特異性結合tm4sf5蛋白的新型單克隆抗體及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及特異性結合跨膜4L六家族成員5(TM4SF5)蛋白的新型單克隆抗體，和 更具體地涉及特異性結合人TM4SF5蛋白的單克隆抗體、編碼該單克隆抗體的多核苷酸、包 含該多核苷酸的表達載體、其中引入該表達載體的轉化體、制備該單克隆抗體的方法、包含 該單克隆抗體的組合物、利用該單克隆抗體治療癌癥的方法、利用該單克隆抗體抑制癌癥 肝轉移的方法、利用該單克隆抗體診斷癌癥的方法、和包括該單克隆抗體的癌癥診斷試劑 盒。
【背景技術】
[0002] 一般地，跨膜4超家族（TM4SF)蛋白是分子量為約25-50kDa、包括四個跨膜 結構域、兩個胞外環和兩個短胞質尾區的一類疏水蛋白質，也被稱為四跨膜超家族蛋白 (tetraspanin或tetraspan)。TM4SF蛋白與細胞粘附分子如整合蛋白一起在細胞膜上形成 復合物，從而建立龐大的四跨膜超家族蛋白富集的微型結構域（TERM)并貢獻于不同的生 物學功能，如細胞粘附、增殖、和迀移。
[0003] TM4SF5(跨膜4L六家族成員5或四跨膜L6超家族成員5)是四跨膜超家族蛋白 的成員，并且具有這樣的結構：包括穿過細胞膜的不溶性蛋白質的四個結構域、存在于胞外 的兩個環、存在于細胞質的一個環和兩個尾。TM4SF5是腫瘤相關抗原L6(TM4SF1)的同系 物，并且已知TM4SF5的mRNA在胰腺癌、胃癌、結直腸癌、軟組織肉瘤等的細胞中被高度過 表達。另外，已公開TM4SF5蛋白在COS7細胞中的人工表達可導致肌動蛋白重整和粘著斑 翻轉（focal adhesion turnover)，因此表明其涉及細胞遷移（Lee SA等，J Clin Invest 2008,118(4) :1354-66)。另外，TM4SF5蛋白與L6--癌癥相關基因--具有高的氨基 酸序列同源性，因此據說被懷疑是癌癥相關基因，并且還已被報道與癌癥發展和進程緊密 相關。TM4SF5涉及細胞增殖--通過促進G1/S周期進程經過胞內p27Kipl表達和RhoA GTP 酶活性（Kim H 等，Biochim Biophys Acta 20101803(8) :975-82)，并且在轉化生長因 子-0 l(TGF-0 1)和表皮生長因子受體（EGFR)之間的信號傳導途徑中的相互通信一一上 皮-間質轉化（EMT)涉及的主要因素--已知誘導TM4SF5的表達，從而引起EMT (Kang M 等，Biochem J 2012443(3) :691-700)。
[0004] 如上所述，隨著作為新的癌癥診斷的特異性蛋白質和抗癌靶的TM4SF5出現，研宄 已集中于以TM4SF為靶診斷癌癥。另外，關于以TM4SF作為靶的癌癥治療，研宄已集中于在 不同領域抑制TM4SF5的生物學活性。具體地，已對可抑制TM4SF5活性的化合物進行了研 宄。例如，在查爾酮化合物中，磺胺-或磺酸基-取代的查爾酮衍生物已被報道抑制TM4SF5 的生物學活性（韓國專利號10-0934706)。除抑制TM4SF5的生物學活性的化合物外，還已 突出了研宄特異性結合TM4SF5的單克隆抗體的重要性。具體地，關于臨床研宄，可用于通 過特異性結合TM4SF5,從而抑制TM4SF5的生物學活性來預防和治療癌癥的單克隆抗體的 研發需求升高。
[0005] 公開內容
[0006] 技術問題
[0007] 發明人在嘗試尋找可特異性結合人TM4SF5蛋白并有效抑制TM4SF5蛋白的生物學 活性如癌轉移的單克隆抗體時，研發了來自抗體庫的特異性結合人TM4SF5的新型單克隆 抗體，并確認該抗體可有效抑制TM4SF5的生物學活性，從而完成本發明。
[0008] 技術方案
[0009] 本發明的一個目的是提供特異性結合跨膜4L六家族成員5 (TM4SF5)蛋白的單克 隆抗體。
