Rv3121蛋白在檢測結核分枝桿菌感染中的應用
【專利摘要】本發明涉及Rv3121蛋白在檢測結核分枝桿菌感染中的應用，所述抗原氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述的蛋白抗原的制備方法包括如下步驟：步驟(1)以催化Rv3121的入門載體(美國Craig Ventor Institute下設的PFGRC所免費提供)和載體重組生成Rv3121的表達載體；步驟(2)將步驟(1)所述Rv3121的表達載體轉化目標表達宿主，表達目標Rv3121蛋白；步驟(3)破碎細胞收集蛋白包涵體并復性目標蛋白。
【專利說明】
Rv3121蛋白在檢測結核分枝桿菌感染中的應用
技術領域
[0001] 本發明屬于醫療產品技術領域，具體而言，涉及一種Rv3121蛋白在檢測結核分枝 桿菌感染中的應用。
【背景技術】
[0002] 我國體外診斷產業現正處于快速增長時期。然而巨大的市場需求與我國診斷試劑 行業相對落后的自主研發能力的存明顯的差距。如何從源頭上開展自主創新，如何在診斷 試劑原材料供應上不受制于個別境外醫藥巨頭，如何將現有的生物醫藥領域的科研成果轉 化為產品是我國政府、科研院所和醫藥行業在近年來都非常關注的熱點。并且現今市場上 對更靈敏、高效的診斷試劑提出了剛性需求，能夠快速準確的確診結核病患者對于醫務工 作者和病人本人都具有重要意義。
[0003] 近年來數據調查結果顯示，有結核病癥狀的患者76. 6%接受過結核病病前相關檢 查，但是僅有35. 8%被診斷為肺結核患者，提高病人發現率仍是當前結核病防治工作的重 點也是難點。
[0004] 利用抗原特異性T細胞的細胞免疫反應進行病原微生物感染的體外診斷，是今年 發展起來的一種新的檢測方法。我們通過分離新鮮全血中的外周血單核細胞并進行刺激培 養，然后利用ELISP0T檢測能夠分泌IFN-γ的細胞的數量。該方法目前主要應用于結核分 枝桿菌感染的診斷。目前臨床普遍采用的結核診斷主要依賴于臨床癥狀、影響學診斷和病 原學診斷，對結核分枝桿菌潛伏性感染的診斷不敏感。同時，在結核病篩查過程中，直接檢 測病原體或檢測結核分枝桿菌抗體的靈敏度和特異性也不理想。

【發明內容】

[0005] 針對上述臨床實際工作情況，我們篩選了已知的結核分枝桿菌來源的蛋白片段， 結合現有的陽性檢測參照物，提供了一種提高結核病診斷準確性的結核分枝桿菌標識物抗 原，通過該抗原來體外檢測特異性T細胞免疫反應，可以作為診斷結核病患者的參照，用于 診斷患者是否被結核分枝桿菌感染。
[0006] 具體而言，本發明首先涉及一種結核分枝桿菌的特異性蛋白抗原Rv3121，所述抗 原的序列如SEQ ID NO. 2所示，其序列結構為：
[0007] Met ttr Ser Thr S&r lie Pro Thr Phe Pro i%:e Asp jk'g fr.Q y趕I Pro I 5 IQ 1_5 Tiir Glu Pro Ser Pro let Leu Ser Glu Le.u. A：r.g Asn- S.er Cys- Pro Val 20 25 30 Ala Pro Il.e. Glu Leu Pro. Ser Giy .His Thr Ala； Trp Leu Va；l Thr Arg 35： 40 4.5 Phe· A；sp Asp Ial Lys· Gly ￥al Leu Sex- Asp L：y.s Arg Pha -S：ex 'Cjs:· Arg· :m so so Ala Ala Ala 'His, Pro Ser' Ser' Pro Fro Flie ￥al Ρ?? Fh.e ￥ial Gln Leti 65 70 75 80 Cys Pro Ser Leu Leu 、丄丄e .A:s-p Gly .Pro. Gln His Thr Ala, Ala, Arg 85 90 95 Arg Leu Leu Ala Gln (Jlj Leti Asn Pro Gly Phe He Ala Arg Me1 Arg
