識別hpv18陽性宮頸上皮癌細胞的單克隆抗體及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物診斷及醫藥領域，具體地說，本發明涉及識別HPV18陽性宮頸上 皮癌細胞的單克隆抗體及其應用。
【背景技術】
[0002] 宮頸癌是女性生殖系統的常見惡性腫瘤，位居女性惡性腫瘤第二位。1949 年，Sttauss首先在電鏡下于撫體浸出液中觀察到人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV)顆粒。在1976年Harald Zur Hausen提出HPV可能是性傳播致癌因素之后， HPV感染與宮頸癌關系的研究成為腫瘤病毒病因研究的熱門課題。大量研究發現，人乳頭 瘤病毒HPV是導致宮頸癌的元兇，還可以引起多種其它腫瘤，包括生殖道、乳腺、消化道及 呼吸道癌癥。HPV近年來在我國人群中的傳播有增無減，故宮頸癌預防、治療的研究工作非 常重要。
[0003] 大多數婦女在其一生中都會感染生殖器HPV，全世界生殖器HPV感染率高達 10.4%。大多數HPV感染在1-2年內會被自身免疫系統所清除，而持續存在的HPV感染將 會演變為高度宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia,CIN)損傷，如CIN2 和CIN3,甚至進一步演變為宮頸癌。據統計，約20%的低度宮頸損傷將轉變為高度損傷，如 果不及時治療，其中30%將會進一步轉為為惡性腫瘤。因此，早期診斷和預防HPV感染是降 低宮頸癌等相關疾病死亡率和減少宮頸癌治療開支的重要突破口。目前宮頸癌篩查主要采 用的是巴氏涂片檢驗，檢測宮頸脫落細胞的細胞學形態。細胞形態學檢測具有一定的主觀 性，制片困難，批內和批間重復性差，具有較高的假陽性和假陰性率，因此對早期癌癥檢測 靈敏度低、漏診率高，陽性檢出率僅在30%~50% ;在一些地區，巴氏涂片檢驗已經被液基 細胞學（LBC)所取代，LBC是半自動或全自動標本處理新技術，能夠自動分析檢測樣本并可 提供剩余的細胞樣本供其他HPV感染分析。另一種臨床上使用廣泛的分子檢測--HPVDNA 檢測（如HC2)可以輔助細胞學檢測高危HPV病毒的存在。雖然HPV DNA檢測比細胞形態 學檢測靈敏，但是無法區分HPV是瞬時感染或是持續感染，而在腫瘤惡性演變進程中檢測 方法的靈敏度和特異性都是必須的。由于其不能準確的反映宮頸癌的發生因此不能用于檢 測癌癥（美國和我國2012年底分別更新的宮頸癌篩查指南一致指出"不推薦在任何年齡段 的人群中單獨使用HPV檢測進行篩查"）。
[0004] HPV是一種具有種屬特異性的嗜上皮病毒，屬雙鏈閉環的小DNA病毒，包含約8000 個堿基對。其中包括8個早期開放讀碼框架（E1-E8)、2個晚期讀碼框架和1個非編碼長控 區。在早期開放讀碼框架中，E6和E7基因對細胞生長刺激最為重要。Ziegent(2003)等研 究已證實HPV E6、E7基因具有細胞轉化功能，是潛在的癌基因，編碼HPV E6、E7蛋白為 癌蛋白，在體外能轉化小鼠上皮細胞，也能使人類上皮細胞發生永生化，而且HPV E6、E7 蛋白的持續表達是維持體外培養細胞永生化所必需的。因此，高危型HPV的早期表達蛋白 E6和E7在宮頸癌的發生中起著重要作用。癌癥發生過程中病毒DNA整合入人體細胞基因 組內，隨著E6和E7蛋白表達控制的缺失，在高度宮頸非典型增生和宮頸癌病人的上皮細胞 內持續表達E6和E7蛋白。E7是腫瘤原性蛋白，且具有較強的抗原性，能夠使腫瘤抑癌基 因 pRb失活，最終引起細胞生長失控，導致細胞永生化而發生癌變。這使得E7可作為高度 宮頸損傷和宮頸癌檢測的一個腫瘤標志物。
[0005] 目前臨床免疫組化檢測HPV感染主要是采用HPV L1和其他一些輔助生物標志， 如 pl6INK4A,Ki67，hTERT 等（Valentina F, Renzo B, Serena B,等，Detection of HPV E7 Oncoviral protein in cervical lesions by a new antibody. Appl immunohistochem Mol Morphol，2013,21 (4):341-350)。臨床HPV檢測沒有合適的抗體主要有三個原因：1， HPV蛋白在臨床組織或細胞樣本中表達量較低，需要度高親和力的抗體進行檢測；2, HPV病 毒在現有的標準組織培養技術下不能在實驗室培養存活；3, E7蛋白本身存在免疫抑制，使 得采用E7蛋白免疫動物不能獲得很好的免疫反應，另外使制備得到的抗體往往與其他的 HPV蛋白存在交叉反應對E7蛋白不具有特異性。
