一種綠盲蝽卵黃原蛋白、其特異性肽鏈、載體、菌株及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及農業科學技術領域，具體涉及一種綠盲蝽卵黃原蛋白、其特異性肽鏈、 載體、菌株及應用。
【背景技術】
[0002] 昆蟲卵黃原蛋白（Vg蛋白）是存在于昆蟲雌成蟲體液中的一種重要蛋白，是昆蟲 卵黃蛋白的前體，對于昆蟲卵的發育具有重要作用，其在雌性昆蟲體內的含量高低決定雌 成蟲產卵潛力大小。綠盲蝽Apolyguslucorum(Hemiptera:Miridae)屬半翅目盲蝽科，是 我國目前包括Bt棉在內的多種經濟作物上的主要害蟲。由于綠盲蝽具有多食性、移動快、 取食隱蔽等特點，導致目前農業生產上對于綠盲蝽種群數量精確測報技術的研發面臨嚴峻 挑戰。而對綠盲蝽產卵量的準確測報是其田間種群測報過程中重要一環，并對其防治具 有重要的指導意義，因此急待開拓綠盲蝽種群測報的新技術。運用Vg含量開發害蟲種群 測報工作是一種綠盲蝽種群測報的新興方法，然而對于編碼綠盲蝽卵黃原蛋白（Apolygus lucorumVitellogenein，AlVg)蛋白表達量的檢測方法相對匱乏，同時針對AlVg基因、蛋 白相對表達量與其產卵量的關系，國內外尚未見相關報道。因此分離純化AlVg基因特異性 肽鏈的氨基酸序列，制備其抗體，研宄其AlVg基因、蛋白相對表達量與其產卵量的相關性， 這對于利用AlVg基因、蛋白相對表達量進一步開發綠盲蝽種群測報新技術有著重要的理 論意義和指導作用。

【發明內容】

[0003] 發明目的：本發明的第一個目的是提供一種用于編碼綠盲蝽卵黃原蛋白的DNA序 列，其喊基序列如SEQ ID NO :1所不。
[0004] 本發明的另一個目的在于提供一種綠盲蝽卵黃原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO : 2所示。
[0005] 本發明的又一個目的是提供一種用于編碼綠盲蝽卵黃原蛋白特異性肽鏈的DNA 序列，其堿基序列如SEQ ID NO :3所示。
[0006] 本發明的又一個目的是提供一種綠盲蝽卵黃原蛋白特異性肽鏈，其氨基酸序列如 SEQ ID NO :4所示。
[0007] 本發明的又一個目的是提供含有所述的用于編碼綠盲蝽卵黃原蛋白特異性肽鏈 的DNA序列的重組表達載體、轉基因細胞系統或轉基因重組菌。
[0008] 本發明的又一個目的是提供一種轉基因重組菌，所述重組菌是將所述的重組表達 載體導入大腸桿菌中，篩選得到轉基因重組菌。
[0009] 本發明的又一目的是提供一種綠盲蝽卵黃原蛋白特異性肽鏈的制備方法。
[0010] 技術方案：為了解決上述問題，本發明的技術方案是提供一種用于編碼綠盲蝽卵 黃原蛋白的DNA序列，其堿基序列如SEQ ID NO :1所示。
[0011] -種綠盲蝽卵黃原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
[0012] -種用于編碼綠盲蝽卵黃原蛋白特異性肽鏈的DNA序列，其堿基序列如SEQID NO: 3所示。
[0013] -種綠盲蝽卵黃原蛋白特異性肽鏈，其氨基酸序列如SEQ ID NO :4所示。
[0014] 含有所述的用于編碼綠盲蝽卵黃原蛋白特異性肽鏈的DNA序列的重組表達載體、 轉基因細胞系統或轉基因重組菌。
[0015] 將所述的DNA序列插入到大腸桿菌表達載體中得到的表達綠盲蝽卵黃原蛋白特 異性肽鏈的重組表達載體。
[0016] 其中，上述大腸桿菌表達載體為pCznl。
[0017] -種轉基因重組菌，所述重組菌是將所述的重組表達載體導入大腸桿菌中，篩選 得到轉基因重組菌。
[0018] 本發明所述的大腸桿菌為BL21 (DE3)。
[0019] 本發明所述的AlVg蛋白的特異性肽鏈DNA序列、所述的重組表達載體、轉基因細 胞系統或轉基因重組菌在生產AlVg蛋白特異性肽鏈抗體中的應用。
[0020] 一種AlVg蛋白特異性肽鏈的制備方法，是培養所述的轉基因重組菌得到的AlVg 蛋白特異性肽鏈。
[0021] 一種AlVg蛋白特異性肽鏈抗體的制備方法，是經過抗原親和純化法獲得針對 AlVg蛋白特異性肽鏈多克隆抗體。
[0022] 一種AlVg蛋白特異性肽鏈的制備方法，包括以下步驟：