[0008] 100 105 HO 技.1 GI.r Gln I:le Va"! Asp Asti Ala Lpu Asp Asp Lpii Al月：A.].a IL5" im- .1.25 Ala -Glu Pm-Pro： Va.l Asp Phe Γτ?η. G1i.l Tie ￥a.1. Ser Yal Pro T.1.e' Gly 130 135 140 GitrGln Leu. Met Ma Lys Lcti Leu Gly fal Glit .Pro Lys Thr Yal His 1:4:5. 150 155. 160 Glu Leu Ala Ala His Val Asp Ala Ala Met Ser Val Cys Glu He Gly 165 1.70- 1,75 ,Asp -Glti： Glu Val Ser Arg Atg Trp Se:r Ala Leti Cys Thr Met Val I]e 180 1.8:5 Γ90 .Asp lie Lea His Arg Lys Leu. Ala Glu· Pro Gly Asp Asp Leu Leu Ser ms 2:00 205 Tht. lie Ala Gln Ala Asn Arg G丄n Gln Ser Thr Met Thr Asp Glu Gln .210 215 22Q Y：al Ial Gly Met Leu Leu Thr Yal Val lie Gly Gly ￥al Asp Thr Pro 225' 2m 235 240 Ilc Ala Val lie Thr Asn Gly Lcu Ala Scr Lcu Lcu His His Arg Asp 245 25Q 255· Gin； Tyr Glu Arg Lcu Val Glu Asp Pro Gly Arg Val Ala Arg Ala V^] 260 265 270 Glu:：Glu Hg Val Arg· Phe· Asn Pro Ala Thr Glu. lie Glu His Leu Arg 275： 280' 285 ￥al ￥al Thr' 'Glu Asp： Val Val lie Ala GIy Thr Ala Leu Ser Ala GIy 290 295 300 Sex· P.rQ 41在 Phe Thr Ser lie Th:r Se:r A]-a As:ft Ar:g Asp Ser Asp Gln 305： 310 315: 320 P:he Leu Asp Pro： Asp. Glu Phe Asp ?al Glu. Arg Asn Pro Asn Glu Eis 3部 330 He Ala 'Phe- GI:y' Tyr Gly Pro- His Ala :Gy's Pro Ala Sex Ala Tyr Ser 340 345 3H0 Arg Mel Cys Leu Tlir Thr Phe Phe Thr Ser Leu Gln Arg Pbe· Ftq 355 360 365 Gln Leu Gln Leu Ala Arg Pro Phe Glu Asp L-e.u. -Glu Arg Arg Gly .Lys' 370 375 3:80 Gly Leu His- Ser Val Gly Tie Glxi LeU Letl VaI Thr Trp Pro T}ir 3:85 390 395 400
[0009] 所述的抗原的DNA表達序列如SEQ ID NO. I所示，序列結構為：
