結核分枝桿菌非編碼rna的系統發現、標注和功能研究的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子診斷領域，具體涉及miRNA作為結核分枝桿菌潛伏感染標記物的 應用。
【背景技術】
[0002] 結核分支桿菌引起感染和死亡。世界衛生組織估算全球1/ 3的人口受結 核菌感染，目前結核病控制的H大挑戰：多重耐藥結核菌（multi化Ug resistance tuberculosiscle bacillus , MDR-TB)的流行 W及人類免疫缺陷病毒化uman immune deficien巧virus，HIV)感染、流動人口多，使中國結核病的控制難度巨大。世界衛生 組織估計全球約有H分之一的人口，即20億人是潛伏性感染者。在全球范圍內結核病仍是 主要傳染病之一，每年有約900萬例新發患者和200萬例死亡患者。對結核病自然史的研 究表明，人初次感染結核分枝桿菌后，約有5%的感染者會在2年內發病，而95%人成為潛伏 性感染者。結核分枝桿菌潛伏性感染是指宿主感染結核分枝桿菌后未發病，無活動性結核 的臨床癥狀、影像學改變和細菌學證據，但PPD試驗陽性或干擾素釋放試驗陽性的一種特 殊狀態。潛伏性感染者一生中約有5%-10%的概率發展成活動性結核病患者。在結核病低 流行地區，對潛伏性感染者者進行篩查和預防性治療是結核病控制的重要組成部分。送一 策略能將潛伏性感染者后續發病的風險降低90%左右。為了進一步提高結核病的診斷、治 療和預防控制水平，現在迫切需要更為精確快速的診斷新技術用于臨床標本分離和鑒定 結核分支桿菌。
[0003] 目前臨床現有結核病診斷技術根據每種技術所針對的祀標不同可分為H大類。微 生物學方法、血清學方法、分子生物學方法。
[0004] 微生物學方法W涂片和各種培養方法為代表。其中的涂片法比較迅速，一般1個 小時可W出結果，但是陽性率只有20%左右。羅氏培養法目前作為結核病診斷的金標準，所 需要周期長，一般4-8周，而結核病強化期的治療是2個月。如果等培養結果出來在對患者 進行干預，將會延誤治療；但如果不等培養結果即進行治療，又可能因為誤診使患者承受抗 結核藥物副作用所帶來的痛苦。
[0005] 而關于血清學方法，Wffi)已經發表公開聲明，目前市場上所應用的血清學結核病診 斷方法都不能取得滿意的結果。
[0006] 目前針對結核分枝桿菌感染狀態的方案有兩種；PPD和干擾素釋放試驗。PPD實 驗簡單廉價，但是其敏感性、特異性較低，不能區分卡介苗，而干擾素釋放試驗診斷效能高， 但是其步驟繁瑣，價格昂貴難W普及。
[0007] 分子生物學方法是近來發展比較迅速的一個領域，各種方法都是W結核分枝桿菌 的RNA或者DNA為祀標。但是該類方法所面臨的問題是未能找到一個另人滿意的祀標。

【發明內容】

[0008] 本發明的目的在于提供miRNA作為結核分枝桿菌潛伏感染標記物的應用。
[0009] 本發明所采取的技術方案是： 用于檢測小分子 RNA hsa-miR-1246 和 / 或 hsa-miR-375 和 / 或 hsa-miR-30e-5p 和 / 或hsa-miR-410-化的特異性引物在制備結核分枝桿菌潛伏感染診斷試劑盒中的應用。
[0010] 檢測 hsa-miR-1246 的引物為： RT-PCR 引物；CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAGGCCA (沈Q ID NO. 1)， realtime-F;ACACTCCAGCTGGGAATATAACACAGATG (沈Q ID NO. 2)， realtime-R;TGGTGTCGTGGAGTCG (沈Q ID NO. 3); 檢測hsa-miR-375的引物為： RT-PCR 引物；CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCACGCGA (沈Q ID NO. 4)， realtime-F;ACACTCCAGCTGGGTTTGTTCGTTCGGCTC (沈Q ID NO. 5)， realtime-R;TGGTGTCGTGGAGTCG (沈Q ID NO. 6); 檢測hsa-miR-30e-5p的引物為： RT-PCR 引物；CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTTCCAGT (沈Q ID NO. 7)， realtime-F;ACACTCCAGCTGGGTGTAAACATCCTTGAC (沈Q ID NO. 8)， realtime-R;TGGTGTCGTGGAGTCG (沈Q ID NO. 9); 檢測hsa-miR-410-化的引物為： RT-PCR 引物；CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAGGCCA (沈Q ID NO. 10)， realtime-F;ACACTCCAGCTGGGAATATAACACAGATG (沈Q ID NO. 11)， realtime-R;TGGTGTCGTGGAGTCG (沈Q ID NO. 12)。
[0011] 一種結核分枝桿菌潛伏感染的診斷試劑盒，其包括檢測四種miRNA的特異性 PCR 引物，其特征在于，所述 miRNA 包括 hsa-miR-1246、hsa-miR-375、hsa-miR-30e-5p、 hsa-miR-41〇-3p。
