和E61R互相作為引物和模板擴增出片段6:

[0139]以擴增片段11+7+8和擴增片段9為模板，以E6BGLF和E64R為引物，擴增出片段11+7 +8+9:
[0141]以擴增片段11+7+8+9和擴增片段10為模板，以E6BGLF和E65R為引物，擴增出片段 11+7+8+9+10(該片段含有E基因）：
[0143] 第一輪PCR的反應體系：10XPCR緩沖液5yl、dNTPs 4μ1、引物E6BGLF 5μ1、引物 E61F 0·5μ1、引物E61R 0·5μ1、引物E62F 0·5μ1、引物E62R 0·5μ1、引物E63F 0·5μ1、引物 E63R 0·5μ1、引物E64F 0·5μ1、引物E64R 0·5μ1、引物E65F 0·5μ1、引物E65R 5yl、DNA聚合 酶ΙμL、無菌水26μ1，總計50μ1。
[0144] 第一輪PCR的反應條件：95°C預變性5min; 94°C變性30s，50°C退火30s，72°C延伸 2min，30 個循環；72°C 延伸 lOmin; 16°C 降溫 2min。
[0145] (2)以ΙμL第一輪PCR擴增產物作為模板，用表1中的E6BGLFF和E65R為引物，進行第 二輪PCR擴增，得到第二輪PCR擴增產物(即，含有E基因的片段KE)，序列如下：
[0147] 第二輪PCR的反應體系：第一輪PCR擴增產物ΙμL、10 X PCR緩沖液5μ1、dNTPs 4μ1、 引物E6BGLFF 5μ1、引物E65R 5yl、DNA聚合酶ΙμL、無菌水29μ1，總計50μ1。
[0148] (3)電泳回收目的片段：
[0149] 將步驟(2)得到的第二輪PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖2所示。
[0150] 圖2中，1:DNA分子量標準（由上至下條帶大小依次為500bp、400bp、300bp、200bp、 150bp、100bp、50bp); 2:步驟(2)得到的第二輪PCR擴增產物;箭頭所指為含有E基因的片段 KE〇
[0151] 在長波紫外線照射下，用干凈的手術刀片在膠上切下要回收的含有E基因的片段 KE的瓊脂塊，放入無菌的離心管中。參照瓊脂糖DNA回收試劑盒中的說明書回收該片段并進 行測序，測序結果正確，定量后，將其貯存于_20°C備用。
[0152] 4、含有C基因的片段KC與含有E基因的片段KE的連接
[0153] (1)用BamH頂每切步驟2得到的含有C基因的片段KC，得到酶切產物1。酶切體系如 下:含有C基因的片段KC 15μ1、10ΧΚ緩沖液3yl、BamH I ΙμL、無菌水11μ1，總計30μ1。
[0154] (2)用Bgl Π 酶切步驟3得到的含有Ε基因的片段KE，得到酶切產物2。酶切體系如 下:含有E基因的片段ΚΕ 15μ1、10ΧΗ緩沖液3yl、Bgl II ΙμL、無菌水11μ1，總計30μ1。
[0155] (3)將酶切產物1和酶切產物2用T4DNA連接酶連接，獲得連接產物。連接體系如下： 酶切產物11〇μ1、酶切產物210μ1、10 X連接緩沖液3μ1、T4DNA連接酶ΙμL、無菌水
[0156] 6μ1，總計 30μ1。
[0157] (4)用步驟(3)得到的連接產物作為模板，用表1中的C101F和E65R為引物，進行PCR 擴增，得到PCR擴增產物(含有CE基因的片段KCE)。PCR的反應體系:連接產物ΙμL、10 X PCR緩 沖液5yl、dNTPs 4μ1、引物C101F ΙμL、引物E65R lyl、DNA聚合酶ΙμL、無菌水37μ1，總計50μ 1〇
[0158] 含有CE基因的片段KCE序列如下：
[0160]該片段也可直接人工合成。
[0161] (5)電泳回收目的片段
[0162] 將步驟(4)得到的PCR擴增產物(含有CE基因的片段KCE)進行1 %瓊脂糖凝膠電泳， 結果如圖3所不。
[0163] 圖3中，1:步驟(4)得到的PCR擴增產物(含有CE基因的片段KCE); 2: DNA分子量標準 (由上至下條帶大小依次為l〇〇〇〇bp、7000bp、4000bp、2000bp、lOOObp、500bp、250bp)。
[0164] 在長波紫外線照射下，用干凈的手術刀片在膠上切下要回收的含有CE基因的片段 KCE的瓊脂塊，放入無菌的離心管中。參照瓊脂糖DNA回收試劑盒中的說明書回收該片段并 進行測序，測序結果正確，定量后，貯存于_20°C備用。