[0010] atgacaagca cctcgattcc gacgttcccg ttcgaccggc cggtcccgac ggagccgtcc 60 ccaatgctgt cggaactgag aaacagctgt ccggtagccc cgatagagtt gccctcgggg 120 cacacagcal ggctcgtcac tcgctttgac galgtaaagg gagtgclgtc cgacaagcgt 180 ttcagctgca gggcggcagc gcacccgtcg tcgcccccgt tcgtgccgtt cgtgcagctt 240 tgccccagct tgttgagcat cgatgggccc caacacaccg cggcccgccg tctgctcgcg 300 cagggcctaa atcccggctt catcgcacgc atgcggcccg ttgtccaaca gatcgtcgac 360 aatgcgctcg acgatctggc agccgcggaa ccaccggtgg acttccagga aatagtaagt 420 gtccctatcg gagaacagct catggccaag ctactcgggg tcgagcccaa aaccgtgcac 480 gagctcgcgg cgcacgtgga tgcggcgatg tccgtgtgtg agatcggcga cgaggaggtg 540 agccggcggt ggtcagcact gtgcacgatg gtcatcgaca tactgcaccg caagctcgcc 600 gaaccgggtg atgacctact tagcacgatc gcccaggcga accggcaaca gtccaccatg 680 accgacgagc aggttgtcgg catgctcctc accgtcgtga tcggaggagt cgacacaccg 720 atcgccgtga tcacaaacgg gctggcgagc ctgctgcacc accgcgatca atatgaacgg 780 ctcgttgaag acccaggccg tgtcgctcgt gcggttgaag aaatagtccg gtttaatccg 840 gcaactgaaa ttgagcactt gcgagttgtc accgaggatg tcgtcattgc cggaaccgcg 900 ctatcggcgg ggagcccagc atttacctcl atcacttcgg ctaaccgcga ctccgaccaa 960 ttcctggacc ccgatgagtt tgatgtcgaa cgtaatccga acgaacacat agcatttgga 1020 tatggtccac atgcttgccc ggcctcagcg tattcacgca tgtgcttgac gacgttcttc 1080 acctcgctta cccagcgatt tccgcaactt caactcgcaa gaccgtttga ggatttggaa 1140 cgacggggta agggcctaca ttcggtgggg atcaaggaac tccttgttac ctggccgacg 1200
[0011] 本發明還涉及所述的抗原的制備方法，包括如下步驟
[0012] 步驟⑴以GatewayiLRClona.se? Enzyme mix催化Rv3121 的入門裁體(美國 Craig Ventor Institute下設的PFGRC所免費提供）和。Gateway? pDEST?17載體重組生成Rv3121 的表達載體；
[0013] 步驟（2)將步驟（1)所述Rv3121的表達載體轉化目標表達宿主，表達目標Rv3121 蛋白；
[0014] 步驟（3)破碎細胞收集蛋白包涵體并復性目標蛋白。
[0015] 所述的步驟（1)的具體方法是：
[0016] a.克隆反應體系：Rv3121的入門載體2. 5yL，PDEST?17載體I yL， Gateway? SPClcmase? Π Enzyme mix 2.5 yL;反應條件：25°C，過夜反應；
[0017] b.轉化方法：反應體系中加入100 μ L大腸桿菌DH5 α感受態（自制），冰浴30min 后，42°C熱激90s，體系冰上放置lOmin，加入200 μ L LB培養基復性后，涂布在含氨芐青霉 素（100mg/l)的LB固體培養基上，37°C培養20h ;