[0012] 本發明的有益效果是： 本發明通過收集臨床經干擾素釋放試驗證實的潛伏感染者血清與正常人群血清，通過 全基因組測序技術及生物信息學分析得到結核分枝桿菌潛伏感染者血清中miRNA表達譜， 然后通過信息分析得到結核分枝桿菌潛伏感染人群血清中miRNA表達量最高且與正常對 照人群差異最大的4種miRNA。高表達量保證了 W此祀標做為檢測方法的靈敏度，同時與正 常對照人群差異最大保證了該方法的特異性。基于上述原則篩選得到的4種miRNA,本發明 構建了一種W miRNA為標記物，通過逆轉錄、實時英光定量PCR技術對結核病進行診斷的試 劑盒。該試劑盒的檢測結果準確可靠，操作簡便，適于推廣應用。
【附圖說明】
[0013] 圖1 ;引物烙解曲線圖； 圖2;引物烙解曲線圖； 圖3 PCR擴增產物電泳圖； 圖4實時英光定量結果； 圖5深度測序技術流程； 圖6血清標本中RNA的長度分布情況； 圖7生物信息學分析圖； 圖8感染組血清中所有小RNA的表達情況。
【具體實施方式】
[0014] 下面結合實施例對本發明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0015] 一、可用作結核分枝桿菌潛伏感染標記物的小分子RNA的篩選 利用Solexa高通量測序技術，分析結核分枝桿菌潛伏感染組和正常人群組血清中 Small RNA表達譜的差異。首先我們分別W兩組血清中miRNA表達量降序排列，得到兩組血 清中表達量最高的前20種miRNA。然后求兩組血清中高表達miRNA種類的交集，得到10種 在兩組樣本中表達量最高的miRNA且送10種miRNA在兩組樣本中的表達差異具有統計學 意義。然后我們W化ld-change(log2 S2/S1)分別到升序和降序排列，然后取前4種miRNA， 送樣我們就得到了 4 種化sa-miR-1246、hsa-miR-375、hsa-miR-30e-5p、hsa-miR-41〇-化） 在人群血清中表達量最高且在結核分枝桿菌潛伏和正常人群組血清中表達量差異最大的 miRNA用于結核分枝桿菌潛伏感染診斷標志物。
[001引 材料和方法 1. 1材料 1. 1. 1樣本來源 50例結核分枝桿菌潛伏感染者血清由廣東省結核病控制中必參比室提供，50例健康 志愿者血清取自廣東省結核病控制中必生物樣本庫。
[0017]樣本采集與保存 抽取靜脈血4~5 ml于2支真空促凝管中，室溫靜置約30 min，4000巧m離必5 min, 吸取血清均分至2支2 ml低溫凍存管中，-70 °C冰箱保存備用。
[001引試劑與儀器 一次性真空促凝管購自廣州陽普醫療科技股份有限公司；Total RNA Purification Kit(T服-1001)為美國LC SCIENCES公司產品；從總RNA中分離miRNA、RT-PCR擴增、cDNA樣 品準備、DNA成簇擴增及測序等試劑使用Illumina公司配套產品；序列測定應用Illumina HiSeqTM 2000測序儀系統。
[0019] 方法 1. 2. 1血清總RNA提取 從一70 C冰箱取出每例備用血清樣本1支，置室溫待其溶解；從感染組、對照組的樣 本中各取0.1 ml血清按組別分別加至2支50 ml離必管中，制備感染組、對照組混合血清各 1管；嚴格按LC Sciences RNA提取試劑盒說明書提取血清總RNA。
[0020] 血清 Smal IRNA測序 血清miRNA分離、純化、CDNA文庫建立、擴增與測序、生物信息學分析由武漢華大基因 研究院協助完成，實驗操作嚴格按照試劑和儀器說明書進行。
[0021] 主要實驗流程包括；從總RNA中分離miRNA- 5'接頭連接一 3'接頭連接 一 RT-PCR擴增一 miRNA文庫的純化一文庫的檢測一 DNA在Cluster Station成簇擴 增一 Illumina HiSeqTM 2000測序儀上的測序一對10~30 nt miRNA干凈序列采用 GenomeStudio軟件進行生物信息學分析，得到兩種人群血清中Small RNA的表達譜。
[0022] 首先我們分別W兩組血清中miRNA表達量降序排列，得到兩組血清中表達量最高 的前20種miRNA。然后求兩組血清中高表達miRNA種類的交集，得到10種在兩組樣本中表 達量最高的miRNA且送10種miRNA在兩組樣本中的表達差異具有統計學意義。然后我們 W化Id-change (log2 S2/S1)分別到升序和降序排列，然后取前4種miRNA,送樣我們就得 到了 4 種（hsa-miR-1246、hsa-miR-375、hsa-miR-30e-5p ,hsa-miR-410-化）在人群血清中 表達量最高在結核分枝桿菌潛伏和正常人群組血清中表達量差異最大的miRNA用于結核 分枝桿菌潛伏感染診斷標志物 然后采用實時英光定量PCR的方法對送4種miRNA在不同人群血清中的表達量進行分 析比較，進一步驗證其做為結核分枝桿菌感染診斷標志物的價值。
[0023] 二、miRNA的 realtime-PCR檢測方法 miRNA realtime-PCR引物設計方法： 1) stem-loop RT引物設計；基于通用的莖環結構，只需要按照不同的miRNA序列修改 最末端6個堿基即可。通用莖環結構序列為；GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGA TACGAC (沈Q ID NO. 13) 例如設計 miR-1 (UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU)(沈Q ID NO. 14)的 RT 引物，只需在通用 莖環序列后架上miRNA3'末端的6個堿基的反向互補序列，即 GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACATACAT (SEQ ID NO. 15) 2) realtime上游引物設計；miRNA序列除去3'端6個堿基的剩余部分作