能夠特異性結合胃癌細胞中的ts/mdep蛋白的適配子的制作方法
【技術領域】
[0001] 本項發明屬生物檢測領域。
【背景技術】
[0002] 核酸適配子（aptamer)是一種生物大分子的人工單鏈寡核苷酸配體，通過 SELEX(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment)技術從隨機單 鏈寡核苷酸文庫中篩選獲得。SELEX技術（即系統進化指數富集技術)是20世紀90年代初 研制/發展起來的一種新的組合化學技術，其運用大容量的隨機寡核苷酸文庫，結合體外 PCR擴增技術，以指數富集與靶分子特異結合的寡核苷酸，經過多輪篩選，獲得親和力高、特 異性強的核苷酸適配子（aptamers)。該技術己成功運用于許多祀分子的篩選，包括金屬離 子、有機染料、藥物、蛋白質、氨基酸以及各種細胞因子等。這種方法具有簡便、快速、經濟 等特點，與其他組合化學庫如隨機膚/肽庫、抗體庫和噬菌體表面展示文庫相比，從寡核苷 酸文庫中篩選出的適配子具許多優勢：a.本身是寡核苷酸，分子量較小，可以化學合成，節 約成本。b.具有比抗體更高的親和性和特異性。c.便于標記，可以在不同部位有選擇性的 標記。d.重復性好，穩定性好，易于保存，對高溫和劇烈條件不敏感。因此，寡核苷酸適配 子/SELEX技術具有良好的應用前景，特別是在抗體工程領域。消減SELEX技術是識別癌與 非癌細胞間微小差異、篩選癌細胞特異性親和適配子的有力工具。
[0003] 核酸適配子篩選的基本步驟如下：設計并合成隨機單鏈寡核苷酸文庫；將文庫與 靶標共孵育，使文庫中能與靶標特異性結合的寡核酸與靶標形成復合物，分離復合物并洗 脫寡核酸，以洗脫的寡核酸為模板進行PCR擴增，制備成新的單鏈隨機寡核苷酸文庫，開始 下一輪篩選；重復數輪孵育-洗脫-擴增，與靶標高特異性和高親和力結合的核酸序列將 從文庫中篩選出來并被指數富集；對最后一輪篩選后制備的文庫進行克隆、測序，其中長度 及兩端序列與文庫相符者即為核酸適配子；測定各核酸適配子與靶標結合的特異性和親和 力，選出能高特異性和高親和力結合靶標者，即可應用于靶標的檢測分析。
[0004] 世界上與腫瘤相關的疾病中，胃癌占第二位，并且是亞洲人群中最常見的惡性腫 瘤，嚴重的危害著人類的健康。人們期望能闡明胃癌的發生發展機制，從而有效的預防和 治療這一惡性腫瘤。盡管大量的研宄證實胃癌的發生與多種因素有關包括寸大食、環境以 及細菌或病毒感染，如幽門螺旋桿菌的感染，近年來分子機制研宄發現眾多基因參與胃癌 的發生發展，如E-cadherin表達的缺失、p53基因、TGF-0、c-met、erbB-2和RUNX3等，這 些研宄解釋了胃癌部分發病機制，對于胃癌的詳細的分子發病機制我們還知之甚少。
[0005] 與正常細胞相比，肺瘤細胞的最根本的特征之一就是細胞周期調控異常，正常細 胞向惡性細胞轉化過程中，多基因變異積累賦予了腫瘤細胞特有的功能，如腫瘤細胞產生 許多自身的生長因子，對于抑止細胞生長的信號不敏感，逃避凋亡，具有無限的復制潛能， 均能歸結到變異的基因導致細胞周期調控異常，特別是細胞周期checkpoint異常，從而賦 予腫瘤細胞失控性生長的特性。現有技術中，比如CN101168566A公開了TS/MEDP蛋白在M 期的BGC823中表達最高，隨著細胞分裂的完成，其表達量逐漸降低。更重要的是在配對的 胃癌組織中表達，而正常胃粘膜中未見表達，還證實TS/MEDP基因在多種細胞增殖旺盛的 胚胎組織中表達，因此TS/MEDP基因在組織中具有如下表達特征：TS/MDEP在細胞增值旺 盛的胚胎組織高表達，成年后組織細胞中此基因被關閉，在腫瘤細胞中又出現高表達，符 合癌基因的表達規律。因此，鑒定該蛋白的表達量的多少，對于預測胃癌具有較高的利用價 值。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的是提供一種DNA適配子，能夠特異性結合胃癌細胞中的TS/MDEP蛋 白，可以來實現胃癌治療藥物運送的靶向性，可用于胃癌的診斷與治療。