[0018] c.質粒提取：以N96高純度質粒小提試劑盒（DP114)提取質粒，獲得Rv3121的表 達載體。
[0019] 所述的步驟（2)的具體方法是：
[0020] a.取1 μ L步驟（1)獲得的質粒溶液加入100 μ 1大腸桿菌rosetta(DE3)感受態， 冰浴30min后，42°C熱激90s ;
[0021] b.體系冰上放置lOmin，加入200 μ L LB培養基復性后，涂布在含氨芐青霉素 (100mg/l)的LB固體培養基上，37°C培養12h ;
[0022] c.以 0· 75mM IPTG 誘導 Rv3121 蛋白表達。
[0023] 所述的步驟（3)的具體方法是：
[0024] a.以重懸液：60mM tris PH 9. 0,0· 15M EDTA重懸細菌，在4°C條件下使用超聲波 破碎儀超聲破碎細菌，
[0025] b. 4°C，1000 Orpm離心20min收集沉淀即為固體形態包涵體，結果如圖2所示。
[0026] c.以溶解液（60mM Tris-HCl PH7. 0, IOM 尿素，15mM DTT，ImM EDTA)溶解包涵 體；第一次透析：以截留分子量為3K的透析袋過夜透析將蛋白透析，透析液成分為：20mM Tris-HCl PH 9.0, IM 尿素，3mM L-Argine ;
[0027] d.再透析第二次，透析液成分為：20mM Tris-HCl PH 9.0, IOmM NaCl，第二次透 析：以截留分子量為3K的透析袋過夜透析將蛋白透析至透析液，即可獲得可直接用于免疫 原篩選的蛋白。
[0028] 本發明還涉及所述的Rv3121抗原作為檢測結核分枝桿菌免疫原的應用。所述的 應用包括將該Rv3121蛋白抗原單獨用于檢測結核分枝桿菌；或將該Rv3121抗原與現有結 核分枝桿菌檢測抗原聯用，用于檢測結核分枝桿菌。
[0029] 本發明還涉及所述的Rv3121蛋白抗原在制備結核分枝桿菌檢測試劑盒中的應 用，所述的應用具體為，將所述的Rv3121蛋白抗原單獨作為檢測抗原制備檢測試劑盒；或 將所述Rv3121蛋白抗原和現有結核分枝桿菌檢測抗原協同聯用，增加現有抗原免疫檢測 準確度。
[0030] 所述的現有結核分枝桿菌檢測抗原包括但不限于結核分枝桿菌來源的ESAT-6抗 原、CFPlO抗原、PH)抗原、BCG抗原、LAM抗原、ES-31抗原。
[0031] 本發明還涉及由所述的Rv3121蛋白抗原制備的單一抗原型結核分枝桿菌檢測試 劑盒，所述試劑盒包含，
[0032] (1)檢測有效量濃度（優選濃度為60ug/ml)的Rv3121蛋白抗原；
[0033] (2)必要的檢測試劑及顯色試劑。
[0034] 本發明還涉及包含所述的Rv3121蛋白抗原的多抗原聯用型結核分枝桿菌檢測試 劑盒，所述試劑盒包含，
[0035] (1)檢測有效量濃度（優選濃度為60ug/ml)的Rv3121蛋白抗原，以及檢測有效量 的其他抗原；
[0036] (2)必要的檢測試劑及顯色試劑。
[0037] 本發明還涉及所述的由Rv3121蛋白抗原制備的單一抗原型或多抗原聯用型結核 分枝桿菌檢測試劑盒的檢測方法，所述的檢測方法的步驟為，
[0038] (1)檢測樣品為由待測患者血樣制備得到的抗凝全血或PBMC細胞；
[0039] ⑵Rv3121蛋白抗原作為免疫原與抗凝全血或者PBMC細胞孵育20-30個小時，優 選20-24個小時
[0040] (3)檢測受到Rv3121蛋白抗原刺激分泌的細胞因子，與陽性參照對比確定檢測 結果，所述的細胞因子為 IFN-gamma、IFN-alpha、TNF-alpha、IL-2、IL-13、IP-10、IL-lra、 GM-CSF、MIP-lbetta、IL-6、IL-8、MCP-l、IL-10 和 IL-12,優選 IFN-gamma、TNF-alpha、IL-2、 IL-13、IP-10、IL-lra、GM-CSF、MIP-lbetta，進一步優選 IFN-gamma、TNF-alpha、IL-2、 IL-13,最優選 IFN-gamma。
【附圖說明】