[0006] 因此，需要提供一種簡便的、客觀的方法來檢測高危型HPV感染的癌癥（特別是宮 頸癌）。

【發明內容】

[0007] 本發明的目的在于提供一種能夠識別HPV18陽性宮頸上皮癌細胞的單克隆抗體 及其應用。
[0008] 在本發明的第一方面，提供了一種抗體的重鏈可變區，所述的重鏈可變區包括以 下三個互補決定區⑶R :
[0009] SEQ ID N0. :4 所示的 CDR1，
[0010] SEQ ID N0. :6 所示的 CDR2,和
[0011] SEQ ID N0. :8 所示的 CDR3。
[0012] 在另一優選例中，所述重鏈可變區具有SEQ ID Ν0. : 10所示的氨基酸序列。
[0013] 本發明的第二方面，提供了一種抗體的重鏈，所述的重鏈具有如本發明第一方面 所述的重鏈可變區，和
[0014] 重鏈恒定區。
[0015] 在另一優選例中，所述的重鏈恒定區為人源或鼠源。
[0016] 本發明的第三方面，提供了一種抗體的輕鏈可變區，所述輕鏈可變區具有選自下 組的互補決定區⑶R :
[0017] SEQ ID N0. : 14 所示的 CDR1'，
[0018] SEQ ID N0. : 16 所示的 CDR2'，和
[0019] SEQ ID N0. : 18 所示的 CDR3'。
[0020] 在另一優選例中，所述的輕鏈可變區具有SEQ ID N0. :20所示的氨基酸序列。
[0021] 本發明的第四方面，提供了一種抗體的輕鏈，所述的輕鏈具有如本發明第三方面 所述的輕鏈可變區，和
[0022] 輕鏈恒定區。
[0023] 在另一優選例中，所述的輕鏈恒定區為人源或鼠源。
[0024] 本發明的第五方面，提供了一種抗體，所述抗體具有：
[0025] (1)如本發明第一方面所述的重鏈可變區；和/或
[0026] (2)如本發明第三方面所述的輕鏈可變區。
[0027] 在另一優選例中，所述抗體具有：如本發明第二方面所述的重鏈；和/或如本發明 第四方面所述的輕鏈。
[0028] 在另一優選例中，所述的抗體為特異性抗HPV的抗體；優選地，所述抗體為特異性 抗HPV18的抗體；更優選地，所述抗體為特異性抗HPV18E7蛋白的抗體。
[0029] 在另一優選例中，所述的抗體包括：單鏈抗體、雙鏈抗體、單克隆抗體、嵌合抗體 (如人鼠嵌合抗體）、鼠源抗體、或人源化抗體。
[0030] 在另一優選例中，所述抗體具有以下特性：
[0031] (1)與HPV1SE7蛋白親和力彡2· 67nM ;和
[0032] (2)不與HPV16E7蛋白結合。
[0033] 所述"HPV18E7蛋白"可以為野生型HPV18E7蛋白，也可以為野生型HPV18E7蛋白 的衍生蛋白。所述"HPV16E7蛋白"可以為野生型HPV16E7蛋白，也可以為野生型HPV16E7 蛋白的衍生蛋白。
[0034] 在另一優選例中，所述抗體為能夠特異性區分HPV18E7蛋白和HPV16E7蛋白的單 克隆抗體。
[0035] 在另一優選例中，所述抗體不與其它HPV亞型結合或者與其它HPV亞型的親和力 較低。
[0036] 在另一優選例中，所述抗體還具有以下特性：
[0037] (3)能夠對包含HPV18E7的44-58位氨基酸的蛋白特異性結合。
[0038] 在另一優選例中，所述抗體為IgGl型抗體。
[0039] 本發明的第六方面，提供了一種重組蛋白，所述的重組蛋白具有：
[0040] (i)如本發明第一方面所述的重鏈可變區、如本發明第二方面所述的重鏈、如本發 明第三方面所述的輕鏈可變區、如本發明第四方面所述的輕鏈、或如本發明第五方面所述 的抗體；以及
[0041] (ii)任選的協助表達和/或純化的標簽序列。
[0042] 在另一優選例中,所述的標簽序列包括6His標簽。
[0043] 在另一優選例中，所述的重組蛋白特異性抗HPV ;優選地，特異性抗HPV18 ;更優選 地，特異性抗HPV18E7蛋白。
