一種結核分枝桿菌全蛋白質芯片及應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種結核分枝桿菌全蛋白質芯片及應用。本發明提供的一種有如下1）-7）中至少一種功能的蛋白芯片，所述蛋白芯片上連有如下4168種蛋白，且每種蛋白單獨成立一個檢測點；本發明的實驗證明，本發明提供了一種結核分枝桿菌全蛋白質芯片，由基片和包含95%以上的結核分枝桿菌基因組編碼的蛋白質組成。該全蛋白質芯片在尋找血清生物標識物、與小分子化合物c-di-GMP相互作用底物，與蛋白質激酶的相互作用的激酶底物，與巨噬細胞相互作用的底物都有明顯的意義。本發明相對現有的研究手段具備全局性、高通量的篩選特點，簡化了研究設計及操作過程，顯著提高研究效率。
【專利說明】—種結核分枝桿菌全蛋白質芯片及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，尤其涉及一種結核分枝桿菌全蛋白質芯片及應用。
【背景技術】
[0002]結核病是由結核桿菌感染所致，侵擾了人類有7000年的歷史。卡介苗和抗生素的出現使結核病一度得到控制。但耐藥的產生及與HIV共感染等問題使結核病在世界范圍內又死灰復燃。WHO于1993年史無前例地宣布“全球結核病緊急狀態”，1998年又重申了“遏制結核病刻不容緩”。目前全球60億人約有20億感染了結核桿菌，現有結核病患者2000萬，每年死亡300萬，結核病已成為傳染病中的頭號殺手。我國為全球22個結核病疫情嚴重的國家之一，年發病人數約為130萬，占17%，位居全球第2位。然而，耐藥的出現使得結核病問題雪上加霜。目前全球感染了結核桿菌的20億人有5000萬是耐藥的。全球已有50多個國家報告發生了廣泛耐藥結核病例。中國是耐多藥和廣泛耐藥結核病疫情最嚴重的國家之一，耐多藥結核病人14萬，占全球1/3?1/4的耐多藥結核病人在中國。再加上全球的城市化進程加快、交通日益發達以及人口老齡化等又為結核病的流行創造了有利條件，其結果導致結核病的流行正在全球復活。
[0003]結核病疫情嚴重，但臨床防治存在困難:1)因無特異的結核病生物標識物及其靈敏、快速的檢測方法等導致結核病發現率低；2)目前無有效疫苗進行結核病預防。盡管卡介苗的普及大大降低了新生兒和青少年結核病的發病率和死亡率，但其存在保護時效較短、不同人群差異很大、對成人無效等問題。3) 60年來無抗結核新藥導致耐藥性、不良反應和療效不足等問題產生。目前，結核病治療世界范圍內推廣使用DOTS策略。這是一種標準化療程，即前期4種藥物聯用(異煙肼+利福平+吡嗪酰胺+乙胺丁醇)加后期的兩種藥物聯用(異煙肼+利福平)。這種策略雖然在結核病治療方面起著非常重要的作用，但結核病治療時間長達6-9個月，導致耐藥性及不同人群差異很大，導致死亡率的升高。因此迫切需要發展新的結核病診斷試劑、新型疫苗和藥物。
[0004]造成目前結核病防控方面被動的最根本原因之一在于結核病和導致結核病的肺結核分枝桿菌基礎研究方面的薄弱。結核病是結核桿菌與宿主免疫系統復雜斗爭的結果。結核桿菌不分泌毒素，也不像病毒是有限的幾個基因致病，它由4000多個蛋白組成，而且除蛋白質之外還有糖類和脂類等功能分子對于其致病性至關重要，但目前結核桿菌哪些蛋白質引起致病？哪些蛋白質可以作為新藥研發的靶標？哪些蛋白質引起宿主的免疫反應還不清楚。這些基本的科學問題不清楚導致結核病診斷，疫苗和藥物相關的研發無從下手。傳統的結核病研究主要集中在單一因素或單一水平。需要認識到結核桿菌致病的關鍵問題是病原與宿主的互作，需要采用多因素、多水平的分析思路和高通量的篩選方法來理解多個因子協同作用導致結核病的發生。要想在結核病的防控方面取得突破，必需站在全局性的高度從基礎的新生物標識物、新免疫原發現以及藥物作用機制的揭示方面甚至更基礎的結核菌的分子調控網絡入手。但由于結核菌研究的一些特殊性，如生長極其緩慢、難以破碎、基因組GC含量高、蛋白質難以重組表達以及致病菌必需在P3實驗室中操作等，結核病 及肺結核分枝桿菌的基礎研究方面長期滯后。

