檢測結核分枝桿菌耐藥基因的試劑盒及相關應用
【專利摘要】本發明提供了一種檢測結核分枝桿菌耐藥基因的試劑盒及相關應用，試劑盒中包含一組檢測結核分枝桿菌耐藥基因的探針，探針包括如SEQ ID No.1~SEQ ID No.136所示序列的任意一個或多個，所述基因為rpoB基因、katG基因、inhA基因、ahpC基因、rpsl基因、embB基因、gyrA基因和/或rrs基因；本發明應用多重實施熒光PCR技術，利用小溝結合物（MGB）和鎖核酸（LNA）雙重標記的熒光探針，實現了短時高效結核分枝桿菌耐藥基因檢測的目的，大大提高了臨床耐藥檢測效率，為結核病防治提供了強有力的檢測方法和工具。
【專利說明】
檢測結核分枝桿菌耐藥基因的試劑盒及相關應用
技術領域
[0001] 本發明設及生物技術領域，尤其設及一種檢測結核分枝桿菌耐藥基因的試劑盒及 相關應用。
【背景技術】
[0002] 結核病是全球嚴重的公共衛生問題之一。據WK)估計，全球有約20億人感染結核分 枝桿菌，每年有約200萬人死于結核。雪上加霜的是，近今年全球耐藥結核流行情況非常嚴 峻，W冊在"2013年全球結核報告"指出每年多耐藥結核(MDR-TB)新發病例約450000例并且 有170000例將死于MDR-TB感染。最新的WHCVIUATLD統計:所有新發病例，10.2%的患者至少 耐受一種抗結核藥物，而MDR-TB為1.1 %。
[0003] 我國是世界上22個結核病高負擔國家之一，同時也是MDR/XDR-TB高負擔國家之 一;每年新增100萬結核病例，其中10萬為MDR-TB，占了全球的四分之一。《2010年中國結核 分歧桿菌流行病抽樣調查統計》報道：我國結核分歧桿菌耐藥率高達42.1%，多耐藥率 (MDR-TB)6.8%，更恐怖的是泛耐藥率達到2.1%。結核分歧桿菌在我國肆虐，跟我國的實際 國情:抗生素亂用、結核耐藥的監控失衡和醫療水平息息相關。
[0004] 隨著對結核分枝桿菌耐藥的研究，盡管其耐藥機制比較復雜。相關基因突變成為 化療失敗的主要原因。利福平耐藥發生主要與rpoB基因81個堿基范圍內突變相關，其中W 511、513、516、526、531基因突變最為常見。約90%^上異煙阱耐藥與1?116、1油4和址口(：基因 突變有關，其中的katG S315N/T、inhA-15C-T和ahpC-lOC-T和-9G-A為主要耐藥位點。embB 基因306位密碼子突變是乙胺下醇產生耐藥的主要分子機制。鏈霉素耐藥產生主要是由于 結核分枝桿菌核糖體S12蛋白編碼基因 rpsl突變所致，rpsl常見位點為43和88位密碼子突 變。哇諾酬類藥物耐藥突變位點主要為gyrA基因90和94位密碼產生突變。耐卷曲霉素、阿米 卡星和卡那霉素突變主要為16s rRNA基因突變，W1401和1402位點突變最為常見。
[0005] 結核分枝桿菌的臨床檢測一直W來主要依靠藥物藥敏試驗，但傳統的在固體培養 基上進行的藥物敏感試驗周期長、敏感性低，嚴重影響了患者的早期診斷和治療。因此，研 發一種能夠快速檢測耐藥基因多點突變的方法及相關的試劑盒對促進結核病的防治具有 重大意義。

【發明內容】

[0006] 本發明為解決現有技術中的上述問題提出的一種能夠快速檢測耐藥基因多點突 變的方法及相關的探針和試劑盒。
[0007] 本發明提供了一組檢測結核分枝桿菌耐藥基因的探針，包括如SEQ ID No. 1~SEQ ID No. 136所示序列的任意一個或多個，所述基因為巧oB基因、katG基因、inM基因、ahpC基 因、rpsl基因、embB基因、gyrA基因和/或rrs基因。采用DNA小溝結合物MGB(CDPI3)和鎖核酸 同時標記探針。探針包括W下幾部分：1)報告基團：位于DNA序列的5'-端，巧光基團可W是 FAM、肥乂、￥10、1?0乂^(^的等報告基團中任何一種；2)探針0魁序列，與基因突變和基因多態 性結合的序列，序列長度為8~18個bp; 3)鎖核酸化ΝΑ)修飾:探針DNA序列上1~4個堿基采 用鎖核酸修飾，其目的是提高探針于模板的雜交溫度;4)探針DNA序列3'-末端連接粹滅基 團(NFQ)和小溝結合物MGB，運些基團可W為冊Q、DABCTL和MGB等。該探針組為如下表1中（1) ~（136)中的所示序列探針中的至少一個(其中大寫字母標記的表示為"LNA修飾：
[000引表1探針序列表
[0009]




[0018] 為了進一步優化上述技術方案，本發明所采取的技術措施還包括：
[0019] 優選地，每個探針序列均有若干堿基采用鎖核酸修飾，探針3'-端還標記有小溝結 合物MGB。
[0020] 優選地，每個探針序列上有1-4個堿基采用鎖核酸修飾。
[0021] 優選地，每個探針3'-端標記有3個CDPI小溝結合物MGB。
[0022] 上述任一所述的探針中，所述的巧oB基因為耐利福平耐藥基因；所述katG基因、 inhA基因和ahpC基因為耐異煙阱耐藥基因；rpsl基因為耐鏈霉素基因；embB基因為耐乙胺 下醇基因；gyrA基因為耐哇諾酬類的基因；rrs為耐卡那霉素、阿米卡星和卷曲霉素基因。
[0023] 巧 oB 基因突變為 531TCG-TTG、5 26CAC-AAC、5 26CAC-TAC、526CAC-GAC、516GAC-AAC、 516GAC-TAC和511CTG-CCG。
[0024] katG基因突變為：katG 315AGC-ACC和315AGC-AAC; inhA突變為-15C-T; ahpC突變 為-10C-T和-9G-A突變。
[0025] 巧 si 基因突變為：43AAG-AGG 和 88AAG-AGGeRrs 突變為第 1401 位 A-G、第 1402位 C-T 和1484位G-T突變。
[00%] embB 基因突變為：第 306 密碼子 4了6-4了4、4了6-41'1'、4了6-41'(：、4了6-6了6、4了6-(：了6和 ATG-TTG。
