核 分枝桿菌菌數一致，即當病原菌感染宿主細胞后，胞內TR頂27蛋白水平顯著增強，隨著菌體 被宿主清除，胞內的TRIM27的蛋白水平也逐漸下降。可見：當病原菌感染宿主細胞后， TRIM27蛋白作為宿主限制因子發揮抗感染作用。（2)通過雙熒光素酶報告系統及Western Blotting實驗發現在分枝桿菌感染巨噬細胞過程中，TRM27能夠顯著促進炎性細胞因子的 分泌，同時促進細胞凋亡，進而達到抗病原菌感染的目的。（3)進一步，研究結核分枝桿菌能 夠潛伏存活的分子機制，發現結核分枝桿菌中的效應蛋白PtpA會以TRIM27為靶點，抑制其 發揮抗感染作用，抑制TRIM27介導的天然免疫信號通路的活化及細胞凋亡，促進病原菌的 胞內存活，從而實現免疫逃逸。
[0009]本發明成果可以用于開發治療肺結核的藥物，或者JNK/P38信號通路激活劑，或者 NF-kB信號通路抑制劑，為新型抗結核藥物的研究提供新的思路和分子靶標，尤其在抗結核 等多種藥物的開發方面將有著廣闊的前景。此外，本發明成果還對尋找新的抗菌藥物靶點 和新藥篩選具有重要的理論意義。
【附圖說明】
[0010] 圖1:TR頂27抑制分枝桿菌胞內存活
[0011] 圖2: TRIM27促進宿主炎性細胞因子的分泌
[0012] 圖3: TR頂27促進細胞凋亡
[0013] 圖4: TRIM27與結核分枝桿菌分泌蛋白PtpA相互作用
[0014]圖5:PtpA抑制TRIM27介導的JNK信號通路的活化及細胞凋亡。
【具體實施方式】
[0015]實施例1TR頂27蛋白抗分枝桿菌感染
[0016] (A)實驗方法：用恥垢分枝桿菌(M. smegmatis)和卡介苗(BCG)分別感染野生型和 敲除TRIM27的巨噬細胞U937，通過對比不同時間點兩種巨噬細胞內分枝桿菌CFU變化來證 明TR頂27在抗病原菌感染過程中發揮作用。
[0017] (B)結果:恥垢分枝桿菌M. smegmatis感染巨噬細胞U937細胞2小時后CFU數最高， 隨著感染時間延長，分枝桿菌被逐漸清除（圖lBhBCG感染U937后CFU數在8小時內逐漸下 降，24小時后CFU數開始上升，原因是BCG中含有很多與結核分枝桿菌相同的效應蛋白開始 發揮干擾宿主天然免疫反應的作用，促進BCG的胞內存活（圖1A)。對比野生型和TRIM27敲除 型U937細胞中的CFU差異，結果表明TR頂27正常表達的U937細胞中分枝桿菌清除速度更快， 而TRM27敲除的U937細胞中分枝桿菌存活能力增強，即不同感染時間點的CFU數均顯著高 于野生型細胞。
[0018] 實施例2TR頂27促進炎癥細胞因子的分泌
[0019] (A)實驗方法：用M.smegmatis (圖2C，D)和BCG(圖2A，B)分別感染野生型和敲除 TR頂27的巨噬細胞U937,通過熒光實時定量PCR檢測感染不同時間點細胞因子il8和illb的 基因轉錄水平變化。
[0020] (B)結果:對比野生型和TRIM27敲除型U937細胞中il8和illb的基因轉錄水平在不 同感染時間點的變化，結果表明在M. smegmatis和BCG感染過程中，TR頂27干擾的U937細胞 中il8和illb的基因轉錄水平都明顯降低。因此，在分枝桿菌感染巨噬細胞過程中，TRM27 在促進炎性細胞因子的分泌抵抗病原菌感染方面發揮重要作用。
[0021] 實施例3TR頂27促進病原菌感染細胞的細胞凋亡過程
[0022] (A)實驗方法：用M.smegmatis分別感染野生型和TRIM27敲除的巨噬細胞，通過 Western blotting檢測感染不同時間點凋亡標志蛋白Caspase 3剪切活化程度(Cleaved-caspase 3)變化。
[0023] (B)結果：對比不同感染時間點野生型U937和TRIM27敲除的U937兩種細胞中 Cleaved-caspase 3蛋白水平，結果表明TRIM27敲除的U937細胞中Cleaved-caspase 3水平 更低，即TR頂27對細胞凋亡有促進作用（圖3)。
[0024] 實施例4Mtb PtpA抑制TRIM27介導的JNK信號通路活化及細胞凋亡
[0025] (A)實驗方法：用野生型M. smegmatis和過表達PtpA的M. smegmatis分別感染野生 型U937細胞和TRIM27敲除的U937細胞，分析不同感染時間點JNK、p38的磷酸化水平變化以 及Cleaved-caspase 3水平變化。
[0026] (B)結果：首先通過酵母雙雜交實驗證實結核分枝桿菌分泌蛋白PtpA與宿主 TRIM27蛋白相互作用（圖4)。進一步對比不同感染時間點細胞中JNK的磷酸化水平以及 Cleaved-caspase 3水平，結果表明PtpA對JNK的磷酸化激活和細胞凋亡都有抑制作用（圖 5A)，而當TR頂27敲除后，對JNK的磷酸化和細胞凋亡的抑制作用都變弱了，該結果說明PtpA 通過與TR頂27相互作用抑制其介導的JNK信號通路活化及細胞凋亡過程(圖5B)。
[0027]雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技 術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范 圍應該以權利要求書所界定的為準。
【主權項】
1. 一種抗結核分枝桿菌感染藥物，其特征在于，其有效成分是以下(a)或(b)或(c): (a) SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列； (b) 在(a)中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個氨基酸或幾個氨基酸且具有抗病 原菌胞內存活活性的由(a)衍生的多肽或其類似物； (c) 與(a)、（b)中氨基酸序列整體相似度在85%以上的由（a)衍生的多肽或其類似物。2. -種治療肺結核的藥物，其特征在于，其有效成分是以下(a)或(b)或(c): (a) SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列； (b) 在(a)中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個氨基酸或幾個氨基酸且具有抗病 原菌胞內存活活性的由(a)衍生的多肽或其類似物； (c) 與(a)、（b)中氨基酸序列整體相似度在85%以上的由（a)衍生的多肽或其類似物。3. -種JNK/p38信號通路激活劑，其特征在于，其有效成分是以下(a)或(b)或(c): (a) SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列； (b) 在(a)中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個氨基酸或幾個氨基酸且具有抗病 原菌胞內存活活性的由(a)衍生的多肽或其類似物； (c) 與(a)、（b)中氨基酸序列整體相似度在85%以上的由（a)衍生的多肽或其類似物。4. 一種NF-κΒ信號通路抑制劑，其特征在于，其有效成分是以下(a)或(b)或(c): (a) SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列； (b) 在(a)中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個氨基酸或幾個氨基酸且具有抗病 原菌胞內存活活性的由(a)衍生的多肽或其類似物； (c) 與(a)、（b)中氨基酸序列整體相似度在85%以上的由（a)衍生的多肽或其類似物。 5. TR頂27蛋白在篩選和開發治療結核分枝桿菌感染的藥物中的應用。
【文檔編號】A61P31/06GK106039286SQ201610381995
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月1日
【發明人】劉翠華, 汪靜
【申請人】中國科學院微生物研究所