一種檢測白細胞中結核分枝桿菌的免疫熒光染色方法及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001 ] 一種檢測白細胞中結核分枝桿菌的免疫熒光染色方法及試劑盒。
【背景技術】
[0002]結核病是由單一病原體一一結核分枝桿菌感染引起的慢性傳染病。近年來，由于人口流動性的增加、耐藥結核的出現、結核菌與艾滋病病毒的雙重感染等因素，結核病又卷土重來，再次成為嚴重危害人民群眾身體健康的重大公共衛生問題和社會問題。據世界衛生組織(WHO)報道目前估計全球大約有20億人感染結核分枝桿菌，2013年新發病例900萬。我國是結核病的高負擔國家，結核病患者數量居世界第二位，年發病人數約為130萬，占全球發病人數的14%。結核病是一種異質性非常高疾病，機體感染結核分枝桿菌后有人很快發病，成為活動性結核病患者，有人則終生不發病，成為潛伏感染者;結核病患者表現形式也多種多樣，有的表現為肺結核，有的則表現為不同類型的肺外結核，這種異質性嚴重阻礙了結核病的預防、治療、以及診斷的研究進展。
[0003]目前常用的結核分枝桿菌檢測方法有很多種，各有其特點，但往往存在操作復雜、耗時長、假陽性率或假陰性率較高等缺陷。現有的結核病診斷方法，主要包括傳統細菌學檢測技術、免疫學檢測技術和分子生物學檢測技術，下面將以細菌學檢測技術為主對各種檢測技術的研究進展及趨勢進行簡單綜述。
[0004](一)傳統細菌學檢測技術痰結核分枝桿菌陽性是診斷肺結核病的金標準，檢查方法有痰涂片法和痰培養法。
[0005]1、痰涂片法是從患者呼吸道取得的痰液標本進行涂片，再進行染色，然后在顯微鏡下鏡檢，如果痰中有細菌容易被檢出，也可以粗略地分辯是哪一類或哪一種細菌。所以痰涂片檢查是一種簡便、快速、價廉、可以得到初步結果的常用檢查方法。但是，臨床結果證實痰涂片法陽性率低，約30-40%，且需要痰標本中的細菌2 104/mL才能檢出，敏感性低，特異性較差。為了提高檢出率，后來有人將其改良，利用離心沉淀集菌涂片，將約5mL痰液中所含結核分枝桿菌的大部分濃縮到0.1mL沉淀中，使其靈敏度有所增高，但仍然不能解決特異性的問題，不能滿足臨床需求。但是，由于其操作簡單，不需要昂貴的設備和高水平的實驗條件，適合于衛生技術條件欠發達地區的技術人員使用，所以，盡管涂片法陽性檢出率不高，仍然是基層單位普遍使用的結核菌檢測方法。
[0006]2、痰培養法是為了準確地獲得具體是什么細菌，用人工的方法讓其生長，以便于觀察，并可以利用培養菌做藥物敏感試驗，避免盲目地使用抗生素，使患者更早得到有效治療。痰培養與痰涂片相比更準確可靠，但需要相對較長的時間，一般需要2-4周。痰培養法耗時較長且陽性率低，一般在50-60%左右，對臨床早期診斷價值有限，還需要做胸片、肺CT、支氣管鏡檢查以及結核抗體等檢查來輔助診斷。
[0007]3、痰涂片和痰培養中痰標本的采集至關重要，痰標本質量的好壞、送檢及時與否等因素都將直接影響檢測結果。
[0008]綜上，傳統細菌學檢測方法存在以下三方面的缺點:
第一，基于患者痰樣本進行檢測，患者痰的有無、采集方法是否正確、質量好壞、送檢及時與否等因素都將直接影響檢測結果，從而導致基于痰樣本的細菌學檢測無法獲得更高的檢出率和更好的特異性，迄需新型檢測方法替代傳統痰菌檢測。
[0009]第二，肺結核患者占全部結核患者的80%，其中將近50%是痰菌陰性的患者，通過傳統痰菌細菌學檢測勢必會造成這部分人群的漏診，需要其他方法輔助診斷；另外大約20%的結核患者表現為肺外結核，無法獲得痰樣本，因此也無法得到明確的細菌學證據，只能借助其它方法輔助診斷，或者試探性抗結核治療，迄需適合菌陰及肺外結核的新型細菌學檢測方法。
[0010]第三，目前對于抗結核治療是否治愈的評價，WHO同樣推薦以細菌學指標為判斷標準，因此，對于痰菌陽性的肺結核病人，在預定療程最后2個月連續痰菌培養陰性，即為陰轉治愈。而對于痰菌陰性的結核病人，在完成預定療程后，痰菌仍然為陰性者，即為滿療程治愈。但是，一般痰菌陽性患者在治療兩個月后均無法獲得痰樣本，而體內細菌是否清除卻不得而知；而痰菌陰性患者這一直表現為陰性，無法真正判斷是否治愈。所以，以痰菌培養結果作為治療效果評價的標準，勢必造成治療不徹底或者過治現象。
