一種能夠特異性結合癌細胞中的dkk1蛋白的適配子的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于醫學檢測領域，具體涉及一種能夠特異性結合癌細胞中的DKK1蛋白 的適配子。
【背景技術】
[0002] DKK1編碼一種分泌蛋白，其在脊椎動物發育至關重要的作用，并且是被稱為Wnt 信號通路的結腸癌細胞的負調節。DKK1是Wnt信號通路的抑制因子，最早克隆于1998年， 發現其在非洲爪蟾早期發育中能夠抑制fct誘導的軸的復制而參與頭部的形成。Wnt通 路是一條對胚胎發育起重要調節作用的信號通路，參與細胞增殖、分化、凋亡、細胞極性和 運動等過程，其通路中信號分子的突變或異常表達與多種疾病及癌癥相關。fct通路受幾 種分泌蛋白的調控，包括DKK、WIF(ffnt_lnhibitorfactor)和SFRP(secretedfrizzled relatedprotein)等。DKK家族包含進化上相對保守的4個成員（DKK1-4)。DKK1編碼一 個分泌型糖蛋白，含有兩個富含半胱氨酸的保守區域（Cysl、Cys2)，能夠與低密度脂蛋白 受體相關蛋白 5/6 (low_densitylipoproteinreceptor-relatedprotein5/6,LRP5/6) 結合，并在膜蛋白Kremenl/2參與下通過引起LRP5/6內吞，抑制Wnt-Frizzled_LRP5/6 復合體的形成，而抑制經典的fct信號通路。已知在10種不同類型人腫瘤細胞培養上清 中檢測出高濃度的DKK1蛋白，提示多種人腫瘤細胞分泌和高表達DKK1，DKK1可用于人類惡 性腫瘤的臨床血清診斷。而且，最新的研宄表明DKK1蛋白（Dickkopf- 1)可 作為腫瘤標志物用于肝細胞癌（HCC)的血清診斷，可用于篩檢甲胎蛋白（AFP)陰性患 者，對肝臟良、惡性疾病有較好的區分效用。因此，對DKK1蛋白進行特異性的檢測具有較好 的應用價值。
[0003] 核酸適配子（aptamer)是一種生物大分子的人工單鏈寡核苷酸配體，通過 SELEX(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment)技術從隨機單 鏈寡核苷酸文庫中篩選獲得。SELEX技術（即系統進化指數富集技術)是20世紀90年代初 研制/發展起來的一種新的組合化學技術，其運用大容量的隨機寡核苷酸文庫，結合體外 PCR擴增技術，以指數富集與靶分子特異結合的寡核苷酸，經過多輪篩選，獲得親和力高、特 異性強的核苷酸適配子（aptamers)。該技術己成功運用于許多祀分子的篩選，包括金屬離 子、有機染料、藥物、蛋白質、氨基酸以及各種細胞因子等。這種方法具有簡便、快速、經濟 等特點，與其他組合化學庫如隨機肽庫、抗體庫和噬菌體表面展示文庫相比，從寡核苷酸文 庫中篩選出的適配子具許多優勢：a.本身是寡核苷酸，分子量較小，可以化學合成，節約成 本。b.具有比抗體更高的親和性和特異性。c.便于標記，可以在不同部位有選擇性的標 記。d.重復性好，穩定性好，易于保存，對高溫和劇烈條件不敏感。因此，寡核苷酸適配子 /SELEX技術具有良好的應用前景，特別是在抗體工程領域。消減SELEX技術是識別癌與非 癌細胞間微小差異、篩選癌細胞特異性親和適配子的有力工具。
[0004] 核酸適配子篩選的基本步驟如下：設計并合成隨機單鏈寡核苷酸文庫；將文庫與 靶標共孵育，使文庫中能與靶標特異性結合的寡核酸與靶標形成復合物，分離復合物并洗 脫寡核酸，以洗脫的寡核酸為模板進行PCR擴增，制備成新的單鏈隨機寡核苷酸文庫，開始 下一輪篩選；重復數輪孵育-洗脫-擴增，與靶標高特異性和高親和力結合的核酸序列將 從文庫中篩選出來并被指數富集；對最后一輪篩選后制備的文庫進行克隆、測序，其中長度 及兩端序列與文庫相符者即為核酸適配子；測定各核酸適配子與靶標結合的特異性和親和 力，選出能高特異性和高親和力結合靶標者，即可應用于靶標的檢測分析。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的是提供一種DNA適配子，能夠特異性結合癌細胞中的DKK1蛋白，可 以來實現癌的診斷與治療。