[0027] gyr A基因突變：位90GCG-GTG、94GAC-GGC、94GAC-CAC、94GAC-TAC和 94GAC-GCC。
[002引探針（1)~(42)位檢測rpoB基因突變探針，探針為MGB和LNA雙重標記的巧光探針。
[0029] 探針（2)~（9)中任一探針為檢測巧oB基因531TCG-TTG突變巧光探針，（1)野生型 探針。
[0030] 探針（11)~（15)中任一探針為檢測巧oB基因 526CAC-AAC突變巧光探針，（10)野生 型探針。
[0031] 探針（16)~(22)中任一探針為檢測巧oB基因 526CAC-TAC突變巧光探針，（10)野生 型探針。
[0032] 探針(23)~(28)中任一探針為檢測巧oB基因 526CAC-GAC突變巧光探針，（10)野生 型探針。
[0033] 探針(30)~(32)中任一探針為檢測巧oB基因516GAC-AAC突變巧光探針，（29)野生 型探針。
[0034] 探針(33)~(36)中任一探針為檢測巧oB基因 516GAC-AAC突變巧光探針，（29)野生 型探針。
[00巧]探針(38)~(42)中任一探針為檢測巧oB基因511CTG-CCG突變巧光探針，（37)野生 型探針。
[0036] 探針（43)~（49)位檢測katG基因突變探針，探針為MGB和LNA雙重標記的巧光探 針。
[0037] 探針(44)~(45)中任一探針為檢測katG基因315AGC-ACC突變巧光探針，（43)野生 型探針。
[003引探針(46)~(47)中任一探針為檢測katG基因315AGC-AAC突變巧光探針，（43)野生 型探針。
[0039] 探針（50)~（56)位檢測inhA基因突變探針，探針為MGB和LNA雙重標記的巧光探 針。探針(51)~(56)中任一探針為檢inM基因-15C-T突變巧光探針，（50)野生型探針。
[0040] 探針（57)~（65)位檢測ahpC基因突變探針，探針為MGB和LNA雙重標記的巧光探 針。
[0041 ] 探針(58)~(61)中任一探針為檢測ahpC基因-10C-T突變巧光探針，（57)野生型探 針。
[0042] 探針(62)~（65)中任一探針為檢測ahpC基因-9G-A突變巧光探針，（57)野生型探 針。
[0043] 探針（66)~（87)位檢測embB基因突變探針，探針為MGB和LNA雙重標記的巧光探 針。
[0044] 探針(67)~(71)中任一探針為檢iiembB基因306ATG-ATA突變巧光探針，（66)野生 型探針。
[0045] 探針(72)~(77)中任一探針為檢iiembB基因306ATG-ATT突變巧光探針，（66)野生 型探針。
[0046] 探針(78)~(83)中任一探針為檢iiembB基因306ATG-ATC突變巧光探針，（66)野生 型探針。
[0047] 探針(86)為檢測embB基因 306ATG-GTG突變巧光探針，（66)野生型探針。
[004引探針(87)為檢測embB基因306ATG-CTG突變巧光探針，（66)野生型探針。
[0049] 探針(88)為檢測embB基因306ATG-TTG突變巧光探針，（66)野生型探針。
[0050] 探針（88)~（97)位檢測rps 1基因突變探針，探針為MGB和LNA雙重標記的巧光探 針。
[0051 ] 探針(89)~（92)中任一探針為檢測rpsl基因43AAG-AGG突變巧光探針，（88)野生 型探針。
[0化2] 探針(94)~（97)中任一探針為檢測rpsl基因88AAG-AGG突變巧光探針，（93)野生 型探針。
[0053] 探針（98)~（114)位檢測rrs基因突變探針，探針為MGB和LNA雙重標記的巧光探 針。
[0054] 探針(99)~（104)中任一探針為檢測rrs基因1401A-G突變巧光探針，（98)野生型 探針。
[0055] 探針（105)~（109)中任一探針為檢測rrs基因1401A-G突變巧光探針，（98)野生型 探針。
[0056] 探針（111)~（114)中任一探針為檢測rrs基因1401A-G突變巧光探針，（110)野生 型探針。
[0化7] 探針（115)~（136)位檢測gyrA基因突變探針，探針為MGB和LNA雙重標記的巧光探 針。
[0化引探針（116)~（120)中任一探針為檢測gyrA基因90GCG-GTG突變巧光探針，（115)野 生型探針。
[0059] 探針（122)~（126)中任一探針為檢測gyrA基因94GAC-GGC突變巧光探針，（121)野 生型探針。
[0060] 探針（127)~（129)中任一探針為檢測gyrA基因90GAC-CAC突變巧光探針，（121)野 生型探針。
[0061 ] 探針（130)~（132)中任一探針為檢測gyrA基因90GAC-TAC突變巧光探針，（121)野 生型探針。
[0062] 探針（133)~（136)中任一探針為檢測gyrA基因90GAC-GCC突變巧光探針，（121)野 生型探針。
[0063] 另一方面，本發明還提供一種檢測結核分枝桿菌耐藥基因的試劑盒，試劑盒包括 上述的探針，所述基因為?φοΒ基因、katG基因、inhA基因、ahpC基因、rpsl基因、embB基因、 gyrA基因和/或rrs基因。
[0064] 試劑盒還包括如下所示的引物對：
[0065] 如SEQ ID No. 137和SEQ ID No. 138所示序列組成的引物對，為擴增rpoB基因片段 的引物對；
[0066] 如SEQ ID No. 139和SEQ ID No. 140所示序列組成的引物對，為擴增katG基因片段 的引物對；
[0067] 如SEQ ID No. 141和SEQ ID No. 142所示序列組成的引物對，為擴增inhA基因片段 的引物對；
[006引如SEQ ID No. 143和SEQ ID No. 144所示序列組成的引物對，為擴增ahpC基因片段 的引物對；