[0165] 5、表達載體的構建
[0166] 將步驟4獲得的含有CE基因的片段KCE克隆至pET-30a( + )(invitrogen公司產品） 載體中，再將其轉化大腸桿菌BL21 (DE3)宿主菌(大連TaKaRa公司產品），經篩選獲得表達重 組融合蛋白CE的CE/pET-30a大腸桿菌工程菌。
[0167] 具體步驟如下：
[0168] (1)酶切
[0169] 將步驟4獲得的含有CE基因的片段KCE和pET_30a( + )表達載體分別用Nde I和Xho I進行雙酶切。
[0170] 兩個酶切體系分別如下：
[0171] 酶切體系1:含有CE基因的片段KCE 3μ1、10ΧΗ緩沖液8yl、Nde I 2yl、Xho I 2μ1、 無菌水65μ1，總計80μ1。
[0172] 酶切體系2:pET-30a( + )3μl、10XH緩沖液8μl、NdeI2μl、XhoI2μl、無菌水
[0173] 65μ1，總計 80μ1。
[0174] 將兩個酶切體系置于37°C孵育3h，分別得到含有CE基因的片段KCE的酶切產物和 pET-30a (+)質粒的酶切產物。
[0175] (2)電泳回收目的片段
[0176] 將步驟（1)得到的pET_30a( + )質粒的酶切產物和含有CE基因的片段KCE的酶切產 物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳，在長波紫外線照射下，用干凈的手術刀片在膠上切下要回收 DNA的瓊脂塊，放入無菌的離心管中。參照瓊脂糖DNA回收試劑盒中的說明書分別回收得到 615bp的含有CE基因的片段KCE的酶切回收片段和5234bp的pET-30a( + )質粒的酶切回收片 段。
[0177] 將pET_30a( + )質粒、pET_30a( + )質粒的酶切產物、pET_30a( + )質粒的酶切回收片 段、含有CE基因的片段KCE、含有CE基因的片段KCE的酶切產物、含有CE基因的片段KCE的酶 切回收片段進行1 %瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖4所示。
[0178] 圖4中，1:DNA分子量標準；2:pET_30a( + )質粒；3:pET_30a( + )質粒的酶切產物;4: pET-30a( + )質粒的酶切回收片段;5:含有CE基因的片段KCE;6:含有CE基因的片段KCE的酶 切產物;7:含有CE基因的片段KCE的酶切回收片段。
[0179] 圖4表明，pET_30a( + )及含有CE基因的片段KCE的酶切產物均得到回收，且純度較 好。
[0180] (3)基因片段連接
[0181]將步驟(2)回收純化的含有CE基因的片段KCE的酶切回收片段與pET_30a( + )質粒 的酶切回收片段定量后，按1:1的摩爾比混合，進行如下連接反應，得到連接產物。
[0182] 連接反應體系（10μ1): 2 X連接緩沖液5μ1、A/pET_30a( + )質粒的酶切回收片段1μ 1、Β/含有CE基因的片段KCE的酶切回收片段lyl、T4DNA連接酶ΙμL、無菌水補至10μ1。混勻后 置于16°C連接過夜，75°C滅活lOmin，冰浴后直接進行轉化。
[0183] (4)連接產物的轉化
[0184] 次日取步驟(3)得到的連接產物5μ1加入含有100μΙ大腸桿菌BL21(DE3)感受態細 胞的離心管中，冰浴〇.5h;放入42°C水浴箱熱休克90s，迅速取出冰浴2min;加入LB培養液 400yl，37°C恒溫搖床培養lh;加入X-Gal 60yl，IPTG 4μ1，混勻，取出200 - 400μ1涂布于含 有50μg/ml硫酸卡那霉素的LB平板上。倒置平板，放37°C恒溫培養箱培育過夜至單菌落生 長。
[0185] (5)質粒的提取
[0186] 根據藍白斑篩選，隨機挑取2個白色單菌落，分別命名為pET-30a-CE_l菌落和pET-30a-CE-2菌落，并分別接種于5ml含有50μg/ml卡那霉素的LB液體培養基中，37°C恒溫振蕩 培養過夜。根據《分子克隆》堿裂解方法，小量提取質粒，分別得到重組質粒pET-30a-CE-l和 pET-30a-CE-2。將重組質粒pET-30a-CE-l和pET-30a-CE-2進行瓊脂糖凝膠電泳分析，結果 如圖5所示。