[0010] 本發明的另一目的是提供制備該單克隆抗體的方法。
[0011] 本發明的再一目的是提供編碼該單克隆抗體的多核苷酸、包含該多核苷酸的表達 載體、和包括引入其中的表達載體的轉化體。
[0012] 本發明的再一目的是提供包含該單克隆抗體的組合物。
[0013] 本發明的再一目的是提供包含該單克隆抗體的用于診斷癌癥的試劑盒。
[0014] 本發明的再一目的是提供利用該單克隆抗體治療癌癥的方法。
[0015] 本發明的再一目的是提供抑制肝癌轉移的方法，該方法包括給予該單克隆抗體至 疑患肝癌的對象。
[0016] 本發明的再一目的是提供診斷癌癥的方法，該方法包括利用該單克隆抗體，通過 抗原-抗體反應，檢測分離自疑患癌癥的對象的生物學樣品中的TM4SF5蛋白。
[0017] 有利效果
[0018] 根據本發明的TM4SF5-特異性單克隆抗體呈現對人TM4SF5蛋白的強親和力，并且 通過結合TM4SF5的EC2區域有效抑制TM4SF5的生物學活性如誘導癌轉移。因此，本發明 的TM4SF5-特異性單克隆抗體可有效用于診斷和治療TM4SF5介導的疾病如肝癌。
[0019] 附圖簡述
[0020] 圖IA是示例用于制備本發明的抗TM4SF5抗體的融合蛋白構建物--即，抗原蛋 白質構建物--的結構的圖，其由TM4SF5的跨越EC2 (胞外環2)的第113至第157殘基的 氨基酸區域、His-標簽、凝血酶裂解位點（TCS)、免疫球蛋白Fc片段和Myc-標簽組成；圖 IB顯示在表達和純化后通過SDS-PAGE確認的抗原蛋白；和圖IC顯示示例本發明的抗體篩 選方法的流程圖。
[0021] 圖2顯示對從HBX庫淘選的96個克隆進行的噬菌體ELISA的結果，其中，在其之 間，20個克隆呈現對TM4SF5EC2的陽性反應。
[0022] 圖3顯示選定克隆的序列分析結果和抗體可變區的人種系免疫球蛋白的使用類 型。
[0023] 圖4顯示對具有相互不同序列的克隆#1、#16、#27、#28、#45、#46、#73、#79、#85、 #88和#92進行的ELISA的結果。
[0024] 圖5顯示本發明的抗TM4SF5抗體的抗原結合親和力的分析結果。圖5A和圖5B 顯示對照細胞系（Cp)的FACS分析結果；和圖5C和圖顯示TM4SF5表達細胞系（Tp)的 FACS分析結果。另外，圖5E顯示蛋白質印跡分析結果。
[0025]圖6顯示通過親和層析純化本發明的五種抗體（#1、#27、#79、#88,和#92)的結 果，包括通過層析獲得的抗體#79、#88和#92的結果和在定量后通過凝膠電泳確認的五種 抗體的結果。
[0026]圖7顯示通過FACS分析的本發明的抗TM4SF5抗體（#1、#27和#79)對于對照細 胞系（Cp)、TM4SF5過表達細胞系（Tp)、T3、17和T16的抗原結合親和力的結果。
[0027] 圖8顯示利用本發明的抗TM4SF5抗體和一種陰性對照抗體（HAV)的免疫細胞化 學分析的圖像。圖8A顯示利用陰性對照抗體（HAV)的免疫細胞化學分析的結果；圖8B顯示 利用抗TM4SF5抗體#1的免疫細胞化學分析的結果；圖8C顯示利用抗TM4SF5抗體#27的 免疫細胞化學分析的結果；圖8D顯示利用抗TM4SF5抗體#79的免疫細胞化學分析的結果； 圖8E顯示利用抗TM4SF5抗體#88的免疫細胞化學分析的結果；和圖8F顯示利用抗TM4SF5 抗體#92的免疫細胞化學分析的結果，其中Tp、I7和T16表示TM4SF5過表達細胞，和Cp表 示對照細胞。
[0028] 圖9顯示利用市售抗人TM4SF5多克隆抗體（Proteintech group 18239-1-AP)的 免疫細胞化學分析的結果。
[0029] 圖IOA至IOC顯示利用本發明的抗TM4SF5抗體和抗Flag抗體--對照抗體-- 在Flag-標記的TM4SF5 (Flag-TM4SF5)過表達細胞系中進行的聯合免疫細胞化學分析的結 果。