[0006] 本發明采用以下技術方案： 體外合成一個含有38個隨機序列的單鏈DNA文庫，通過體外轉錄構建出單鏈DNA適 配子隨機文庫；以人DKK1蛋白其為靶蛋白，采用SELEX技術篩選具有高親和力的表面抗原 特異性DNA適配子；通過結構預測軟件RNAStructureProgram分析預測適配子的二級結 構；通過膜結合測定實驗、凝膠阻滯實驗鑒定篩選適配子對靶蛋白的特異性和親和力，得到 了多個與表面抗原親和力高、特異性強的適配子。所述的適配子都能形成各自的特異莖環 結構。所述適配子能特異性、高親和力地結合癌DKK1蛋白。所述適配子序列如下： DKK1-ap-2 ：GATAGCTAGATTAATGGTACAACACCTCCTCTCCTCTCCTAAGATACAATCCTCAACA AGCATAAGATAGGATCAGTAC； DKK1-ap-4 ：GATAGCTAGATTAATGGTACACAACCTCCTCCATAACCACCACAATTGTAACAACTTC AGCATAAGATAGGATCAGTAC； DKK1-ap-5：GATAGCTAGATTAATGGTACTTAACGCACAAAACTGTCATCCAATACTCAACCTTCTT AGCATAAGATAGGATCAGTAC； DKK1-ap-6 ：GATAGCTAGATTAATGGTACCCACTATTATTACCGCTTCAATCACACACACCATTATA AGCATAAGATAGGATCAGTAC； DKKl-ap-9：GATAGCTAGATTAATGGTACATCTTCACGCCTCATTACATTCACCTTTATCAGAACAA AGCATAAGATAGGATCAGTAC； DKKl-ap-11:GATAGCTAGATTAATGGTACAAACCCTTAGACTCAACTTCTTCCGCCATAAACTTCTA AGCATAAGATAGGATCAGTAC； DKKl-ap-12:GATAGCTAGATTAATGGTACCACATCCACCTCACATACGCACTAACTTACATCCTCAT AGCATAAGATAGGATCAGTAC； DKKl-ap-14：GATAGCTAGATTAATGGTACCATCGCTCATTTACCTCCTATAACTCTCAGATACACCC AGCATAAGATAGGATCAGTAC； DKK1-ap-15 ：GATAGCTAGATTAATGGTACATATATTCTACCGCCTCTAAAACAAAGACTCTTCAATC AGCATAAGATAGGATCAGTAC； DKK1-ap-17 ：GATAGCTAGATTAATGGTACCATTTATATTCACTTCTTCCTCACGCACTATACTTAAT AGCATAAGATAGGATCAGTAC； DKKl-ap-18：GATAGCTAGATTAATGGTACTCTAAGATAAACCACCACCAACTCTTATATATTACTTC AGCATAAGATAGGATCAGTAC； DKKl-ap-18' ：AACACCTCCTCTCCTCTCCTAAGATACAATCCTCAACA。
[0007] 本發明的有益效果：（1)獲得了能夠特異高效結合癌細胞中DKK1蛋白的適配子。 該適配子可以大量人工制備，方法簡單，成本低廉。（2)以核酸適配子為基礎可以制備成為 靶向癌細胞的診斷和治療藥物。
【具體實施方式】