[0069] 如SEQ ID No. 145和SEQ ID No. 146所示序列組成的引物對，為擴增embB基因片段 的引物對；
[0070] 如沈Q ID No. 147和SEQ ID No. 148所示序列組成的引物對，為擴增巧si基因片段 的引物對；
[0071] 如SEQ ID No. 149和SEQ ID No. 150所示序列組成的引物對，為擴增rrs基因片段 的引物對；
[0072] 如SEQ ID No. 151和SEQ ID No. 152所示序列組成的引物對，為擴增gyrA基因片段 的引物對。
[0073] 具體序列如下表2所示：
[0074] 表2引物序列表
[0075]
[0076] 本發明還提供了一種檢測樣品中結核分枝桿菌耐藥突變的方法，包括如下步驟：
[0077] 步驟一，巧光PCR體系的建立：
[007引1)實時巧光PCR反應體系l:w樣本中DNA為模板，W寡核巧酸序列（137-138)為引 物擴增樣本中結核分枝桿菌rpoB片段;探針（1)或探針(29)為野生型探針;探針(2)~(9)中 選擇任一條檢測rpob 531;探針（11)~（15)、探針（16)~（22)和探針(22)~（28)中分別任 選一條檢測rpoB 516突變。檢測突變的探針采用5'-端巧光基因 A標記，探針序列中有1~3 個堿基采用鎖核酸修飾，同時3 ' -團MGB修飾。野生型探針采用巧光基因 B、LNA和MGB修飾。
[0079] 2)實時巧光PCR反應體系2: W樣本中DNA為模板，W寡核巧酸序列（137-138)為引 物擴增樣本中結核分枝桿菌rpoB片段;探針（10)或探針（37)為野生型探針；探針（38)~ (42)中選擇任一條檢測rpob 511突變;探針(30)~(32)和探針(33)~（36)中分別任選一條 檢測rpoB 526突變。檢測突變的探針采用5'-端巧光基因 A標記，探針序列中有1~3個堿基 采用鎖核酸修飾，同時3 ' -團MGB修飾。野生型探針采用巧光基因 B、LNA和MGB修飾。
[0080] 3)實時巧光PCR反應體系3: W樣本中DNA為模板，W寡核巧酸序列（139-140)為引 物擴增樣本中結核分枝桿菌katG片段;探針(43)為野生型探針;探針(44)~(45)中選擇任 一條檢測katG 315 AGC-ACC突變;探針(46)~(49)任選一條檢測katG 315AGC-AAC突變。檢 測突變的探針采用5'-端巧光基因 A標記，探針序列中有1~3個堿基采用鎖核酸修飾，同時 3 ' -團MGB修飾。野生型探針采用巧光基因 B、LNA和MGB修飾。
[0081 ] 4)實時巧光PCR反應體系4: W樣本中DNA為模板，W寡核巧酸序列（141-144)為引 物擴增樣本中結核分枝桿菌inhA和ahpC基因片段;探針(50)或探針(57)為野生型探針;探 針巧1)~巧6)中選擇任一條檢測inhA-15C-T突變;探針巧8)~(61)和探針(62)~(65)中分 別任選一條檢測ahpC-lOC-T和-9G-A突變。檢測突變的探針采用5'-端巧光基因 A標記，探針 序列中有1~3個堿基采用鎖核酸修飾，同時3'-團MGB修飾。野生型探針采用巧光基因 B、LNA 和MGB修飾。
[0082] 5)實時巧光PCR反應體系5: W樣本中DNA為模板，W寡核巧酸序列（145-146)為引 物擴增樣本中結核分枝桿菌embB片段;探針(66)為野生型探針;探針(67)~(71)中選擇任 一條檢測embB 306ATG-ATA突變;探針(72)~（77)和探針(78)~(83)中分別任選一條檢測 embB 306ATG-ATT和ATG-ATC突變；探針（85)、（86)和（87)分別檢測embB 306ATG-GTG、ATG- CTG和ATG-TTG。檢測突變的探針采用5'-端巧光基因 A標記，探針序列中有1~3個堿基采用 鎖核酸修飾，同時3 ' -團MGB修飾。野生型探針采用巧光基因 B、LNA和MGB修飾。
[0083] 6)實時巧光PCR反應體系6: W樣本中DNA為模板，W寡核巧酸序列（147-148)為引 物擴增樣本中結核分枝桿菌rpsl片段;探針（88)或探針（93)為野生型探針；探針（89)~ (92)中選擇任一條檢測rpsl 43AAG-AGG突變；探針（94)~（97)任選一條檢測檢測rpsl 88AAG-AGG突變。檢測突變的探針采用5'-端巧光基因 A標記，探針序列中有1~3個堿基采用 鎖核酸修飾，同時3 ' -團MGB修飾。野生型探針采用巧光基因 B、LNA和MGB修飾。
[0084] 7)實時巧光PCR反應體系7: W樣本中DNA為模板，W寡核巧酸序列（149-150)為引 物擴增樣本中結核分枝桿菌rrs片段;探針(98)、或探針（105)、或探針（110)為野生型探針； 探針(99)~（105)中選擇任一條檢測rrs 1401A-G突變;探針（106)~（109)中任選一條檢測 rrs基因1402C-T突變;探針（110)~（114)中任選一條檢測rrsl484G-T突變。檢測突變的探 針采用5'-端巧光基因 A標記，探針序列中有1~3個堿基采用鎖核酸修飾，同時3'-團MGB修 飾。野生型探針采用巧光基因 B、LNA和MGB修飾。
[0085] 8)實時巧光PCR反應體系8: W樣本中DNA為模板，W寡核巧酸序列（151-152)為引 物擴增樣本中結核分枝桿菌gyrA片段;探針（115)或探針（121)為野生型探針;探針（116)~ (120)中選擇任一條檢測gyrA90 GCG-GTG突變;探針（122)~（126)、探針（127)~（129)、探 針（130)~（132)和探針（133)~（136)中分別任選一條用于分別檢測gyrA94 GAC-GGC、GAC- CAC、GAC-TAC和GAC-GCC突變。檢測突變的探針采用5'-端巧光基因 A標記，探針序列中有1~ 3個堿基采用鎖核酸修飾，同時3 ' -團MGB修飾。野生型探針采用巧光基因 B、LNA和MGB修飾。
