抗乙肝e抗原的綠色熒光抗體的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種抗乙肝e抗原的綠色熒光抗體的制備方 法。
【背景技術】
[0002] 乙肝病毒（HBV)慢性感染是導致肝纖維化、肝硬化和肝癌的主要原因，每年有近 100萬人死于HBV慢性感染引起的肝硬化或肝癌等疾病。目前中國有近1億HBV慢性感染人 群，每年仍有10萬例新發HBV感染者。
[0003]乙肝e抗原的定量是醫生判斷病情和指導治療的重要依據。受技術所限，乙肝e抗 原的檢測一直處于手工定性或者半定量狀態。最近，國外的公司有通過化學顯色的方法來 定量乙肝e抗原，然而化學顯色方法靈敏度低，檢測不到血液中低豐度的乙肝e抗原，會給乙 肝e抗原的檢測帶來誤判。熒光發光檢測的方法靈敏度高，可以檢測到樣本中單個拷貝的靶 標。
[0004] 基于此，有必要設計一種抗乙肝e抗原的綠色熒光抗體的制備方法，用來大幅度提 高乙肝e抗原檢測的靈敏度，實現乙肝e抗原的精確定量檢測，輔助加強對乙型肝炎的發病 的監控力度。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的在于提供一種抗乙肝e抗原的綠色熒光抗體的制備方法，旨在提高 乙肝e抗原的檢測靈敏度、性質穩定性和特異性，適用于乙肝e抗原的精確定量檢測。
[0006] 為實現上述目的，本發明提供一種抗乙肝e抗原的綠色熒光抗體的制備方法，所述 抗乙肝e抗原的綠色熒光抗體的制備方法包括如下步驟：
[0007] S1:獲得M.Barkeri PylRS突變庫lib-PylRS-pBK;
[0008] S2:獲得7-羥基香豆素賴氨酸；
[0009] S3:篩選CouKRS-pBK質粒，該質粒中包含特異識別7-羥基香豆素的吡咯賴氨酸氨 酰-tRNA合成酶突變體CouKRS的基因序列coukrs;
[0010] S4:合成抗乙肝e抗原抗體的DNA序列，將所述抗乙肝e抗原抗體的DNA序列與質粒 口1^0重組，獲得大腸桿菌表達質粒3]11:;[-!113648-4丨3811^0;
[0011] S5:將步驟S3中的CouKRS-pBK質粒和步驟S4中的anti-HBeAg-4tag-pBAD質粒按照 第一預設比例混合，經過電擊轉化，導入到大腸桿菌ToplO中，經抗性篩選，獲得菌株A;
[0012] S6:將步驟S5獲得的菌株A接種培養，在培養基中添加特定的物質，對菌株A進行培 養、離心、超聲破碎以及色譜柱純化得到抗乙肝e抗原綠色熒光抗體。
[0013] 優選地，所述步驟S1包括如下步驟：
[0014] 5101:人工合成18&吐6^?711?的0嫩序列；
[0015] S102:將上述合成的M.Barkeri PylRS的DNA序列連接到pBK質粒上，獲得重組質粒 PylRS-pBK；
[0016] S103 :設計定點突變引物，所述定點突變引物包括引物f-L274麗K、引物r-L274NNK、引物f-L270NNK、引物r-L270NNK、引物f-N311F313NNK、引物r-N311F313NNK、引物 f-Y349NNK 和引物r-Y349NNK;
[0017] S104:以所述重組質粒PyIRS-pBK為模板，以所述引物f-L274NNK和引物r-L274NNK 為引物，通過聚合酶鏈式反應，獲得突變庫1;
[0018] S105:以所述突變庫1為模板，以所述引物f-L270NNK和引物r-L270NNK為引物，通 過聚合酶鏈式反應，獲得突變庫2;
[0019] S106:以所述突變庫2為模板，以所述引物f-N311F313NNK和引物r-N311F313NNK為 引物，通過聚合酶鏈式反應，獲得突變庫3;
[0020] S107:以所述突變庫3為模板，以所述引物f-Y349NNK和引物r-Y349NNK為引物，通 過聚合酶鏈式反應，獲得突變庫4;
[0021] S108:所述突變庫1、突變庫2、突變庫3和突變庫4按照第二預設比例混合，獲得用 于7-羥基香豆素篩選用的M. Barkeri Py 1RS突變庫1 ib-PyIRS-pBK。
[0022] 優選地，所述第二預設比例為1:1:32:1。
[0023] 優選地，所述步驟S2包括如下步驟：