[0008] 實施例1DKK1蛋白特異性結合DNA適配子的SELEX篩選 采用本領域常規的DKK1蛋白表達的方法。根據已知的基因序列，通過常規基因合成或 者基因組調取的方式來獲得相應的基因序列，采用酵母表達的方法體外表達DKK1蛋白，獲 得了相應的蛋白。也可以通過購買的方式獲得，比如ProSpec，貨號：PR0-673。
[0009] 化學合成初始寡核苷酸隨機文庫及引物，序列如下：（5'-GATAGCTAGATTAATGGTAC --N38--AGCATAAGATAGGATCAGTAC-3 ^ )，其中N38為38個隨機寡核苷酸； 引物PI:GATAGCTAGATTAATGGTAC; 引物P2 :GTACTGATCCTATCTTATGCT。
[0010] 將單鏈DNA文庫擴增為雙鏈DNA，產物經2%瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收純化；以 回收的雙鏈DNA為模板，體外轉錄出單鏈RNA隨機文庫，轉錄產物經PAGE純化。70yg RNA文庫經硝酸纖維素膜反篩去除與膜結合的RNA分子，然后與2ugDKK1蛋白37°C孵育 30min，反應液經硝酸纖維素膜濾過，洗滌濾膜；然后將濾膜剪碎，置于洗脫緩沖液（6mol/L 尿素，0? 6mol/L醋酸按，1.5mmol/LEDTA，0. 15%SDS)中煮沸4min，離心，取上清，無水乙 醇沉淀RNA，并重新溶解于20y1DEPC水中；以RNA為模板RT-PCR擴增雙鏈DNA，體外轉 錄出RNA文庫用于下一輪篩選；每輪篩選過程中RT-PCR得到雙鏈DNA文庫，以該雙鏈DNA 為模板體外轉錄出RNA適配子庫，篩選共進行11輪。最后獲得了 12個能夠具有較好的與 DKK1蛋白特異性結合的適配子，其序列分別如SEQIDN0 :1-12所示。
[0011]實施例2特異性高親和力的DKK1結合適配子的獲得 將RNA適配子分別取1.5yg，用牛小腸堿性磷酸酶（CIP) 37°C消化lh，純化回收 去磷酸化的RNA;通過T4多核苷酸激酶標記[y-32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末端。 lOnmol放射性標記的RNA適配子分別與不同濃度（l-200nM)的DKK1蛋白37°C孵育 30min，各組反應液經硝酸纖維素膜濾過，洗滌濾膜，干燥濾膜，液閃計數儀測定濾膜上殘留 的放射量，同一樣品平行做兩次測定。計算各個適配子與DKK1的解離常數。結果如下：
【主權項】
1. 一種特異性識別DKKl蛋白寡核苷酸序列，其特征在于為包括SEQ ID No. 1-12任一 條序列所示，或者在該序列的基礎上進行的一個或幾個核苷酸的替換，并保留其活性。
2. 權利要求1所示的寡核苷酸序列在檢測癌癥中的應用。
3. 權利要求1所示的寡核苷酸序列在用于制備識別DKKl蛋白的試劑盒應用。
4. 權利要求1所示的寡核苷酸序列在用于制備檢測癌癥中的試劑盒應用。
5. 如權利要求4所示的應用，其特征在于：所述癌癥為結腸癌、胃癌或肝癌。
【專利摘要】本發明公開了一種靶向人DKK1蛋白的核酸適配子及其序列。本發明應用新的組合化學技術SELEX，以DKK1蛋白為靶蛋白，從單鏈RNA隨機文庫中篩選出了能與DKK1蛋白特異性結合的DNA適配子。所述適配子在其隨機序列區域能形成特殊的莖環結構，能特異性、高親和力地結合DKK1蛋白或靶向結合至癌細胞。該適配子為癌癥診療領域提供了一種特異高效的標記分子，并為開發癌癥診斷試劑與治療藥物提供了新的選擇。
【IPC分類】C12N15-115, G01N33-68
【公開號】CN104830867
【申請號】CN201510303692
【發明人】楊洋
【申請人】楊洋
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2015年6月7日