[0030] 圖IlA至IlB顯示本發明的抗TM4SF5抗體對TM4SF5過表達細胞系（Tp)的侵入 的影響。
[0031] 圖12顯示通過抗TM4SF5抗體#1--本發明的代表性抗TM4SF5抗體--改變 Huh7肝癌細胞的迀移的結果。
[0032] 圖13A至13B顯示確認本發明的抗TM4SF5抗體對細胞迀移的影響的傷口愈合試 驗結果。
[0033] 圖14A至14B顯示確認本發明的抗TM4SF5抗體對細胞生長的影響的結果。
[0034] 圖15A顯示利用#1抗TM4SF5抗體--本發明的代表性抗TM4SF5抗體--染色 患有CC14介導的肝纖維化的動物模型的肝組織的結果，和圖15B顯示通過FACS確認的、在 人Chang肝細胞中表達的TM4SF5蛋白是否被識別的圖。
[0035] 最佳實施方式
[0036] -方面，本發明提供特異性結合跨膜4L六家族成員5 (TM4SF5)的單克隆抗體。
[0037] 如本文所用，術語"抗體"指代充當特異性識別抗原的受體的蛋白質分子，包括與 特定抗原具有免疫反應性的免疫球蛋白分子、和多克隆抗體、單克隆抗體、全抗體和抗體片 段。另外，該術語還包括嵌合抗體、人源化抗體、二價或雙特異性分子（例如，雙特異性抗 體）、雙抗體、三抗體和四抗體。全抗體具有兩個全長輕鏈和兩個全長重鏈，并且每個輕鏈 通過二硫鍵連接至重鏈。全抗體包括IgA、IgD、IgE、IgM和IgG，并且IgG具有IgGl、IgG2、 IgG3和IgG4亞型。抗體片段指代具有結合抗原的功能的片段，包括Fab、Fab'、F(ab'） 2、 Fv等。Fab具有由輕鏈、重鏈可變區、輕鏈恒定區和第一重鏈恒定區（CH1結構域）組成的 結構，并且其包括一個抗原結合位點。Fab'與Fab的區別在于其具有鉸鏈區，該鉸鏈區包括 重鏈CHl結構域的C端的至少一個半胱氨酸殘基。F(ab'）；^^體通過Fab'的鉸鏈區的半 胱氨酸殘基之間的二硫鍵形成。Fv(可變片段）指代最小抗體片段，其僅具有重鏈可變區 和輕鏈可變區。雙鏈Fv(dsFv)具有這樣的結構：其中重鏈可變區通過二硫鍵連接至輕鏈可 變區，單鏈Fv(ScFv)具有這樣的結構：其中重鏈可變區通過肽連接體共價連接至輕鏈可變 區。這些抗體片段可利用蛋白酶獲得（例如，Fab片段可通過用木瓜蛋白酶裂解全抗體而 獲得，而F (ab '）2片段可通過用胃蛋白酶裂解全抗體而獲得），優選通過基因重組技術。
[0038] 如本文所用，術語"單克隆抗體"指代由基本上相同的抗體克隆獲得的、顯示對特 定表位的單一結合特異性和親和力的抗體分子。
[0039] 一般地，免疫球蛋白具有重鏈和輕鏈，并且重鏈和輕鏈均包括恒定區和可變區 ('區'也被稱為'結構域'）。輕鏈和重鏈可變區包括三個互補性決定區（在下文中，"CDR"） 和四個框架區（FR)。CDR主要用于結合抗原表位。各鏈的CDR -般被稱為CDR1、CDR2、和 ⑶R3--自N端開始順序，并且也通過具體⑶R所在的鏈來區分。
[0040]同時，單克隆抗體，以其在人體的應用為目的，可以是抗原性減少的嵌合或人源化 抗體的形式，如上所述。
[0041] 如本文所用，術語"嵌合抗體"指代通過DNA重組技術在小鼠抗體可變區和人抗體 恒定區之間獲得的重組形式的抗體。嵌合抗體與小鼠抗體相比具有顯著提高的免疫應答， 因此可被臨床使用。
[0042] 如本文所用，術語"人源化抗體"指代以這樣的形式制備的抗體：其中小鼠單克隆 抗體的CDR序列的部分或全部被嫁接至人抗體。例如，人源化抗體可通過如下獲得：首先通 過在小鼠單克隆抗體的CDR和人抗體來源的FR之間進行重組制備人源化可變區，然后在所 得物和適當人抗體的恒定區之間重組，但不限于此。另外，考慮到僅小鼠源CDR的移植會降 低人源化抗體的親和力，將可影響CDR的三維結構的FR氨基酸殘基用小鼠抗體的氨基酸替 代，以提高人源化抗體的親和力，但不限于此。
[0043] 如本文所用，術語"特異性結合