[0041] 圖L pDEST17-Rv3121表達載體酶切驗證結果：B2泳道為Rv3121的DNA片段。
[0042] 圖2.蛋白質純化SDS-PAGE檢測圖，A.包涵體樣品，M.蛋白質Marker，B.包涵體 溶解樣品，C. 一次透析樣品，D.二次透析樣品。
【具體實施方式】
[0043] 實施例1. Rv3121-pDEST17表達載體構建基礎流程
[0044] 以Gateway? LR Cjonase* Enzyme mix 催化 Rv3121 的入門裁體（美國 Craig Ventor Institute下設的PFGRC所免費提供）和Gateway? pDEST?17載體重組生成Rv3121的表達 載體。
[0045] 具體方法：
[0046] A.克隆反應體系：Rv3121 的入門載體 L 5 μ L，Gateway* pDEST?17 載體 1 μ L， Gateway1^ BP Clona.se?. II Enzyme mix 2· 5 μ L ;反應條件：25°C，過夜反應。
[0047] B.轉化方法：反應體系中加入100 μ L大腸桿菌DH5 α感受態（自制），冰浴30min 后，42°C熱激90s，體系冰上放置lOmin，加入200 μ L LB培養基復性后，涂布在含氨芐青霉 素（100mg/l)的LB固體培養基上，37°C培養20h。
[0048] C.質粒提取：以N96高純度質粒小提試劑盒（DP114)提取質粒，獲得Rv3121的表 達載體。
[0049] D.酶切驗證：以BsrGl酶切試劑盒（R0575S NEB)酶切質粒驗證克隆是否完成，結 果如圖1所示結果顯示，酶切片段大小約為1200bp，質粒構建成功。
[0050] 實施例2.目標蛋白Rv3121的表達及復性
[0051] 1.將實施例1獲得的Rv3121的表達載體導入rosetta(DE3)表達載體中，具體方 法為：
[0052] a.取1 μ L質粒溶液加入100 μ rosetta (DE3)感受態（自制），冰浴30min后，42。。 熱激90s，
[0053] b.體系冰上放置lOmin，加入200 μ L LB培養基復性后，涂布在含氨芐青霉素 (100mg/l)的LB固體培養基上，37°C培養12h ;
[0054] c.以 0· 75mM IPTG 誘導 Rv3121 蛋白表達。
[0055] 2.超聲破碎細菌后超速離心，獲取包涵體固體沉淀并收集蛋白及復性步驟具體方 法為：
[0056] a.以重懸液：60mM tris PH 9. 0,0· 15M EDTA重懸細菌，在4°C條件下使用超聲波 破碎儀超聲破碎細菌；
[0057] b. 4°C，1000 Orpm離心20min收集沉淀即為固體形態包涵體，結果如圖2所示。
[0058] c.以溶解液（60mM Tris-HCl PH7. 0, IOM 尿素，15mM DTT，ImM EDTA)溶解包涵 體；第一次透析：以截留分子量為3K的透析袋過夜透析將蛋白透析，透析液成分為：20mM Tris-HCl PH 9.0, IM 尿素，3mM L-Argine ;
[0059] d.再透析第二次，透析液成分為：20mM Tris-HCl PH 9.0, IOmM NaCl，第二次透 析：以截留分子量為3K的透析袋過夜透析將蛋白透析至透析液，即可獲得可直接用于免疫 原篩選的蛋白。
[0060] 實施例3.目標蛋白Rv3121的免疫原性測試
[0061] 為了檢測Rv3121的免疫原性及其對于現有抗原檢測試劑盒的增強效果，對于來 自北京胸科醫院臨床確診的多個病例進行了進一步的抗原檢測篩選。
[0062] 測試血樣：來自北京胸科醫院就診患者
[0063] 試劑與耗材：T-SPOT試劑盒，Oxford immunotec (英國）產品
[0064] T-SPOT 實驗：
[0065] 用Oxford immunotec的T-SPOT試劑盒，檢測細胞因子為IFN-γ。
[0066] 1)肝素抗凝血，抗凝血樣本按體積1:1與RPMI1640混勻；按2-3:1比例小心將血 樣加在Ficoll淋巴細胞分離液上層；