[0044] 本發明的第七方面，提供了一種多核苷酸，它編碼選自下組的多肽：
[0045] (1)如本發明第一方面所述的重鏈可變區、如本發明第二方面所述的重鏈、如本發 明第三方面所述的輕鏈可變區、如本發明第四方面所述的輕鏈、或如本發明第五方面所述 的抗體；或
[0046] (2)如本發明第六方面所述的重組蛋白。
[0047] 在另一優選例中，所述的多核苷酸具有SEQ ID N0. :3、5、7、9、13、15、17、或19所示 的序列。
[0048] 本發明的第八方面，提供了一種載體，它含有本發明本發明第七方面所述的多核 苷酸。
[0049] 在另一優選例中，所述的載體包括：細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、 哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒、或其他載體。
[0050] 本發明的第九方面，提供了一種遺傳工程化的宿主細胞，它含有本發明第八方面 所述的載體或基因組中整合有本發明第七方面所述的多核苷酸。
[0051] 本發明的第十方面，提供了一種免疫偶聯物，該免疫偶聯物含有：
[0052] (a)如本發明第一方面所述的重鏈可變區、如本發明第二方面所述的重鏈、如本發 明第三方面所述的輕鏈可變區、如本發明第四方面所述的輕鏈、或如本發明第五方面所述 的抗體；和
[0053] (b)選自下組的偶聯部分：可檢測標記物、藥物、毒素、細胞因子、放射性核素、或 酶。
[0054] 在另一優選例中，所述偶聯物選自：熒光或發光標記物、放射性標記物、MRI (磁共 振成像）或CT (電子計算機X射線斷層掃描技術）造影劑、或能夠產生可檢測產物的酶、放 射性核素、生物毒素、細胞因子（如IL-2等）、抗體、抗體Fc片段、抗體scFv片段、金納米顆 粒/納米棒、病毒顆粒、脂質體、納米磁粒、前藥激活酶（例如，DT-心肌黃酶（DTD)或聯苯 基水解酶-樣蛋白質（BPHL))、化療劑（例如，順鉬）或任何形式的納米顆粒等。
[0055] 本發明的第十一方面，提供了一種藥物組合物，其特征在于，它含有：
[0056] (i)如本發明第一方面所述的重鏈可變區、如本發明第二方面所述的重鏈、如本發 明第三方面所述的輕鏈可變區、如本發明第四方面所述的輕鏈、或如本發明第五方面所述 的抗體、如本發明第六方面所述的重組蛋白、或如本發明第十方面所述的免疫偶聯物；以及
[0057] (ii)藥學上可接受的載體。
[0058] 在另一優選例中，所述的藥物組合物為注射劑型。
[0059] 在另一優選例中，所述的藥物組合物用于制備治療腫瘤的藥物，所述的腫瘤選自 下組：胃癌、肝癌、白血病、腎臟腫瘤、肺癌、小腸癌、骨癌、前列腺癌、結直腸癌、乳腺癌、大腸 癌、前列腺癌、宮頸癌、腎上腺腫瘤、或膀胱腫瘤。
[0060] 本發明的第十二方面，提供了如本發明第一方面所述的重鏈可變區、如本發明第 二方面所述的重鏈、如本發明第三方面所述的輕鏈可變區、如本發明第四方面所述的輕鏈、 或如本發明第五方面所述的抗體、如本發明第六方面所述的重組蛋白、或如本發明第十方 面所述的免疫偶聯物的用途，其特征在于，用于制備藥劑、試劑、檢測板或試劑盒；
[0061] 所述試劑、檢測板或試劑盒用于：
[0062] (1)檢測樣品中HPV18E7蛋白；和/或
[0063] (2)檢測腫瘤細胞中內源性的HPV18E7蛋白；和/或
[0064] (3)檢測表達HPV18E7蛋白的腫瘤細胞；和/或
[0065] (4)鑒別HPV的類型；
[0066] 所述藥劑用于治療或預防表達HPV18E7蛋白的腫瘤。
[0067] 在另一優選例中，所述樣品中含有HPV18E7蛋白。
[0068] 在另一優選例中，所述腫瘤包括：泌尿生殖系統的腫瘤，小細胞肺癌、黑色素瘤或 頭頸腫瘤、胃癌、肝癌、白血病、腎臟腫瘤、肺癌、小腸癌、骨癌、前列腺癌、結直腸癌、乳腺癌、 大腸癌、前列腺癌、或腎上腺腫瘤。
[0069] 在另一優選例中，所述"泌尿生殖系統的腫瘤"包括：宮頸癌、膀胱癌、子宮內膜癌 或陰莖癌。
[0070] 在另一優選例中，所述的試劑包括芯片、包被抗體的免疫微粒。
[0071] 本發明的第十三方面，提供了一種檢測樣品中HPV E7蛋白的方法，所述方法包括 步驟：
[0072] (1)將樣品與本發明第五方面所述的抗體接觸