[0007] 本發明采用以下技術方案： 體外合成一個含有38個隨機序列的單鏈DNA文庫，通過體外轉錄構建出單鏈RNA適 配子隨機文庫；采用酵母表達的方法體外表達丁型肝炎病毒表面蛋白，以其為靶蛋白，采 用SELEX技術篩選具有高親和力的表面抗原特異性RNA適配子；通過結構預測軟件RNA StructureProgram分析預測適配子的二級結構；通過膜結合測定實驗、凝膠阻滯實驗鑒定 篩選適配子對靶蛋白的特異性和親和力，得到了多個與表面抗原親和力高、特異性強的適 配子。所述的適配子都能形成各自的特異莖環結構。所述適配子能特異性、高親和力地結 合胃癌TS/MDEP蛋白。所述適配子序列如下： TS-002：CTCTCCTTAGACTATTACAATCTATTCATATGTTACAA TS-005:GGTAACTAGCGTTACTGCTAGCTCTCCTTAGACTATTACAATCTATTCATATGTTACAATGCATAA GGCATCATTGGAA TS-006:GGTAACTAGCGTTACTGCTAGATGACACATTAACCCTCCCTATCTCAAACAATTTCAAATGCATAA GGCATCATTGGAA TS-013:GGTAACTAGCGTTACTGCTAGCTTCTCAATACAATATTCAAATTTCTATAACACTATCATGCATAA GGCATCATTGGAA TS-014:GGTAACTAGCGTTACTGCTAGTCAATTCGCAAATTAACCTCCGCTCACACTACACCCACTGCATAA GGCATCATTGGAA TS-015:GGTAACTAGCGTTACTGCTAGCCGCACCTTATTAACACAACCTACCTTATTTCCTACACTGCATAA GGCATCATTGGAA TS-017:GGTAACTAGCGTTACTGCTAGACATTACATAATACATTCATCCGCCAACACACCAACACTGCATAA GGCATCATTGGAA TS-019:GGTAACTAGCGTTACTGCTAGACACCAACCACTCACTCTTCCTATTGTTTCACATATTCTGCATAA GGCATCATTGGAA TS-024:GGTAACTAGCGTTACTGCTAGCTCTCCACATACCTTTTTATCAAGAATATATAACAACCTGCATAA GGCATCATTGGAA TS-026:GGTAACTAGCGTTACTGCTAGATATAAGAATACCCAACACCTCCTCTCCACTCCTAAATTGCATAA GGCATCATTGGAA TS-028:GGTAACTAGCGTTACTGCTAGCTCCTAGAATACAATCGCTCAAACTCTACCTAAAGATATGCATAA GGCATCATTGGAA TS-030:GGTAACTAGCGTTACTGCTAGTAGATCATACAATATCATTATTCCGCCTACATTCCAATTGCATAA GGCATCATTGGAA 本發明的有益效果：（1)獲得了一種能夠特異高效結合胃癌細胞中TS/MDEP蛋白的適 配子。該適配子可以大量人工制備，方法簡單，成本低廉。（2)以核酸適配子為基礎可以制 備成為靶向胃癌細胞的診斷和治療藥物。