[0067] 2) 1000 g離心22分鐘；水平轉子，緩升緩降；
[0068] 3)將單核細胞層（位于離心管中間層，為一層較薄的白膜狀）從Ficoll分離管中 轉移到已加 IOmlA頂-V培養液的無菌15ml離心管，輕輕混勻，室溫600g離心7min ;
[0069] 4)小心去除上清，加入1ml A頂-V，輕緩重懸細胞，加入A頂-V培養液至10ml，350g 離心7min ;
[0070] 5)小心棄上清，加入1ml A頂-V培養液重懸細胞；
[0071] 6)細胞計數及稀釋，取10 μ 1細胞懸液加入40 μ 1的1 % trypan blue，制備1 : 5細胞稀釋液，進行活細胞計數，計算細胞稀釋需要的體積并加入相應的AIM-V無血清培養 液制備細胞稀釋液，試劑盒檢測要求加入每孔（24孔PVDF膜板）細胞數量2. 5 X IO5;
[0072] 7)將培養板從鋁封袋中取出，按順序加入：
[0073] 50 μ I AIM V至陰性對照孔；50 μ 1抗原ESAT-6至抗原A孔；50 μ 1抗原CFP 10 至抗原B孔；50 μ 1陽性對照至陽性對照孔；在上述4孔中分別加入已制備細胞稀釋工作液 100 μ 1。50 μ 1實施例2制備獲得的Sample protein (初始濃度為60ug/ml)加入到樣品孔 中，隨后加入培養基和細胞，樣品孔中Sample protein的終濃度為初始濃度的1/3。
[0074] 8)將培養板放入37°C，5% C02培養箱孵育16-20hrs。
[0075] 9)用無菌PBS按1:200制備新鮮酶標抗體工作液。從培養箱取出培養板，棄去孔 內液體。以200 μ Ι/well無菌PBS洗滌4遍。
[0076] 10)加入50 μ Ι/well酶標抗體工作液，將培養板在2-8°C孵育1小時。用PBS洗 滌4遍去除未結合酶標抗體。
[0077] 11)每孔加入室溫平衡過的底物工作液50 μ 1，室溫反應7分鐘。以蒸餾水沖洗終 止反應，在37°C 2-3hrs或室溫過夜干燥培養板。
[0078] 免疫原測試結果和分析：
[0079] 免疫原性測試在胸科醫院分子生物學實驗室進行。測試選用一定數量的已臨床 確診的結核病患者，通過使用各種蛋白抗原檢測上述已確診患者的血樣，并由此結果分析 Rv3121蛋白抗原的免疫原性及應用方向，具體的檢測結果統計見下表1所示，
[0080] 表1. RV3121抗原對住院已確診結核病患者的結核分枝桿菌檢測結果
[0082] *注：T-SPOT雙抗原檢測結果，高低應答同時存在
[0083] 通過上表中的數據可以看出，
[0084] (l)Rv3121蛋白抗原單獨使用時，具有一定的檢測結核分枝桿菌的效果；
[0085] (2)針對使用ESAT-6、CFPlO抗原聯合檢測時無法確診的假陰性檢測結果，配合 Rv3121的抗原進行聯合免疫檢測，能夠獲得更為準確的檢測結果，提高病癥檢出率；
[0086] (3)陰性對照（隨機選取的另一段來源于結核分枝桿菌的已知蛋白片段Rv2327， 其核苷酸序列和氨基酸序列分別如SEQ ID NO. 3及SEQ ID NO. 4所示）則幾乎無法應用于 臨床檢測。
[0087] SEQ I:D. No. .4 Met Ser Fro. Ser· Pro. Ala Ala Ala A：sn Arg S'er Glu Yal Gly Gly Fro^ I 5 10 15 Leu Pro Gly Leu Gly Ala Asp Leu Leu Ala Val Val Ala Arg Leu Asn 20： 25 30 A.rg I」.e.u Ala. Thr Gln A'rg He Gln Met； Pro Leu Pro Ala. Ala Gln Ala 35 40 45 Ar-g. Leu. LeU Ala, T：hr lie GIii AIa .Gln .Gly Glii Ala Arg &ly Asp 50 55 60 Leu Ala Ala lal. Asp His Cys