專利名稱：一對擴增硫化桿菌屬16S rRNA基因的引物以及實時PCR定量檢測環境中硫化桿菌屬的方法
技術領域：
本發明涉及一對擴增硫化桿菌屬16S rRNA基因的引物以及實時PCR定量檢測環 境中硫化桿菌屬(Sulfobacillus)的方法。
背景技術：
生物冶金技術是利用微生物、空氣和水等天然物質從礦石中直接提取有價金屬， 而無需選礦及火法煉制的短流程清潔生產工藝，通過微生物氧化礦石產生硫酸高鐵和硫酸 等浸出劑，浸出過程基本不消耗除礦石、水、空氣以外的其它資源，沒有二氧化硫排放，資源 消耗低，對環境友好。生物冶金新技術使浮選-火法冶煉工藝不能利用的低品位及偏遠地 區銅資源得以大規模開發，并使過去長年堆存的表外礦即使含銅0. 1 %以下亦有經濟利用 價值。生物冶金技術被認為是二十一世紀礦產資源加工的戰略性技術。 生物冶金過程是一個化學過程，微生物的作用主要是氧化鐵和還原態硫，以及提 供溶解反應發生的空間(胞外聚合層)，但是細菌的作用是不能忽視的。浸礦環境中的細 菌可以分為兩種一種就是可以氧化鐵或(和)硫的細菌，如At. ferrooxidans，氧化Fe" 的速度是溶解氧氧化速度的5X 105 1 X 106倍，產生的Fe3+通過化學作用氧化硫化礦，氧 化硫產生的硫酸也可溶解一部分硫化礦；還有一種菌就是異養菌，它們通過代謝自養菌產 生的有機物獲得能量，一方面可以消除有機物對自養菌的毒害作用，另一方面可以在低氧 壓條件下異養生長，以Fe3+為電子受體，可以產生Fe2+供鐵氧化菌利用，如Acidiphilium acidophilum。 生物浸礦過程是一個復雜的過程，其中涉及多種因素(生物、化學、物理)的相互 作用，微生物群落會隨著浸礦環境中溫度、pH、溶解氧濃度、C02濃度、Fe37Fe2+、硫酸鹽濃度 和金屬離子濃度等的變化而變化，而微生物群落的變化就會影響到浸礦的效率。現有的浸 礦微生物檢測的方法多是基于PCR擴增后，再對所擴增的PCR產物進行檢測，這種終點法的 檢測往往不能真實的反應浸礦環境中的微生物組成。在PCR基礎上發展起來的real-time PCR技術，實現了環境中微生物組成的起點檢測，省去了電泳檢測的時間，使得檢測的時間 大大縮短，同時提高了檢測的準確性，并能夠檢測低至幾個拷貝的分子。
因此，real-time PCR技術的應用能夠解決快速定量檢測浸礦微生物的要求。

發明內容
本發明提供一對擴增硫化桿菌屬(Sulfobacillus) 16S rRNA基因的引物以及實時 PCR定量檢測硫化桿菌屬的方法，該方法實現了環境中微生物組成的起點檢測，省去了電泳 檢測的時間，使得檢測的時間大大縮短，同時提高了檢測的準確性，并能夠檢測低至幾個拷 貝的分子。 為實現上述目的，本發明采取以下技術方案 本發明提供的用于檢測硫化桿菌屬(Sulfobacillus)的引物對包括正向引物(F) (5， -GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和反向引物(R) (5， -TTCGTCCCGACAGACAGAG-3')(引物 由上海生工生物工程技術服務有限公司合成)。 這種利用權利要求1所述引物對的實時PCR的定量檢測硫化桿菌屬的方法，其特 征在于它包括以下步驟 (1)、選擇陽性克隆，提取該克隆的16S rDNA，以該DNA為模板用上述引物進行PCR 擴增，切膠純化，以純化后的基因組DNA為模板用上述引物進行PCR擴增，測定產物的吸光 度值，并將吸光度值轉化成DNA濃度，再將DNA產物的質量轉化為拷貝數；純化的PCR產物 定量后，進行梯度稀釋，并以PCR產物為模板，數據構建標準曲線； (2)、在實時定量PCR儀中擴增環境中硫化桿菌的16S rDNA基因，通過儀器檢測擴 增過程中相應的熒光信號，然后利用(1)中已建好的標準曲線將熒光信號轉換到起始反應 的核酸分子拷貝數。 由于細菌在進化過程中基因存在一定的突變，因此在引物設計時在Genbank中選 取某種細菌及相似細菌的16S rDNA序列進行比對，挑取該種細菌不同于別的細菌的序列作 為設計引物的基礎(用Promega 3)。 本發明提供的用于檢測硫化桿菌屬(Sulfobacillus)的方法為以上面提供的引 物對在實時定量PCR儀中擴增環境中硫化桿菌屬(Sulfobacillus)的16S rDNA基因。通 過儀器檢測擴增過程中相應的熒光信號，然后利用已建好的標準曲線將熒光信號轉換到起 始反應的核酸分子拷貝數，從而達到定量檢測環境樣品中硫化桿菌屬(Sulfobacillus)的數量。