[0086] 上述實時巧光PCR反應體系1檢測巧oB基因531和516突變；
[0087] 上述實時巧光PCR反應體系2檢測巧oB基因526和511突變；
[008引上述實時巧光PCR反應體系3檢測katG基因315AGC-ACC和315AGC-AAC突變；
[0089] 上述實時巧光PCR反應體系4檢測inM基因-15C-T，址pC基因-10C-T和-9G-A突變；
[0090] 上述實時巧光PCR反應體系5檢測embB基因306突變；
[0091] 上述實時巧光PCR反應體系6檢測巧si基因88和43突變；
[0092] 上述實時巧光PCR反應體系7檢測rrs基因1401、1402和1484突變；
[0093] 上述實時巧光PCR反應體系8檢測gyrA基因90和94突變；
[0094] 步驟二，將實時巧光PCR反應體系1~8分別進行實施巧光PCR定量擴增，得到各個 體系的擴增曲線，分別記為曲線1~曲線8。
[00巧]步驟Ξ，結果分析：
[0096] 1)如果曲線1中有A巧光基團的巧光擴增"S"曲線，且Ct值<42,則樣品中存在rpoB 基因531和/或516突變；
[0097] 2)如果曲線2中有A巧光基團的巧光擴增"S"曲線，且Ct值<42,則樣品中存在rpoB 基因526和/或511突變；
[009引 3)如果曲線3中有A巧光基團的巧光擴增"S"曲線，且Ct值<42,則樣品中存在katG 基因315突變；
[0099] 4)如果曲線4中有A巧光基團的巧光擴增"S"曲線，且Ct值<42,則樣品中存在inhA- 15C-T或/和址pC-1 OC-T'和/或基址PC-9G/A突變。
[0100] 5)如果曲線5中有A巧光基團的巧光擴增"S"曲線，且Ct值<42,則樣品中存在embB 306突變；
[0101] 6)如果曲線6中有A巧光基團的巧光擴增"S"曲線，且Ct值<42,則樣品中存在rpsl 基因43和/或88基因突變；
[0102] 7)如果曲線7中有A巧光基團的巧光擴增"S"曲線，且Ct值<42,則樣品中存在 rrsHOl或/和rrsl402或/和1484基因突變；
[0103] 8)如果曲線8中有A巧光基團的巧光擴增"S"曲線，且Ct值<42,則樣品中存在gyrA 90或/和94基因突變；
[0104] 上述探針5 ' -端巧光基團A和B為常見染料FAM、J0E、VIC和皿X中的一種;3 ' -端為帶 有粹滅基團及小溝結合物(MGB);所述探針序列上有1~3個堿基被鎖核酸修飾。
[0105] 巧光基團：
[0106] 1)所述探針5'-端巧光基團A為常見巧光基團，具體為FAM;
[0107] 2)所述探針3'-端帶有粹滅基團及小溝結合物，具體可W為MGB基團；
[0108] 3)所述探針序列中含有1~3個堿基采用鎖核酸修飾；
[0109] 巧光PCT體系：上述巧光PCR體系中，還包含實時巧光PCR緩沖液、dUTP、dTTP、dATP、 dCTP、dGTP、Mg化、Hots^d Taq DM聚合酶、尿喀晚DM糖基酶。
[0110] 巧光PCR擴增程序為：50度2分鐘；95度10分鐘；95度25秒，58度60秒，共42循環；58 度60秒為巧光采集步驟。
[0111] 本發明采用上述技術方案，與現有技術相比，具有如下技術效果:本發明應用多重 實施巧光PCR技術，利用小溝結合物(MGB)和鎖核酸(LNA)雙重標記的巧光探針，實現了短時 高效結核分枝桿菌耐藥基因檢測的目的，大大提高了臨床耐藥檢測效率，為結核病防治提 供了強有力的檢測方法和工具。
【附圖說明】
[0112] 圖1為實施例一中體系1中加入巧oB 531 TCG〉TTG和/或516GAC-AAC和/或516GAC- TAC突變DNA的FAM巧光基團的擴增曲線。
[0113] 圖2為實施例一中體系2中加入巧oB 526 CAC-AAC和/或CAC-TAC和/或CAC-GAC和/ 或511 CTG-CCG突變DNA的FAM巧光基團的擴增曲線。
[0114] 圖3為實施例一中體系3中加入katG 315突變模板，FAM巧光基團的"S"擴增曲線。
[0115] 圖4為實施例一中體系4中加入inhA-15C-T或/和ahpC-lOC-T和/或基ahpC-9G/A突 變DNA的FAM巧光基團的"S"擴增曲線。
[0116] 圖5為實施例一中體系5中加入embB 306突變DNA的FAM巧光基團的擴增曲線。
[0117] 圖6為實施例一中體系6中加入rpsl基因43和/或88基因突變DNA，有FAM巧光基團 的"S"擴增曲線。
[0118] 圖7為實施例一中體系7中加入rrsl401或/和rrsl402或/和1484基因突變DNA，有 FAM巧光基團的"S"擴增曲線。
[0119] 圖8為實施例一中體系8中，gyrA 90或/和94基因突變，有FAM巧光基團的"S"擴增 曲線。
【具體實施方式】
[0120] 本發明提供了一組檢測結核分枝桿菌耐藥基因的探針，包括如SEQ ID No. 1~SEQ ID No. 136所示序列的任意一個或多個，所述基因為巧oB基因、katG基因、inM基因、ahpC基 因、rpsl基因、embB基因、gyrA基因和/或rrs基因。同時提供了相應的試劑盒，并提供了利用 上述探針檢測結核分枝桿菌是否發生耐藥性突變的方法。
[0121] 下面通過具體實施例對本發明進行詳細和具體的介紹，W使更好的理解本發明， 但是下述實施例并不限制本發明范圍。
[0122] 實施例一
[0123] 1、材料：
[0124]
[0125] ~~2、樣品和標準品準備: '
'
[0126] 樣本制備