[0023] 1)、綠盲蝽卵黃原蛋白特異性肽鏈cDNA片段的PCR擴增，所述綠盲蝽卵黃原蛋白 特異性肽鏈cDNA序列如SEQIDNO:3所示；
[0024] 2)、綠盲蝽卵黃原蛋白特異性肽鏈cDNA片段的原核表達載體構建；
[0025]3)、綠盲蝽卵黃原蛋白特異性肽鏈的變性和復性；
[0026] 4)、綠盲蝽卵黃原蛋白特異性肽鏈的純化即得。
[0027] 然后將上述得到的AlVg蛋白特異性肽鏈采用抗原親和純化法獲得針對AlVg蛋白 特異性肽鏈多克隆抗體；
[0028] 最后Western雜交驗證AlVg蛋白特異性肽鏈抗體的效果，并分析綠盲蝽取食不同 寄主植物后，雌成蟲AlVg蛋白表達量差異。
[0029] 有益效果：本發明相對于現有技術，具有以下優點：
[0030] 1.本發明的AlVg蛋白由1991個氨基酸組成，在昆蟲體內是相對比較大的蛋白，很 難全長表達，進而合成特異性抗體較難。因此本發明在獲得AlVg蛋白cDNA全長的基礎上， 經過國際權威基因數據庫NationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)分析 后，分析獲得AlVg蛋白258個氨基酸的特異性肽鏈序列，利用此序列制作的抗體可以用于 AlVg蛋白的相對表達量檢測。純化出的AlVg蛋白特異性肽鏈抗體不同田間寄主采集AlVg 蛋白含量比較，同時可為綠盲蝽田間種群測報新技術的研發提供基礎。
[0031] 2.本發明的AlVg蛋白在其雌成蟲羽化后1-7天其表達量逐漸升高，并在雌成蟲羽 化后7天達到峰值，并且其表達量在綠盲蝽取食不同寄主過程中與綠盲蝽單雌產卵量存在 顯著相關性（P〈〇. 01)。由于綠盲蝽在田間存在嚴重的世代重疊現象，因此可以采集綠盲蝽 雌成蟲，分析其AlVg蛋白含量的方式與室內數據對比預測綠盲蝽田間爆發潛力。
【附圖說明】
[0032] 圖1 :AlVg基因開放閱讀框PCR擴增電泳圖；泳道1:為lOOOObp的DNA maker;泳 道2 :AlVg基因；
[0033] 圖2 :AlVg蛋白氨基酸序列特征示意圖；AlVg氨基酸序列特征區域分析，其中氨基 酸序列數字編碼在圖的右側，AlVg氨基酸序列在NCBI保守區預測后呈現三個保守區域，即 1)兩個vitellogenin-N結構域（黑框部分）；2)DUF1943結構域（黑色加粗的下劃線）；c) von Willebrand factor(VWF)結構域（氨基酸英文字體加深部分）；此外，保守的連續氨基 酸序列RXXR，DGXR及GL/ICG以加粗的雙下劃線呈現在圖中；前17個氨基酸序列為信號肽 序列，并以向下的加粗箭頭標注；*表示為終止氨基酸；
[0034] 圖3 :AlVg蛋白特異性肽鏈DNA序列的PCR擴增電泳圖；泳道1:為2000bp的DNA maker;泳道2 :AlVg蛋白特異性肽鏈DNA序列；
[0035] 圖4AlVg特異性肽鏈cDNA序列連接pCznl表達載體后Ndel和Xbal雙酶切圖譜； 泳道1 :為l〇〇〇〇bp的DNA maker ;泳道2 :AlVg蛋白特異性肽鏈基因及pCznl載體片段；
[0036] 圖5pCznl-AlVg特異性肽鏈基因序列利用誘導表達的經10%SDS-PAGE分析電泳 圖；泳道M:為蛋白maker;泳道1 :未經誘導菌株的總蛋白；泳道2 :空載體誘導菌株的總 蛋白；泳道3 :經0. 5mMIPTG在37°C誘導靶標載體表達的總蛋白上清液；泳道4 :經0. 5mM IPTG在37°C誘導靶標載體表達的總蛋白包涵體；
[0037] 圖6AlVg特異性肽鏈誘導表達，純化后經10% SDS-PAGE電泳分析圖譜；泳道M:為 蛋白maker ;泳道1 :經0. 5mM IPTG在37°C誘導靶標載體表達的總蛋白包涵體；泳道2 :純 化后的革巴標蛋白；
[0038] 圖7AlVg蛋白特異性肽鏈抗體純化、電泳分離后，考馬斯亮藍染色圖譜；
[0039] 圖8利用特異性肽鏈抗體Western雜交AlVg蛋白圖譜；泳道1:為250kd蛋白 maker。泳道2 :AlVg蛋白Western雜交圖譜；
[0040] 圖9整個生育期綠盲蝽AlVg基因表達量變化圖譜；N1-N5,為1-5齡若蟲；F1-F9， 為1-9日齡雌成蟲；M1-M9,為1_9日齡雄成蟲；
[0041] 圖10不同寄主后飼養后綠盲蝽AlVg蛋白表達量分析圖譜。
【具