【具體實施方式】
[0008] 實施例ITS/MDEP蛋白特異性結合DNA適配子的SELEX篩選 采用本領域常規的TS/MDEP蛋白表達的方法。根據已知的基因序列，通過常規基因合 成或者基因組調取的方式來獲得相應的基因序列，采用酵母表達的方法體外表達TS/MDEP 蛋白，獲得了相應的蛋白，命名為TS/MDEP。
[0009] 化學合成初始寡核苷酸隨機文庫及引物，序列如下：（5'-GGTAACTAGCGTTACTGCTA G--N38--TGCATAAGGCATCAITGGAA-3')，其中N38為38個隨機寡核苷酸； 引物PI:GGTAACTAGCGTTACTGCTAG; 引物P2 :TTCCAATGATGCCTTATGCA。
[0010] 將單鏈DNA文庫擴增為雙鏈DNA，產物經2%瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收純化；以 回收的雙鏈DNA為模板，體外轉錄出單鏈RNA隨機文庫，轉錄產物經PAGE純化。70ygRNA 文庫經硝酸纖維素膜反篩去除與膜結合的RNA分子，然后與2ugHiAg37°C孵育30min， 反應液經硝酸纖維素膜濾過，洗滌濾膜；然后將濾膜剪碎，置于洗脫緩沖液（6mol/L尿素， 0? 6mol/L醋酸按，1.5mmol/LEDTA，0. 15%SDS)中煮沸4min，離心，取上清，無水乙醇沉 淀RNA，并重新溶解于20y1DEPC水中；以RNA為模板RT-PCR擴增雙鏈DNA，體外轉錄 出RNA文庫用于下一輪篩選；每輪篩選過程中RT-PCR得到雙鏈DNA文庫，以該雙鏈DNA為 模板體外轉錄出RNA適配子庫，篩選共進行10輪。
[0011] 實施例2特異性高親和力的TS/MDEP結合適配子的獲得 將RNA適配子分別取1.5yg，用牛小腸堿性磷酸酶（CIP) 37°C消化lh，純化回 收去磷酸化的RNA;通過T4多核苷酸激酶標記[y-32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末 端。lOnmol放射性標記的RNA適配子分別與不同濃度（l-200nM)的TS/MDEP37°C孵育 30min，各組反應液經硝酸纖維素膜濾過，洗滌濾膜，干燥濾膜，液閃計數儀測定濾膜上殘留 的放射量，同一樣品平行做兩次測定。計算各個適配子與TS/MDEP的解離常數。結果如下：
【主權項】
1. 一種識別TS/MDEP蛋白寡核苷酸序列，其特征在于為包括SEQIDNo. 1-12任一條序 列所示，或者在該序列的基礎上進行的一個或幾個核苷酸的替換，并保留其活性。
2. 權利要求1所示的寡核苷酸序列在檢測胃癌中的應用。
3. 權利要求1所示的寡核苷酸序列用于制備識別TS/MDEP蛋白的試劑盒應用。
4. 權利要求1所示的寡核苷酸序列用于制備檢測胃癌的試劑盒應用。
【專利摘要】本發明公開了一種靶向人TS/MDEP蛋白的核酸適配子及其序列。本發明應用新的組合化學技術SELEX，以TS/MDEP蛋白為靶蛋白，從單鏈RNA隨機文庫中篩選出了能與TS/MDEP蛋白特異性結合的DNA適配子。所述適配子在其隨機序列區域能形成特殊的莖環結構，能特異性、高親和力地結合TS/MDEP蛋白或靶向結合至胃癌細胞。該RNA適配子為胃癌診療領域提供了一種特異高效的標記分子，并為開發胃癌診斷試劑與治療藥物提供了新的選擇。
【IPC分類】C12N15-115, G01N33-68
【公開號】CN104818278
【申請號】CN201510183245
【發明人】劉紅衛
【申請人】劉紅衛
【公開日】2015年8月5日
【申請日】2015年4月17日