【發明內容】

[0005]本發明的一個目的是提供一種蛋白芯片。
[0006]本發明提供的蛋白芯片，包括基片和與其連接的結核分枝桿菌基因組編碼的85%的蛋白質；且每種蛋白單獨成立一個檢測點。
[0007]上述蛋白芯片中，所述結核分枝桿菌基因組編碼的85%的蛋白質為表I所示的4168種蛋白；
[0008]所述基片為載體玻片。
[0009]上述蛋白芯片中，所述蛋白芯片是分別將所述4168種蛋白點樣于載體玻片上制成的。
[0010]上述蛋白芯片中，所述結核分枝桿菌為結核分枝桿菌(MycobacteriumM.tuberculosis) H37Rv 和結核分枝桿菌(Mycobacterium M.tuberculosis) CDC1551。
[0011 ] 含有上述的蛋白芯片的試劑盒。
[0012]上述的蛋白芯片或試劑盒在如下I) -5)中的應用:
[0013]I)篩選與結核病患者血清特異結合的蛋白或構建與結核病患者血清特異結合的蛋白庫；
[0014]2)篩選與環二鳥苷酸相互作用的結合分枝桿菌蛋白或構建與環二鳥苷酸相互作用的結合分枝桿菌蛋白數據庫；
[0015]3)篩選與蛋白激酶相互作用的結合分枝桿菌蛋白或構建與蛋白激酶相互作用的結合分枝桿菌蛋白數據庫；
[0016]4)篩選與非編碼RNA相互作用的結合分枝桿菌蛋白或構建與非編碼RNA相互作用的結合分枝桿菌蛋白數據庫；
[0017]5)篩選與巨噬細胞蛋白相互作用的結合分枝桿菌蛋白或構建與巨噬細胞蛋白相互作用的結合分枝桿菌蛋白數據庫。
[0018]上述應用中,所述蛋白激酶為PknB或PknE ;
[0019]所述非編碼RNA為MTS2823，其核苷酸序列為序列表中序列I ;
[0020]所述巨噬細胞蛋白按照如下方法制備:裂解所述巨噬細胞，收集上清液得到巨噬細胞蛋白。
[0021]上述結核病患者為由結核分枝桿菌感染的患者。
[0022]上述應用中，所述巨噬細胞為單核巨噬細胞THP-1。
[0023]本發明的實驗證明，本發明提供了一種結核分枝桿菌全蛋白質芯片，由基片和包含85%以上的結核分枝桿菌基因組編碼的蛋白質組成。該全蛋白質芯片在尋找血清生物標識物、與小分子化合物c-d1-GMP相互作用底物，與蛋白質激酶的相互作用的激酶底物，與巨噬細胞裂解物相互作用的底物都有明顯的意義。本發明相對現有的研究手段具備全局性、高通量的篩選特點，簡化了研究設計及操作過程，顯著提高研究效率。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為所制備的結核分枝桿菌蛋白的銀染定量檢測[0025]圖2為所制備的結核分枝桿菌蛋白的免疫印跡檢測
[0026]圖3為所制備的全蛋白質芯片的質控結果圖
[0027]圖4為全蛋白質芯片的血清分析結果圖
[0028]圖5為全蛋白質芯片與小分子化合物的作用結果圖
[0029]圖6為全蛋白質芯片與蛋白質相互作用的結果圖
[0030]圖7為全蛋白質芯片上進行蛋白質激酶反應的結果圖
[0031]圖8為全蛋白質芯片與RNA相互作用的結果圖
[0032]圖9為全蛋白質芯片與細胞裂解物相互作用的結果圖
【具體實施方式】
[0033]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0034]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0035]實施例1、全蛋白質芯片的制備
[0036](一)結核分枝桿菌蛋白的高通量的制備
[0037]1、表達
[0038]由基因工程改造過的釀酒酵母利用半乳糖誘導過量表達，具體過程為:
[0039]首先從分枝桿菌屬結核分枝桿菌(Mycobacterium Μ.tuberculosis) H37Rv菌株(北京株)(Naturel998Novl2; 396 (6707):190 ;公眾可從中國科學院生物物理研究所，上海交通大學，中國科學院武漢病毒研究所，廣東體必康生物科技有限公司獲得.)和CDC1551 菌株(J Bacteriol.20020ctober; 184(19):5479 - 5490 ;公眾可從廣東體必康生物科技有限公司獲得..)中，分別通過PCR克隆獲得H37Rv菌株3749個蛋白和⑶C1551菌株419個蛋白基因編碼片段，共4168個蛋白，通過Invitrogen公司的BP酶將基因編碼片段連接到pD0NR221載體(購自Invitrogen)上,轉化到大腸桿菌DH5_Alpha中擴增，提取載體再通過LR酶(Invitrogen)換至經過改造的能夠表達GST標簽的pEGH_A載體(該載體在 “Jian Zhu，Heng Zhu, et al J.Virol.May2009vol.83ηο.105219-5231，，中公開過，公眾可從中國科學院生物物理研究所，上海交通大學，中國科學院武漢病毒研究所，廣東體必康生物科技有限公司獲得)上，再次轉化到大腸桿菌DH5-Alpha中擴增，提取質粒轉化到Pep4釀酒酵母菌株(該菌株在文獻“Heng Zhu, Michael Snyder, et al:NatureGenetics26, 283 - 289 (2000) do1: 10.1038/81576”中公開過，公眾可從中國科學院生物物理研究所，上海交通大學，中國科學院武漢病毒研究所，廣東體必康生物科技有限公司獲得)中。誘導培養基中培養，待其0D600為0.6-0.8時，加入終濃度為2g/L的半乳糖，誘導6h, 4000rpm離心收集菌，_80°C保存。
[0040]每IL誘導培養基(溶劑為水)中含有的組分如表I所示:
[0041]表I
【權利要求】
1.一種蛋白芯片，包括基片和與其連接的結核分枝桿菌基因組編碼的85%的蛋白質；且每種蛋白單獨成立一個檢測點。
2.根據權利要求1所述的蛋白芯片，其特征在于:所述結核分枝桿菌基因組編碼的85%的蛋白質為表6所不的4168種蛋白； 所述基片為載體玻片。
3.根據權利要求2所述的蛋白芯片，其特征在于: 所述蛋白芯片是分別將所述4168種蛋白點樣于載體玻片上制成的。
4.根據權利要求1-3中任一所述的蛋白芯片，其特征在于:所述結核分枝桿菌為結核分枝桿菌(Mycobacterium M.tuberculosis) H37Rv 和結核分枝桿菌(MycobacteriumM.tuberculosis)CDC1551。
5.含有權利要求1-4中任一所述的蛋白芯片的試劑盒。
6.權利要求1-4中任一所述的蛋白芯片或權利要求5所述的試劑盒在如下I)-5)中的應用: 1)篩選與結核病患者血清特異結合的蛋白或構建與結核病患者血清特異結合的蛋白庫； 2)篩選與環二鳥苷酸相互作用的結合分枝桿菌蛋白或構建與環二鳥苷酸相互作用的結合分枝桿菌蛋白數據庫； 3)篩選與蛋白激酶相互作用的結合分枝桿菌蛋白或構建與蛋白激酶相互作用的結合分枝桿菌蛋白數據庫； 4)篩選與非編碼RNA相互作用的結合分枝桿菌蛋白或構建與非編碼RNA相互作用的結合分枝桿菌蛋白數據庫； 5)篩選與巨噬細胞蛋白相互作用的結合分枝桿菌蛋白或構建與巨噬細胞蛋白相互作用的結合分枝桿菌蛋白數據庫。
7.根據權利要求6的應用，其特征在于: 所述蛋白激酶為PknB或PknE ； 所述非編碼RNA為MTS2823，其核苷酸序列為序列表中序列I ; 所述巨噬細胞蛋白按照如下方法制備:裂解所述巨噬細胞，收集上清液得到巨噬細胞蛋白。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于:所述巨噬細胞為單核巨噬細胞THP-1。
【文檔編號】G01N33/68GK103884847SQ201410095163
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月14日 優先權日:2014年3月14日
【發明者】張先恩, 陶生策, 畢利軍, 鄧教宇, 張治平, 江何偉, 周盈, 谷晶, 郭書娟, 張鴻泰, 王緒德, 鄧瑞萍, 王宗秀, 劉鐘慧, 顧佳, 李陽, 李文娟 申請人:中國科學院生物物理研究所, 上海交通大學, 中國科學院武漢病毒研究所, 廣東體必康生物科技有限公司