[0011](二)免疫學檢查
Nassau等首次利用酶聯免疫吸附試驗在結核患者血清檢測到結核抗體，由此開啟了結核免疫學檢測的新紀元，目前結核病免疫學檢測成為結核病輔助檢測重要手段之一。
[0012]1、抗體檢測
結核病抗體檢測技術不斷獲得改進和優化。ELISA是測定結核抗體研究和使用最多的技術之一，相對于傳統檢測方法其快速、簡便2-3 h即可完成。但是抗體免疫反應的延遲性導致早期結核病診斷結果易產生假陰性，同時共同抗原導致的交叉反應以及不能區分非結核分枝桿菌都會導致假陽性。因此，抗體檢測試劑未被WHO推薦應用于結核患者的臨床診斷。
[0013]2、抗原檢測
機體受到感染后，首先出現的是結核抗原，因此理論上對結核抗原的檢測比抗體檢測更適合于早期診斷。雙抗體夾心法是目前抗原檢測的常用方法，但因受高活性特異性抗體難制備的限制，使得直到目前為止國內外均沒有在臨床上應用良好的抗原檢測試劑。
[0014]3、細胞因子檢測
細胞免疫是非活動性結核病篩查的重要方法，機體首次受到感染后產生的記憶T淋巴細胞，經抗原再次刺激后增殖成效應T細胞，分泌細胞因子。目前細胞免疫檢測主要對效應T細胞數目(ELISP0T)及分泌的細胞因子量(ELISA)進行檢測，但是目前細胞免疫檢測試劑無法區分活動性肺結核患者和潛伏感染者，2014年中華醫學會結核病學分會和《中華結核和呼吸雜志》組織專家制定的《γ -干擾素釋放試驗在中國應用的建議》中認為γ -干擾素釋放試驗主要適用于結核感染而不是活動性結核病的診斷。
[0015](三)分子生物學方法
1998年結核分枝桿菌全基因組測序工作的完成，給結核病診斷帶來全新觀念。快速基因診斷技術的初步成功，對結核病的治療和控制帶來革命性變化，展示出廣闊的前景。
[0016]DNA 檢測上世紀90年代Hance利用PCR技術檢測結核分枝桿菌，給結核病的臨床診斷帶來了革命性突破。在此基礎上，實時熒光定量PCR在一定程度上彌補了常規PCR檢測的不足，通過利用特異性引物和熒光探針，實時監測整個PCR進程并用標準曲線進行定量分析，使檢測結果更加可靠。環介導等溫擴增技術(LAMP)不需要改變溫度，不依賴專門儀器設備，直接用肉眼判定結果，簡單高效成本低，在一定程度上避免了實驗室的交叉污染。近年新型的分子檢測方法Xpert MTB/RIF(利福平)受到廣泛關注，2010年12月世衛組織認可Xpert MTB/RIF作為一種全新的結核病快速檢測新方法。然而上述方法都以DNA為模板，DNA的穩定性使PCR檢測結果不能辨別活菌和死菌而產生假陽性結果。
[0017]但是，相對于痰涂片檢測，分子檢測還是復雜程度高，而且同樣主要以痰樣本進行檢測，目前沒有相關研究探討分子診斷方法對于血液樣本的檢測結果。
[0018]綜上所述，這些結果都顯示建立簡便快捷、陽性率高的基于血液的細菌學檢測方法是可行的，也是迫切需要的。而本研究的目的是建立一種全新的基于血液的致病性結核分枝桿菌特異的細菌學檢測方法。首先，該方法利用常規血液樣本進行檢測，不受痰樣本取樣難、取樣不規范或者樣本不合格等問題的影響，對于痰菌陰性與痰菌陽性的結核患者具有相同的檢測效果，并且可以分別檢測同一患者血漿和白細胞中的結核分枝桿菌;第二，該方法利用針對致病性結核分枝桿菌特有的RDl區抗原ESAT-6和CFPlO的單克隆抗體，只檢測致病性結核分枝桿菌的存在，而不受卡介苗免疫和其它分枝桿菌的影響，特異性優于常規痰菌檢測；第三，該方法采用免疫熒光檢測技術，可通過WHO推薦的LED熒光顯微鏡觀察，易于尋找陽性菌，提尚檢出率。

【發明內容】

[0019]本發明提供了檢測白細胞中結核分枝桿菌的方法，包括步驟:
a.通過離心或者自然下沉法從血液中收集血細胞；
b.加入紅細胞裂解液使紅細胞裂解；
c.離心收集白細胞；
d.可選地，洗滌白細胞；
e.重懸白細胞；
f.制成白細胞涂片；
g.使用固定液固定白細胞；
h.使用通透液透化白細胞；
1.使用封閉液封閉；
g.使用抗