Ser Gln Pro Thr Met Thr THr Gln Val 65 70 75 80 Arg Arg Leu Glu Asp· Ala Gly Leu Val Thr Arg Thr Ala Asp Pro Gly 85 90 95 Asp Ala Arg Ala Val Arg He Arg Il：e Thr Pro Glu Gly Arg: 'Thr 100 105 HO L:e.u Thr: Ala Val Arg.Ha A:sp A.rg A.l:a Ala Ala 工丄-e Glu Pro: Gln Le:u li.5: 1.20· 12S Ala Leu Leu Pro Pro Ala Asp Arg Arg Val Leu Ala Asp Ala yal Asp ISO I3& 140 V：al .Leu· Arg： Arg： Leu Leu Asp- His· Ala, Ala Thr Thr Pro. Gly Ar：g Ala 145 ISO 155 160 Thr· Arg. Gln SEQ' ID No. 3· atgagtccct cccccgccgc cgccaaccgc agcgaggtcg gcgggccact accgggcctg 60 ggagcggatc tgttggcagt ggtcgcgcgg ctcaaccgcc togccacgca gcgcatccag 120 atgccactgc ccgcggctca agccagactg ctggccacca tcgaagccca gggggaagcc 180 cggatcggcg acttggccgc cgtcgatcac tgctcgcaac caacgatgac cacgcaggta 240 cgacgactcg aggacgctgg actggttacc cgaaccgccg acccgggaga cgcccgggcg 300 gtccgcatcc gcatcacgcc ggaaggcalc cgcacgttga ccgcggtgcg ggcagaccgc 360 gcggctgcga tcgagcctca gctggccctg ctcccaccgg cggaccgccg ggtgttggcg 420 gatgcggtag acgtgttgcg ccggctgctc gaccatgccg ccaccacgcc gggccgggcg 480 scgcggcaat ag 492
[0088] 最后需要說明的是，以上實施例僅供本領域技術人員理解本發明的實質，并不用 作對本法保護范圍的限定。
【主權項】
1. 一種檢測結核分枝桿菌的特異性蛋白抗原Rv3121，所述抗原的DNA序列如SEQ ID NO. 1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。2. 根據權利要求1所述的蛋白抗原的制備方法，包括如下步驟， 步驟⑴以（ktcmy'1-0 LR cl〇iiasc々_ Enzymc mix催化Rv3i2i的入門載體和 c;atcnv:丨y?pDEST.?!7載體重組生成RV3121的表達載體； 步驟（2)將步驟（1)所述Rv3121的表達載體轉化目標表達宿主，表達目標Rv3121蛋 白； 步驟（3)破碎細胞收集蛋白包涵體并復性目標蛋白。3. 根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于， 所述的步驟（1)的具體方法是： a. 克隆反應體系：Rv3121的入門載體1. 5 μ L，Gateway? pDEST_''"l7載體！ μ L， Gatewny? BPCbnasc? 丨丨:Enzyme mix 2· 5 μ L ;反應條件：25°C，過夜反應； b. 轉化方法：反應體系中加入100 μ L大腸桿菌DH5 α感受態，冰浴30min后，42°C熱 激90s，體系冰上放置lOmin，加入200 μ L LB培養基復性后，涂布在含100mg/l氨芐青霉素 的LB固體培養基上，37°C培養20h ; c. 