擬南芥AtGDSL基因在油菜抗菌核病及促進種子萌發中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及擬南芥^化asz基因在油菜抗菌核病及促進種子萌發中的應用，屬于 植物基因工程和生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 油菜度rassicanapus)是我國第一大油料作物，我國油菜年種植面積700萬 公頃（1億畝)，占全世界的1/3,居世界首位，其所產菜巧油占我國整個食用植物油供應的 40% (沈金雄等，2007)。此外，菜巧油也用于生產生物柴油，是解決全球能源短缺的重要原 料作物。因此油菜不僅是食用油的主要來源，也是重要能源作物，具有十分重要的戰略地 位。然而由于我國耕地面積有限，短時期內無法通過增加種植面積提高油菜總產量，我國的 菜巧生產量目前僅能滿足國內2/3的消費需求，大量依賴進口。在當前和今后相當長的時 間內，我國都將面臨食用油和化石能源短缺的嚴峻局面。所W提高油菜的抗菌核病和產量 是我們目前急需解決的問題，除了傳統育種方法之外，隨著生物技術的發展，越來越多的人 們把目光投向通過遺傳改良的方法獲得性狀優良的油菜品種。
[0003] 油菜的生長受到眾多環境因素的影響，病原菌W及一些不利的非生物脅迫(包括 干旱、重金屬、鹽害、低溫、高溫等）都會對其產量造成極大損失，因此，利用基因工程技術， 將一些抗逆相關基因轉入到油菜品種中，培育既高產又抗逆的優質新品種是應對食物，能 源資源短缺有效途徑之一。為深入發掘并研究油菜抗逆相關基因，提供理論依據和基因資 源。
[0004] 油菜菌核病（Sclerotiniasclerotiorum化ib. )deBary)是限制我國油菜生產 的主要因子之一。在長江中下游及東南沿海油菜主產區，油菜菌核病的發生率很高，產量損 失高達50%W上；全國發生面積在7000萬畝W上，產量損失高達30%，嚴重時達到50-80%。 目前油菜菌核病的防治方法主要是化學防治技術和抗病品種的選育，但化學防治存在防效 不高、病原難W根除、花期噴藥困難W及農藥殘留、環境污染等諸多問題；常規育種因難W 找到有效的抗性材料W及速度非常緩慢等缺點，也很難有效解決抗病問題。由此，對抗菌核 病油菜品種進行分子改良，快速培育抗菌核病品種，是提高菜巧單位面積產量的重要策略。 油菜種子比較小，播種后如果±壤條件和氣候條件不合適時，如果種子的萌發不強的話，很 難得到全苗。特別是利用機械化直播時，種子萌發力強，對后期的出苗尤為重要。所W選育 適合全程機械化作業的油菜品種，萌發力強成為一個重要指標。
[0005]GD化脂肪酶家族是一個脂肪酶的重要超家族，植物GD化脂肪酶的功能研究主要 設及到參與生長發育、形態建成、油脂代謝和抗菌核病等生理方面（化等2005;凌華2006; Zhang等 2006;Kim等 2008;Updegraff等 2009;Agee等 2010)。辣椒的仍紅基因在 擬南芥和大腸桿菌中過量表達發現它具有水解酶活性，而且可W抑制假單胞菌和活體寄生 真菌的生長（JeumKyu化ng等2008)。在辣椒受到創傷時，辣椒的另外一個GD化脂肪酶基 因仍紅7可^通過調芐基因仍/資的表達而抵抗損傷（Ki-JeongKim等2008)。擬南芥 紅/W基因可W通過調節水楊酸途徑從而抑制黑斑病菌生長；擬南芥紅/化基因能在SA、JA和ET的信號的誘導下表達，并在生長素的負調控下抵抗胡蘿h軟腐歐文氏菌巧rwinia carotovora)的生長；擬南芥的一種編碼GD化-motif的脂肪酶基因化。在鹽誘導 下過表達能增強植物的耐鹽性，并且該基因在水楊酸調節下可激活對植物病原的抗性 (MiguelAngelNaranjo等 2006)。
[0006] 但對于擬南芥^化asz的作用，目前相關的文獻及專利報道甚少。在本研究中我們 發現，將外源^化asz基因導入油菜后所得到的轉基因植株植株對菌核病抗性顯著增強，種 子的萌發力也加強，運一結果對于增強油菜菌核病抗性及獲得適合機械化大規模生產研究 具有重要應用前景。

【發明內容】

[0007] 本發明要解決的技術問題是針對油菜育種中缺乏株抗病及種子萌發快的基因資 源，提供一種新的抗病及促萌發基因^化asz的用途，為提高油菜抵御菌核病和促進種子萌 發基因工程技術領域提供一種新的有效選擇。本發明的目的是提供利用外源擬南芥基因 asz的導入，來培育抗菌核病能力強、萌發快的油菜新材料。