圖1為硫化桿菌屬(Sulfobacillus)的標準曲線
圖2為3種樣品的熒光變化曲線圖
具體實施方式

實施例1 挑取本實驗室保存的與Sulfobacillus sp.(該標準菌株Sulfobacillus sp.可 從中國典型培氧物保藏中心購買(武漢)，Sulfobacillus sp的特點是嗜酸，生存在pHl-5 之間，該屬細菌為功能浸礦菌，部分種可以氧化鐵、硫，某些種則只氧化硫)具有99%相似 性的陽性克隆，提取該克隆的16S rDNA，以該DNA為模板用上述引物進行PCR擴增，采用 Applied Biosystems的GeneAmp PCR System 2700型基因擴增儀。50iil的反應體系組 成為5Xbuffer 10iil，25mM Mg2+ 3 ii 1， 10mM dNTP 1 P 1，正向引物(F) 0. 5 ii 1，反向引物 (R)O. 5iil，模板liil，GoTaq DNA聚合酶O. 25 iU，無菌去離子水33. 75iU，每個樣品做3個 重復。反應條件為95。C預變性2min，然后為30個循環的95。C變性45s，54。C退火45s，72t: 延伸lmin，最后72t:延伸10min。反應結束后將所得PCR產物按照Promega的Wizard SV Gel and PCRClean-Up System操作說明進行切膠純化。純化后的PCR產物采用0ptizen2120 紫外分光光度計(Mecasys Co. ，Ltd.)在260nm測定產物的吸光度值。然后根據公式(濃度 =0D260 X 50 ii g/ml X稀釋倍數)將吸光度值轉化成DNA濃度。再根據下面的公式將DNA 產物的質量轉化為拷貝數
^驢(g)纖口德羅常數=幽考賺 單個堿基的平均摩爾質量x模板長度 對于雙鏈DNA，采用660g/摩爾/堿基。10—9g的400bp的PCR產物相當于2. 51X109 個拷貝。 純化的PCR產物定量后，進行梯度稀釋，使得PCR產物的拷貝數為107-101。以 此PCR產物為模板，利用Corbett Research的Rotor-Gene 6000實時定量PCR儀進行擴 增。25 ill的反應體系組成為12. 5 ill的含有SYBRGreen I染色劑、AmpliTaq Gold DNA 聚合酶、dNTPs和緩沖溶液的SYBRGreen PCR Master Mix(Applied Biosystems，為進口的 一種試劑名稱)，正向引物(F)6. 25pmol，反向引物(R)6. 25pmol，模板1 yl，無菌去離子水 6. 5iU，每個樣品做3個重復。反應條件為95t:預變性5min，然后為45個循環的95。C變 性15s，6(TC延伸lmin。反應結束后，將溫度由65"C緩慢升至95"C進行溶解曲線分析，檢測 反應的特異性。 反應結束后，將溫度緩慢升高，此時雙鏈DNA解鏈成為單鏈，內參的熒光染料會被 釋放出來，熒光信號逐漸減弱。基于產物長度和G/C含量的不同，擴增產物會在不同的溫度 點解鏈。隨著產物的解鏈就可以看到熒光值的降低并被儀器所測量。對溶解曲線進行微 分可以計算出溶解峰。溶解峰可以反映反應中擴增到的產物，因此用溶解曲線就可以對反 應的特異性進行監督了。如果溶解曲線只有一個峰，說明反應的特異性很好，如果出現多個 峰，說明有非特異性產物生成，結果就不可信。 反應結束后，利用軟件(軟件為Rotor-Gene 6000 series software versionl. 7(Build 3))將反應中的數據構建標準曲線(如圖1) 。 R表示所構建標準曲線的 相關系數，R'2表示標準曲線相關系數的平方，M表示標準曲線的斜率，B表示標準曲線的截 距，Efficiency表示反應的擴增效率。通常好的標準曲線R > 0. 99， R'2 > 0. 97。
實施例2 分別提取3種環境樣品(搖瓶浸出、柱浸和生物堆浸)中的微生物基因組DNA，用 Promega的基因組DNA純化試劑盒(Promega， USA)，按照操作說明將DNA粗提液純化。以純 化后的基因組DNA作為模板，利用Corbett Research的Rotor-Gene 6000實時定量PCR儀， 采用特異性擴增硫化桿菌屬(Sulfobacillus)、引物對進行擴增。25iU的反應體系組成 為12. 5 iil的含有SYBR Green I染色劑、AmpliTaq Gold DNA聚合酶、dNTPs和緩沖溶液 的SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)，正向引物(F)6. 