[0127] 接受來自臨床的疲液樣本，按照臨床處理規范處理。加入疲液10倍體積的Imol/L 氨氧化鋼(v/v=l: 10)振搖液化30-60min，12 OOOr/min離屯、2min，富集沉淀（可多富集幾 次），待用；向菌體沉淀中加入20化1緩沖液GA，振蕩至菌體徹底懸浮，100°C煮lOmin;瞬時離 屯、W去除管蓋內壁的水珠；向管中加入20μ1 Proteinase K溶液，混勻。加入22化1緩沖液 GB，振蕩15sec，70°C放置lOmin，溶液應變清亮，簡短離屯、W去除管蓋內壁的水珠;注意：加 入緩沖液GB時可能會產生白色沉淀，一般70°C放置時會消失，不會影響后續實驗。如溶液未 變清亮，說明細胞裂解不徹底，可能導致提取DNA量少和提取出的DNA不純。加220μ1無水乙 醇，充分振蕩混勻15sec，此時可能會出現絮狀沉淀，簡短離屯、W去除管蓋內壁的水珠;將上 一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中（吸附柱放入收管中），12，OOOrpm(~13， 400Xg)離屯、30sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；向吸附柱CB3中加入50化1緩沖 液GD(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12,000rpm(~13,400Xg)離屯、30sec，倒掉廢 液，將吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入60化1漂洗液PW(使用前請先檢查是否 已加入無水乙醇），12,000巧m(~13,400Xg)離屯、30sec，倒掉廢液，吸附柱CB3放入收集管 中。將吸附柱CB3放回收集管中，12，00化pm(~13，400 X g)離屯、2min，倒掉廢液。將吸附柱 CB3置于室溫放置數分鐘，W徹底驚干吸附材料中殘余的漂洗液。注意:運一步的目的是將 吸附柱中殘余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的殘留會影響后續的酶反應(酶切、PCR等)實 驗。將吸附柱CB3轉入一個干凈的離屯、管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200μ1洗脫緩 沖液ΤΕ，室溫放置2-5min，12，OOOrpm(~13，400 X g)離屯、2min，將溶液收集到離屯、管中。注 意:洗脫緩沖液體積不應少于50μ1，體積過小影響回收效率。洗脫液的pH值對于洗脫效率有 很大影響。若用ddH20做洗脫液應保證其pH值在7.0-8.5范圍內，pH值低于7.0會降低洗脫效 率;且DNA產物應保存在-20°C，W防DNA降解。
[0128] 標準品制備:上述突變標準品質粒由上海生工合成，將質粒梯度稀釋備用。
[0129] 探針和引物的設計和合成，探針設計參見下表3,引物設計參見表2。
[0130] 表3探針設計
[0131]
[0132]
[0133] 備注:換針序列中，大與堿基為LNA修飾的堿基。
[0134] 探針合成和標記；針對巧〇8、4曰16、;[]1114、曰119〔、61]1613、巧31、祥3和旨7'4基因突變的 探針，5'-端采用FAM標記，序列中有1~2個堿基采用鎖核酸(LNA)修飾，3'-端采用帶有非巧 光粹滅基團的小溝結合物MGB標記。
[0135] 3、巧光PCR檢測結核分枝桿菌多耐藥位點
[0136] 1)擴增模板:含有上述基因突變的質粒，稀釋至lOOOOcopies/ml備用。
[0137] 2)各個巧光PCR檢測體系：
[0138] 巧光PCR檢測體系1:探針（1)為野生型探針，5 ' -端標記VIC，探針序列第4、第六和 第八個堿基LNA修飾，3 ' -MGB;探針(9)、（ 32)和(36)分別檢測巧oB 531 TCG〉TTG、516GAC-AAC 和GAC-TAC，探針序列都選用5 ' -FAM，序列中1~2個堿基LNA修飾，3 ' -末端MGB修飾；引物體 系為(137)和(138)。
[0139] 體系中加入模板含有巧oB 531 TCG〉TTG和/或516GAC-AAC和/或516GAC-TAC突變 DNA。模板的濃度為 lOOOOcopies/ml。
[0140] 巧光PCR檢測體系2:探針（10)為野生型探針，探針（15)、（22)、（26)和（40)檢測 巧 oB基因 526CAC-AAC、CAC-TAC、CAC-GAC和511 CTG-CCG 突變。探針（10) 5 ' -3 ' 端分別標記有 5 ' -端標記VIC，探針序列中有堿基LNA修飾，3 ' -MGB;探針（15)、（ 22)、（ 26)和(40)都選用5 ' - FAM，序列中1~2個堿基LNA修飾，3 ' -末端MGB修飾;引物體系為(137)和(138)。
[0141] 體系中加入模板含有巧〇8 516 04044巧日/或〔40了4巧日/或〔4(：-64巧日/或511 CTG-CCG 突變 DNA。模板的濃度為 lOOOOcopies/ml。
[0142] 巧光PCR檢測體系3:探針(43)為野生型探針，探針(44)和(49)檢測katG AGC-ACC 和AGC-AAC突變。探針(43) 5 ' -3 '端分別標記有5 ' -端標記VIC，探針序列中有堿基LNA修飾， 3 ' -MGB;探針(44)和(49)都選用5 ' -FAM，序列中1個堿基LNA修飾，3 ' -末端MGB修飾；引物體 系為(139)和(40)。
[0143] 體系中加入模板含有katG AGC-ACC和/或AGC-AAC突變DNA。模板的濃度為 lOOOOcopies/mlo
[0144] 巧光PCR檢測體系4:探針(57)為野生型探針，探針(52)檢測inM-15C-T突變，探針 (60)和(65)檢測ahpC-lOC-T和-9G-A。野生型探針5'-3'端分別標記有5'-端標記VIC，探針 序列中有堿基LNA修飾，3'-MGB;探針（52)、（65)和(60)都選用5'斗41，序列中1~2個堿基 LNA修飾，3 ' -末端MGB修飾；引物體系為(141)~（144)。