[000引一種外源八做化基因及其同源基因在油菜抗菌核病中的應用，所述八做化基因 的核巧酸序列如SEQIDNO. 1所示；所述^化asz基因的同源基因核巧酸序列為與SEQID NO. 1至少90%同源的序列或功能相當于SEQIDNO. 1所示序列的亞片段。
[0009] 一種八仿做基因編碼的蛋白質，其氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0010] 本發明還提供一種包含所述^化asz基因的重組載體，其特征在于，構建所述重組 載體所選用的載體為可W引導外源基因在植物中表達的載體，本發明還公開了帶有^化asz 基因的重組載體PCAMBIA1300 -35S-AtGD化-NOS(載體PCAMBIA1300購于北京鼎國昌盛生 物公司）的構建過程。
[0011] 本發明還提供一種包含所述^化asz基因的轉化體，其特征在于，所述轉 化體的宿主為植物，所述植物為油菜。本發明還包括含有^化asz基因的重組載體 pCAMBIA1300-35S-AtGD化-N0S轉基因細胞系和宿主菌，W及油菜種子。
[0012] 本發明另外還提供一種包含所述^化asz基因在提高油菜抗菌核病及促進種子萌 發中的應用。
[0013] 實現本發明的技術如下： 為了獲得本發明的內容，對^化asz基因進行了深入和全面的研究，結果發現該基因的 過量表達顯著增強油菜對腐生營養型真菌核盤菌的抗性，此外，^化asz基因的過量表達可 提高油菜種子萌發速率，表明該基因在油菜育種等方面具重要應用前景。
[0014] 根據本發明的一個方面，上述目的可W通過提供植物核盤菌響應及促進種子萌發 基因來實現，所述基因含有SEQIDNO. 1核巧酸序列或與SEQIDNO. 1實質上同源的核巧 酸序列。
[0015] 根據本發明的一個方面，上述目的可W通過提供植物核盤菌響應及促進萌發蛋白 來實現，所述的蛋白含有SEQIDNO. 2核巧酸序列或與SEQIDNO. 2實質上同源的氨基酸 序列。
[0016] 根據本發明的另一個方面，上述目的通過提供含有^化asz基因超表達重組載體 pCAMBIA1300-35S-AtGD化1-NOS(本發明構建，請見實施例1)來實現對油菜植物抗菌核病 控制。
[0017] 根據本發明的另一個方面，上述目的可W通過提供用所述重組載體 pCAMBIA1300-35S-AtGD化-N0S轉化的微生物(根癌農桿菌GV3101，購自大連寶生物生物制 品有限公司，W下相同）來實現。
[0018] 根據本發明的另一個方面，上述目的可W通過提供用所述微生物（包含有 pCAMBIA1300-35S-AtGD化-N0S重組載體的根癌農桿菌GV3101轉化獲得抗性轉基因植株。 [001引本發明的優點： 1.本發明中所采用的農桿菌介導的體外浸薩滲透法轉化油菜，速度快、成本低、操作簡 單。
[0020] 2.本發明構建的pCAMBIA1300-35S-AtGD化-N0S載體轉化油菜后所獲得的^化aSZ 過量表達株系，為AtGD化的抗病功能研究提供了原材料，也可作為新的抗病育種材料，為 作物抗病育種提供了新的基因源，將有助于培育更優產高質的新品種，有很好的應用前景。
[0021] 3.抗菌核病遺傳研究對指導育種實踐、品種改良及品種推廣均具有重要意義，因 此發掘和鑒定作物抗菌核病基因，并深入探討抗菌核病基因的分子作用機理，具有重要的 理論意義和應用價值。^化asz轉基因油菜植株顯著提高菌核病抗性，運對油菜的生產育種 等具有重要指導借鑒意義。
[0022] 4.本發明所構建的八CaSL過表達植株可提高種子萌發速度，運為選育適合全程 機械化播種的油菜提供了新品種。
【附圖說明】
[0023] 圖1.八仿?化基因與其它物種同源氨基酸序列比對結果。
[0024] 其中各物種的縮寫為：Bn(《rassicana/ws):甘藍型油菜；At( 化siiana):擬南芥；Ca :辣椒；黑色區域顯示的為相同的氨基酸，灰色區域顯 示的為類似的氨基酸。
[00巧]圖2.植物轉化重組表達載體1300-35S-AtGD化-N0S構建示意圖。
[0026] 圖3.植物轉化載體1300-35S-AtGD化-N0S的T-DNA插入區結構示意圖。
[0027] 圖4.油菜八仿做的過表達株系PCR鑒定；圖中，1為DNA標準Marker2000; 2陽 性對照；3陰性對照即非轉基因野生型NY12 ;4、5、6分別為獨立的AtGD化過表達株系#12、 #18、#35。
[0028] 圖5.Q-PCR檢測過表達株系中^化a化的表達量結果；其中，NY12為非轉基因野生 型對照；#12、#18、#35均為獨立的^化aSZ過表達轉基因株系