[0024] S201:取第一預設量的間苯二酚，溶于水中，并加熱到90°C，滴加第二預設量的蘋 果酸，反應2小時后即可得到7-羥基香豆素 A;
[0025] S202:取第三預設量的上述7-羥基香豆素 A、賴氨酸和Licl水溶液于60°C攪拌，經 過12小時;經液相色譜分離，濾膜過濾除菌，得到7-羥基香豆素母液C。
[0026] 優選地，所述7-羥基香豆素母液C經過0.22微米濾膜過濾除菌。
[0027] 優選地，所述7-羥基香豆素母液C的濃度設定為100mM。
[0028] 優選地，所述第一預設比例為1: 1。
[0029] 優選地，所述特定的物質為7-羥基香豆素母液C，卡那霉素，四環素，L-阿拉伯糖組 成的混合物。
[0030] 優選地，所述步驟S6包括如下步驟：
[0031] S601:將步驟S5獲得的菌株A接種于LB液體培養基中，并置于37°C搖床中培養12小 時，獲得擴增用的菌種母液B;
[0032] S602:將所述菌種母液B按照1:100的體積比，接種于體積為1L的LB液體培養基中， 37°C搖床培養2小時，獲得培養液C;
[0033] S603:在所述培養液C中，添加7-羥基香豆素母液C，卡那霉素，四環素，L-阿拉伯糖 10mL 37攝氏度，200轉速，培養7小時，獲得培養液D;
[0034] S604:取所述培養液D，分別置于離心管中離心，獲得大腸桿菌沉淀組1;
[0035] S605:將所述大腸桿菌沉淀組1加入無菌水，漩渦震蕩重懸，獲得大腸桿菌沉淀組 2；
[0036] S606:將所述大腸桿菌沉淀組2分別置于-80°C的冰箱，30min后取出，室溫下融化；
[0037] S607:將S606中融化的大腸桿菌沉淀組2中，加超聲緩沖液;置于超聲破碎儀上進 行破碎，離心，獲得大腸桿菌沉淀組2相應的上清液組1;
[0038] S608:將所述上清液組1經鎳離子親和柱，分離純化，獲得抗乙肝e抗原的綠色熒光 抗體。
[0039] 優選地，所述超聲破碎儀的功率為25瓦，工作時間為5秒，間歇時間為10秒，工作環 境為4攝氏度。
[0040] 本發明提供的抗乙肝e抗原的綠色熒光抗體的制備方法通過合成M.Barkeri物種 的吡咯賴氨酸氨酰-tRNA合成酶(PylRS)的DNA序列，并將所述DNA序列連接到pBK質粒上獲 得PylRS-pBK;通過"一步飽和突變"的方法，構建PylRS酶活力中心的突變庫lib-PylRS-pBK;將lib-PylRS-pBK電擊轉化至包含有篩選質粒pREP的篩選ToplO感受態中，制備篩選用 大腸桿菌;合成香豆素賴氨酸;篩選重組了特異識別香豆素賴氨酸的氨酰-tRNA合成酶突變 體CoukRS的CoukRS-pBK質粒;通過基因工程手段，將抗HBeAg抗體anti-HBeAg的DNA序列與 質粒 pBAD 重組，獲得 anti-HBeAg_4tag-pBAD;通過轉化的方法，將 anti-HBeAg_4tag-pBAD 質 粒和CoukRS-pBK質粒轉化ToplO感受態中，獲得了制備抗乙肝e抗原綠色熒光抗體的表達系 統，從而實現了抗乙肝e抗原綠色熒光抗體的制備。本發明抗乙肝e抗原的綠色熒光抗體的 制備方法提高了乙肝e抗原檢測的靈敏度。
【附圖說明】
[0041] 圖1為本發明抗乙肝e抗原的綠色熒光抗體的制備方法的流程示意圖；
[0042]圖2為本發明抗乙肝e抗原的綠色熒光抗體的制備方法的步驟S1的流程示意圖； [0043]圖3為本發明抗乙肝e抗原的綠色熒光抗體的制備方法的步驟S2的流程示意圖；
[0044] 圖4為本發明香豆素賴氨酸的結構示意圖；
[0045] 圖5為本發明抗乙肝e抗原的綠色熒光抗體的制備方法的步驟S6的流程示意圖。
【具體實施方式】
[0046] 下面結合具體實施例對本發明做進一步的詳細說明，以下實施例是對本發明的解 釋，本發明并不局限于以下實施例。
[0047]本發明提供的抗乙肝e抗原的綠色熒光抗體的制備方法包括如下步驟：
[0048] S1:獲得M.Barkeri PylRS突變庫lib-PylRS-pBK;
[0049] S2:獲得7-羥基香豆素賴氨酸；
[0050] S3:篩選CouKRS-pBK質粒，該質粒中包含特異識別7-羥基香豆素的吡咯賴氨酸氨 酰-tRNA合成酶突變體CouKRS的基因序列coukrs;
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