[0145] 體系中加入模板含有inhA-15C-T和/或ahpC-lOC-T和/或-9G-A突變DNA。模板的濃 度為 lOOOOcopies/ml。
[0146] 巧光PCR檢測體系5:探針(84)為野生型探針，探針(69)、（77)、（78)、（87)、（85)和 (86)檢測embB306突變。野生型探針5 ' -3 '端分別標記有5 ' -端標記VIC，探針序列中有堿基 LNA修飾，3 ' -MGB;檢測突變探針都選用5 ' -FAM，序列中有1個堿基LNA修飾，3 ' -末端MGB修 飾；引物體系為（145)和（146)。
[0147] 體系中加入模板含有embB306突變DNA。模板的濃度為lOOOOcopies/ml。
[014引巧光PCR檢測體系6:探針(88)為野生型探針，探針(89)和(98)檢測rpsl43AAG-AGG 和88AAG-AGG突變。野生型探針5 ' -3 '端分別標記有5 ' -端標記VIC，探針序列中有堿基LNA修 飾，3 ' -MGB;檢測突變探針都選用5 '-FAM，序列中有1個堿基LNA修飾，3 '-末端MGB修飾；引物 體系為（147)和（148)。
[0149] 體系中加入模板含有巧S143AAG-AGG和/或88AAG-AGG突變DNA。模板的濃度為 lOOOOcopies/mlo
[0150] 巧光PCR檢測體系7:探針（98)為野生型探針，探針（99)、（107)和（11)檢測 rrsl401A-G、1402C-T和1484G-T突變。野生型探針5 '-3 '端分別標記有5 ' -端標記VIC，探針 序列中有堿基LNA修飾，3 ' -MGB;檢測突變探針都選用5 ' -FAM，序列中有1個堿基LNA修飾， 3 ' -末端MGB修飾；引物體系為（149)和（150)。
[0151] 體系中加入模板含有rrsl401A-G和/或1402C-T和/或1484G-T突變DNA。模板的濃 度為 lOOOOcopies/ml。
[0152] 巧光PCR檢測體系8:探針（121)為野生型探針，探針（118)、（124)、（129)、（132)和 (135)檢測gyrA90GCG-GTG、94GAC-GGC、CAC、TAC和GCC突變。野生型探針5 ' -3 '端分別標記有 5 ' -端標記VIC，探針序列中有堿基LNA修飾，3 ' -MGB;檢測突變探針都選用5 ' -FAM，序列中有 1個堿基LNA修飾，3 ' -末端MGB修飾；引物體系為(145)和(146)。
[0153] 體系中加入模板含有gyrA90GCG-GTG和/或94GAC-GGC和/或CAC和/或TAC和/或GCC 突變DNA。模板的濃度為lOOOOcopies/ml。
[0154] 3)各反應體系中，引物和探針濃度為0.15mM。
[01 巧]4)PCR體系：10 XMOLE Hots^d Taq DNA聚合酶Buffer 3μ1，5 XEnhance Buffer 化 1，加 TP/dNTP mix終濃度為0.2mM，M0LE Hotstad Taq DNA聚合酶終濃度為0.05υ/μ1， UNG酶為0.00?υ/μ1，模板化1，剩余部分加水補足至30μ1。
[0156] 5)反應程序，與ΑΒΙ 7500巧光PCR儀器上進行;程序為50度2分鐘;95度10分鐘;95 度25秒，58度60秒，共42循環;58度60秒為巧光采集步驟。
[0157] 6)結果判斷標準：
[015引體系1中加入巧οΒ 531 TCG〉TTG和/或516GAC-AAC和/或516GAC-TAC突變DNA，觀察 到FAM巧光基團的擴增曲線，且Ct值<42，則樣品中存在rpoB基因531和/或516突變;見圖 10
[0159] 體系2中，加入巧oB 516 CAC-AAC和/或CAC-TAC和/或CAC-GAC和/或511 CTG-CCG 突變DNA，觀察到FAM巧光基團的擴增曲線，且Ct值<42，則樣品中存在rpoB基因526和/或 511突變;見圖2。
[0160] 體系3中加入katG 315突變模板，有FAM巧光基團的"S"擴增曲線，且Ct值<42,則樣 品中存在katG基因315突變;見圖3。
[0161] 體系4中加入inM-15C-T或/和址pC-lOC-T和/或基址PC-9G/A突變DNA，有FAM巧光 基團的擴增曲線，且Ct值<42，則樣品中存在inhA-15C-T或/和ahpC-lOC-T和/或基ahpC- 9G/A突變。見圖4。
[0162] 體系5中加入embB 306突變DNA，FAM巧光基團的擴增曲線，且Ct值<42，則樣品 中存在embB 306突變;見圖5。
[0163] 體系6中，加入rpsl基因43和/或88基因突變DNA，有FAM巧光基團的擴增曲線， 且Ct值<42,則樣品中存在巧si基因43和/或88基因突變;見圖6。
[0164] 體系7中，加入rrsl401或/和rrsl402或/和1484基因突變DNA，有FAM巧光基團的 "夢'擴增曲線，且Ct值<42,則樣品中存在rrsl401或/和rrsl402或/和1484基因突變;見圖7。 [01化]體系8中，gyrA 90或/和94基因突變，有FAM巧光基團的擴增曲線，且Ct值<42， 則樣品中存在gyrA 90或/和94基因突變。見圖8。
[0166] 上述實施例表明，應用本發明的方法可W快速檢測結核分枝桿菌多個耐藥位點。 由此可見，本發明應用多重實施巧光PCR技術，利用小溝結合物(MGB)和鎖核酸(LNA)雙重標 記的巧光探針，實現了短時高效結核分枝桿菌耐藥基因檢測的目的，大大提高了臨床耐藥 檢測效率，為結核病防治提供了強有力的檢測方法和工具。
[0167] W上對本發明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發明并不限 制于W上描述的具體實施例。對于本領域技術人員而言，任何對本發明進行的等同修改和 替代也都在本發明的范疇之中。因此，在不脫離本發明的精神和范圍下所作的均等變換和 修改，都應涵蓋在本發明的范圍內。