質粒提取：以N96高純度質粒小提試劑盒DP114提取質粒，獲得Rv3121的表達載 體； 所述的步驟（2)的具體方法是： a. 取1 μ L步驟（1)獲得的質粒溶液加入100 μ 1大腸桿菌rosetta (DE3)感受態，冰浴 30min 后，42°C熱激 90s ; b. 體系冰上放置lOmin，加入200 μ L LB培養基復性后，涂布在含100mg/l氨芐青霉素 的LB固體培養基上，37°C培養12h ; c. 以0. 75mM IPTG誘導Rv3121蛋白表達； 所述的步驟（3)的具體方法是： a. 以重懸液：60mM tris PH 9. 0,0. 15M EDTA重懸細菌，在4°C條件下使用超聲波破碎 儀超聲破碎細菌； b. 4°C，lOOOOrpm離心15min收集沉淀即為固體形態包涵體； c. 以溶解液溶解包涵體；第一次透析：以截留分子量為3K的透析袋過夜透析將蛋白透 析，透析液成分為：20mM Tris-HCl ΡΗ 9·0，1Μ 尿素，3mM L-Argine ; d. 再透析第二次，透析液成分為：20mM Tris-HCl PH 9. 0，10mM NaCl，第二次透析：以 截留分子量為3K的透析袋過夜透析將蛋白透析至透析液，即可獲得可直接用于免疫原篩 選的蛋白。4. 權利要求1所述的Rv3121蛋白抗原作為檢測結核分枝桿菌免疫原的應用，所述的應 用包括， (1)將該Rv3121蛋白抗原單獨用于檢測結核分枝桿菌； 或（2)將該Rv3121抗原與現有結核分枝桿菌檢測抗原聯用，用于檢測結核分枝桿菌。5. 權利要求1所述的Rv3121蛋白抗原在制備結核分枝桿菌檢測試劑盒中的應用，所述 的應用為， (1)將所述的RV3121蛋白抗原單獨作為檢測抗原制備檢測試劑盒； 或（2)將所述Rv3121蛋白抗原和現有結核分枝桿菌檢測抗原協同聯用，增加現有抗原 免疫檢測準確度。6. 根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述的現有結核分枝桿菌檢測抗原為結 核分枝桿菌來源的ESAT-6抗原、CFP10抗原、PH)抗原、BCG抗原、LAM抗原、ES-31抗原。7. 由權利要求1所述的Rv3121蛋白抗原制備的單一抗原型結核分枝桿菌檢測試劑盒， 所述試劑盒包含， (1) 檢測有效量濃度（優選濃度為60ug/ml)的Rv3121蛋白抗原； (2) 必要的檢測試劑及顯色試劑。8. 包含權利要求1所述的Rv3121蛋白抗原的多抗原聯用型結核分枝桿菌檢測試劑盒， 所述試劑盒包含， (1) 檢測有效量濃度（優選濃度為60ug/ml)的Rv3121蛋白抗原，以及檢測有效量的其 他抗原； (2) 必要的檢測試劑及顯色試劑。9. 權利要求7、8所述的試劑盒的應用，其特征在于，所述的檢測方法為， (1) 檢測樣品為由待測患者血樣制備得到的抗凝全血或PBMC細胞； (2) Rv3121蛋白抗原作為免疫原與抗凝全血或者PBMC細胞孵育20-30個小時，優選 20-24個小時 (3) 檢測受到Rv3121蛋白抗原刺激分泌的細胞因子，與陽性參照對比確定檢測結果， 所述的細胞因子為 IFN-gamma、IFN-alpha、TNF-alpha、IL-2、IL-13、IP-10、IL-lra、GM-CSF、 MIP-lbetta、IL-6、IL-8、MCP-1、IL-10 和 IL-12,優選 IFN-gamma、TNF-alpha、IL-2、IL-13、 1卩-10、幾-1抑、61-〇5卩、]\〇?-1匕6?3，進一步優選正~131111^、了陬-31?1^、11^-2、比-13，最優 選 IFN-gamma〇
【文檔編號】G01N33/569GK105861520SQ201510028750
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2015年1月20日
【發明人】畢利軍, 張先恩, 朱國峰, 鄧教宇, 陶生策, 侯劍, 王雅果
【申請人】廣東體必康生物科技有限公司