[0187] 圖5中，1: DNA分子量標準;2:載體質粒pET_30a( + ); 3:重組質粒pET-30a-CE_l; 4: 重組質粒 pET-30a-CE-2。
[0188] 圖5表明，重組質粒pET-30a-CE_l和pET-30a-CE_2的大小均與預期相符。將重組質 粒pET-30a-CE-l和pET-30a-CE-2進一步測序，測序結果表明重組質粒的大小均為5857bp。
[0189] (6)重組質粒的鑒定 [0190]①酶切鑒定
[0191] 分別以重組質粒pET-30a-CE_l和pET-30a-CE_2為模板，用Nde I和Xho I進行雙酶 切鑒定。將酶切產物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，結果如圖6所示。
[0192] 圖6中，M:DL2000DNA Marker;l:含有CE基因的片段KCE的Nde I+Xho I雙酶切產 物；2:重組質粒pET-30a-CE-l的Nde I+Xho I雙酶切產物；3:重組質粒pET-30a-CE-2的Nde I+Xho I雙酶切產物。
[0193] 圖6表明，重組質粒的酶切片段大小與預期相符（含有CE基因的片段大小為 615bp)，為陽性重組質粒。將該種質粒命名為CE/pET-30a，其來源的菌命名為CE/pET-30a大 腸桿菌工程菌。
[0194]②序列測定
[0195] 挑選一個CE/pET_30a大腸桿菌工程菌克隆送上海生工生物技術有限公司進行T7 通用引物正向測序，測序圖譜如圖7所示。
[0196] 測序結果如SEQ ID No.4所示。SEQ ID No.4中，第54-59位為限制性核酸內切酶 Ndel酶切識別位點5 '-CATATG-3 '（包括起始密碼子5 '-ATG-3 '），第57-356位為CFP10蛋白抗 原表位的編碼基因（C基因）序列，第357-380位為連接臂的編碼基因序列5 ' -GGTGGTGGCGGATCTGGTGGCGGT-3'，第381-665位為優化后的ESAT6蛋白抗原表位的編碼基因 (E基因）序列，第666-668位為終止密碼子5 ' -TAA-3 '，第670-675位為限制性核酸內切酶Xho I酶切識別位點5'-CTCGAG-3'。結果表明，CE/pET-30a質粒中的CE基因序列（即SEQ ID No.4 中第57-665位)與設計的序列（SEQ ID No. 1中第4-612位)完全一致。
[0198] 三、CE/pET_30a大腸桿菌工程菌的誘導表達及鑒定
[0199] 1、將CE/pET-30a大腸桿菌工程菌接種于6ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培養液 中，置37°C、200rpm恒溫振蕩器培養8h后，按體積百分含量1 %轉種到50ml含50μg/ml硫酸卡 那霉素的LB培養液中，置37°C、200rpm恒溫振蕩器培養至OD600為0.6 -0.9時，加入終濃度為 0.5mmo 1 /L的IPTG，誘導1 _4hr，得到菌液。
[0200]將1 X載樣緩沖液10μ1加入來自40μ1菌液的沉淀樣本，混懸后，置100°C沸水浴 5min，于lOOOOrpm離心5min后，取上清液10μ1進行SDS-PAGE(分離膠濃度為12%，濃縮膠濃 度為5%)，電泳條件為:積層膠恒壓80V，分離膠恒壓120V，待溴酚藍電泳至凝膠底部，停止 電泳。用考馬斯亮藍R250染色液染色6h，用脫色液脫色至條帶清晰。
[0201 ] CE/pET-30a大腸桿菌工程菌IPTG誘導前后的SDS-PAGE結果如圖8所示。
[0202]圖8中，1:蛋白質分子量標準；2: CE/pET-30a大腸桿菌工程菌IPTG誘導前；3: CE/ pET-30a大腸桿菌工程菌IPTG誘導1小時;4: CE/pET-30a大腸桿菌工程菌IPTG誘導2小時；5: CE/pET-30a大腸桿菌工程菌IPTG誘導3小時；6:CE/pET-30a大腸桿菌工程菌IPTG誘導4小 時;箭頭所指為重組融合蛋白CE的條帶。
[0203] 圖8表明，CE/pET_30a大腸桿菌工程菌菌體在相對分子質量2103?a位置附近有濃 重的表達條帶出現，IPTG