【主權項】
1. 一組檢測結核分枝桿菌耐藥基因的探針，其特征在于，包括如SEQ ID No. 1~SEQ ID No. 136所示序列的任意一個或多個，所述基因為rpoB基因、katG基因、inhA基因、ahpC基因、 rpsl基因、embB基因、gyrA基因和/或rrs基因。2. 根據權利要求1所述的探針，其特征在于，每個探針序列均有若干堿基采用鎖核酸修 飾，探針3 ' -端還標記有小溝結合物MGB。3. 根據權利要求1所述的探針，其特征在于，由如SEQ ID No. 1~SEQ ID No. 136所示序 列的探針組成。4. 根據權利要求2所述的探針，其特征在于，每個探針序列上有1-4個堿基采用鎖核酸 修飾。5. 根據權利要求2所述的探針，其特征在于，每個探針3 端標記有3個CDPI小溝結合物 MGB〇6. -種檢測結核分枝桿菌耐藥基因的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括如權利要 求1-5任意一項所述的探針，所述基因為rpoB基因、katG基因、inhA基因、ahpC基因、rpsl基 因、embB基因、gyrA基因和/或rrs基因。7. 根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括如下所示的引物對： 如SEQ ID No. 137和SEQ ID No. 138所示序列組成的引物對； 如SEQ ID No. 139和SEQ ID No. 140所示序列組成的引物對； 如SEQ ID No. 141和SEQ ID No. 142所示序列組成的引物對； 如SEQ ID No. 143和SEQ ID No. 144所示序列組成的引物對； 如SEQ ID No. 145和SEQ ID No. 146所示序列組成的引物對； 如SEQ ID No. 147和SEQ ID No. 148所示序列組成的引物對； 如SEQ ID No. 149和SEQ ID No. 150所示序列組成的引物對； 如SEQ ID No. 151和SEQ ID No. 152所示序列組成的引物對。8. -種檢測結核分枝桿菌是否發生耐藥性突變的方法，其特征在于，包括如下步驟： 步驟一，熒光PCR體系的建立 實時熒光PCR反應體系l:以檢測樣本中DNA為模板，以SEQIDNo.l37和SEQIDNo.l38 所示序列組成的引物對為引物擴增檢測樣本中結核分枝桿菌rpoB片段；以SEQ ID No. 1序 列所示的探針或SEQ ID No. 29序列所示的探針為野生型探針；在如SEQ ID No. 2~SEQ ID No.9序列所示的探針中選擇任一條檢測rpoB 531;在如SEQ ID No. 11~SEQ ID No. 15、SEQ ID No. 16~SEQ ID No. 22以及SEQ ID No.23~SEQ ID No.28序列所示的探針中分別任選一 條檢測rpoB 516突變;檢測突變的探針采用5'-端熒光基因 A標記，探針序列中有1~3個堿基 采用鎖核酸修飾，同時3 ' -團MGB修飾;野生型探針采用熒光基因 B、LNA和MGB修飾； 實時熒光PCR反應體系2:以檢測樣本中DNA為模板，以SEQIDNo.l37和SEQIDNo.l38 所示序列組成的引物對為引物擴增檢測樣本中結核分枝桿菌rpoB片段；以SEQ ID No. 10序 列所示的探針或SEQ ID No. 37序列所示的探針為野生型探針；在如SEQ ID No.38~SEQ ID No.42序列所示的探針中選擇任一條檢測rpoB 511突變;在如SEQ ID No.30~SEQ ID No.32 和SEQ ID No.33~SEQ ID No.36序列所示的探針中分別任選一條檢測rpoB 526突變;檢測 突變的探針采用5'-端熒光基因 A標記，探針序列中有1~3個堿基采用鎖核酸修飾，同時3'-團MGB修飾;野生型探針采用熒光基因 B、LNA和MGB修飾； 實時熒光PCR反應體系3:以檢測樣本中DNA為模板，以SEQIDNo.l39和SEQIDNo.l40 所示序列組成的引物對為引物擴增檢測樣本中結核分枝桿菌katG片段；以SEQ ID No. 43序 列所示的探針為野生型探針;在如SEQ ID No.44~SEQ ID No.45序列所示的探針中選擇任 一條檢測katG 315 AGC-ACC突變；在如SEQ ID No.46~SEQ ID No.49序列所示的探針中任 選一條檢測katG 315 AGC-AAC突變;檢測突變的探針采用5'-端熒光基因 A標記，探針序列 中有1~3個堿基采用鎖核酸修飾，同時3 ' -團MGB修飾;野生型探針采用熒光基因 B、LNA和MGB 修飾； 實時熒光PCR反應體系4:以檢測樣本中DNA為模板，以SEQIDNo.l41和SEQIDNo.l42 所示序列組成的引物對為引物擴增檢測樣本中結核分枝桿菌inhA基因片段；以檢測樣本中 DNA為模板，以SEQ ID No. 143和SEQ ID No. 144所示序列組成的引物對為引物擴增檢測樣 本中結核分枝桿菌ahpC基因片段；以SEQ ID No.50或SEQ ID No.57序列所示的探針為野生 型探針;在如SEQ ID No.51~SEQ ID No.56序列所示的探針中選擇任一條檢測inhA -15 C-T突變；在如SEQ ID No.58~SEQ ID No.61和SEQ ID No.62~SEQ ID No.65序列所示的探針 中分別任選一條檢測ahpC -10C-T和-9G-A突變;檢測突變的探針采用5'-端熒光基因 A標 記，探針序列中有1~3個堿基采用鎖核酸修飾，同時3'-團MGB修飾;野生型探針采用熒光基 因 B、LNA和MGB修飾； 實時熒光PCR反應體系5:以檢測樣本中DNA為模板，以SEQIDNo.l45和SEQIDNo.l46 所示序列組成的引物對為引物擴增檢測樣本中結核分枝桿菌embB基因片段；以SEQ ID No.66序列所示的探針為野生型探針;在如SEQ ID No.67~SEQ ID No.71序列所示的探針中 選擇任一條檢測embB 306 ATG-ATA突變；在如SEQ ID No .72~SEQ ID No .77和SEQ ID No.78~SEQIDNo.83序列所示的探針中分別任選一條檢測embB 306 ATG-ATT和ATG-ATC 突變；利用如SEQ ID No.85、SEQ ID No.86和SEQ ID No.87序列所示的探針中分別檢測 embB 306 ATG-GTG、ATG-CTG和ATG-TTG;檢測突變的探針采用5'-端熒光基因 A標記，探針序 列中有1~3個堿基采用鎖核酸修飾，同時3 團MGB修飾;野生型探針采用熒光基因 B、LNA和 MGB修飾； 實時熒光PCR反應體系6:以檢測樣本中DNA為模板，以SEQIDNo.l47和SEQIDNo.l48 所示序列組成的引物對為引物擴增檢測樣本中結核分枝桿菌rpsl片段；以SEQ ID No.88或 SEQ ID No.93序列所示的探針為野生型探針；在如SEQ ID No.89~SEQ ID No.92序列所示 的探針中任選一條檢測rpsl43AAG-AGG突變；在如SEQIDNo.94~SEQIDNo.97序列所示 的探針中任選一條檢測rpsl 88AAG-AGG突變;檢測突變的探針采用5'-端熒光基因 A標記， 探針序列中有1~3個堿基采用鎖核酸修飾，同時3'-團MGB修飾;野生型探針采用熒光基因 B、 LNA和MGB修飾； 實時熒光PCR反應體系7:以檢測樣本中DNA為模板，以SEQIDNo.l49和SEQIDNo.l50 所示序列組成的引物對為引物擴增檢測樣本中結核分枝桿菌rrs基因片段；以SEQ ID No.98、SEQ ID No. 105或SEQ ID No. 110序列所示的探針為野生型探針;在如SEQ ID No.99 ~SEQ ID No.105序列所示的探針中任選一條檢測rrs 1401A-G突變;在如SEQ ID No.106~ SEQ ID No. 109序列所示的探針中任選一條檢測rrs基因1402C-T突變;在如SEQ ID No. 110 ~SEQ ID No. 114序列所示的探針中任選一條檢測rrs基因1484G-T突變;檢測突變的探針采 用5'-端熒光基因 A標記，探針序列中有1~3個堿基采用鎖核酸修飾，同時3'-團MGB修飾;野 生型探針采用熒光基因 B、LNA和MGB修飾； 實時熒光PCR反應體系8:以檢測樣本中DNA為模板，以SEQIDNo.l51和SEQIDNo.l52 所示序列組成的引物對為引物擴增檢測樣本中結核分枝桿菌gyrA基因片段；以SEQ ID No. 115或SEQ ID No. 121序列所示的探針為野生型探針；在如SEQ ID No. 116~SEQ ID No.l20序列所示的探針中任選一條檢測gyrA基因90GCG-GTG突變;在如SEQIDNo.l22~ SEQIDNo.l26序列所示的探針中任選一條檢測gyrA基因94GAC-GGC突變；在如SEQID No.l27~SEQIDNo.l29序列所示的探針中任選一條檢測gyrA基因94GAC-CAC突變 ；在如 SEQIDNo.l30~SEQIDNo.l32序列所示的探針中任選一條檢測gyrA基因94GAC-TAC突 變;在如SEQIDNo.l33~SEQIDNo.l36序列所示的探針中任選一條檢測gyrA基因94GAC-GCC突變;檢測突變的探針采用5'-端熒光基因 A標記，探針序列中有1~3個堿基采用鎖核酸 修飾，同時3 ' -團MGB修飾;野生型探針采用熒光基因 B、LNA和MGB修飾； 步驟二，獲得實時熒光PCR定量擴增曲線 將所述步驟一實時熒光PCR反應體系1~8分別進行實時熒光PCR定量擴增，得到各個體 系的擴增曲線，分別為曲線1~曲線8; 步驟三，結果分析 如果曲線1中有A熒光基團的熒光擴增"S"曲線，且Ct值〈42,則樣品中存在rpoB基因531 和/或516突變； 如果曲線2中有A熒光基團的熒光擴增"S"曲線，且Ct值〈42,則樣品中存在rpoB基因526 和/或511突變； 如果曲線3中有A熒光基團的熒光擴增"S"曲線，且Ct值〈42,則樣品中存在katG基因315 突變； 如果曲線4中有A熒光基團的熒光擴增"S"曲線，且Ct值〈42,則樣品中存在inhA-15C-T 或 / 和ahpC-10C-T 和/或基ahpC-9G/A 突變； 如果曲線5中有A熒光基團的熒光擴增"S"曲線，且Ct值〈42,則樣品中存在embB 306突 變； 如果曲線6中有A熒光基團的熒光擴增"S"曲線，且Ct值〈42,則樣品中存在rpsl基因43 和/或88基因突變； 如果曲線7中有A熒光基團的熒光擴增"S"曲線，且Ct值〈42,則樣品中存在rrsHOl或/ 和rrsl402或/和1484基因突變； 如果曲線8中有A熒光基團的熒光擴增"S"曲線，且Ct值〈42,則樣品中存在gyrA 90或/ 和94基因突變。9. 根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述探針5'-端熒光基團A和B為FAM、J0E、 VIC和HEX中的一種。10. 利用如權利要求8或9所述的方法檢測結核分枝桿菌是否發生耐藥性突變在非診斷 和治療目領域的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK106011306SQ201610657425
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年8月11日
【發明人】齊飛虎, 張翼飛, 董鳳媛
【申請人】上海默禮生物醫藥科技有限公司