25pmol，反向引物 (R)6. 25pmol，模板liil，無菌去離子水6.5ia，每個樣品做3個重復。反應條件為95"預 變性5min，然后為45個循環的95。C變性15s，6(TC延伸lmin。反應結束后，將溫度由65°C 緩慢升至95t:進行溶解曲線分析，檢測反應的特異性。然后導入已建立的標準曲線利用熒 光定量PCR儀自帶的軟件計算Ct值，之后將Ct值轉化為核酸分子的拷貝數。然后根據轉 化系數(Sulfobacillus sp.為6)將拷貝數轉化為細胞數。(由于細菌通常存在多個拷貝 的16S rRNA基因，因此需要一個轉化系數， 將拷貝數轉化為細菌數，這個轉化系數在Zammit， C. M. ， Mutch， L. A. ， Watling， H. R. and Watkin， E丄J. ， 2008. Evaluation of quantitative real—time polymerase chain reaction forenumeration of biomining microorganisms in cultureHydrometallurgy 94(卜4) :185-189.中可以查閱。) 經計算硫化桿菌屬(Sulfobacillus)在3種樣品中的數量分別為4. 5X102/mL、69. 7/mL、L 2X104/g。 申請人:采用本方法檢測過多種其他菌種(包括大腸桿菌、假單胞菌，以及四種待檢測細菌互相進行引物驗證)，結果發現反應特異性很好，非待測菌株曲線不起飛，沒有信號。 本發明的檢測限為10個拷貝，檢測在10-10~7(10-107)個拷貝間。
序列表 〈110〉北京有色金屬研究總院 〈120〉一對擴增硫化桿菌屬16S rRNA基因的引物以及實時PCR定量檢測環境中硫
化桿菌屬的方法
〈130〉〈160>2〈170>PatentIn version〈210>1〈211>19〈212〉DNA〈213〉人工合成〈400>1gagtttgatc ctggctcag〈210>2〈211>19〈212>DNA〈213〉人工合成〈400>2ttcgtcccga cagacagag
權利要求
一對擴增硫化桿菌屬16S rRNA基因的引物，其特征在于所述的引物對包括正向引物和反向引物，所述的正向引物的序列是5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物的序列是5’-TTCGTCCCGACAGACAGAG-3’。
2. —種利用權利要求1所述引物對的實時PCR的定量檢測硫化桿菌屬的方法，其特征在于它包括以下步驟(1) 、選擇陽性克隆，提取該克隆的16S rDNA，以該DNA為模板用上述引物進行PCR擴增，切膠純化，以純化后的基因組DNA為模板用上述引物進行PCR擴增，測定產物的吸光度值，并將吸光度值轉化成DNA濃度，再將DNA產物的質量轉化為拷貝數；純化的PCR產物定量后，進行梯度稀釋，并以PCR產物為模板，數據構建標準曲線； 2) 、在實時定量PCR儀中擴增環境中硫化桿菌的16S rDNA基因，通過儀器檢測擴增過程中相應的熒光信號，然后利用(1)中已建好的標準曲線將熒光信號轉換到起始反應的核酸分子拷貝數。
3. 根據權利要求1所述的實時PCR的定量檢測硫化桿菌屬的方法，其特征在于所用的反應體系組成為12. 5iU的含有SY服Green I染色齊U、 AmpliTaq Gold DNA聚合酶、dNTPs和緩沖溶液的SYBR Green PCRMaster Mix,正向引物(F) 6. 25pmol，反向引物(R)6. 25pmol，模板1 y l，無菌去離子水6. 5iU，每個樣品做3個重復。
4. 根據權利要求1所述實時PCR的定量檢測硫化桿菌屬的方法，其特征在于所用的反應條件為95。C預變性5min，然后為45個循環的95。C變性15s，60。C延伸lmin。
5. 根據權利要求1所述實時PCR的定量檢測硫化桿菌屬的方法，其特征在于所述的環境為生物浸出液或酸性礦坑水。
全文摘要
本發明提供一對擴增硫化桿菌屬16S rRNA基因的引物以及實時PCR定量檢測環境中硫化桿菌屬(Sulfobacillus)的方法。所述的引物對包括正向引物的序列是5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物的序列是5’-TTCGTCCCGACAGACAGAG-3’。與傳統方法相比，本方法具有時間短、通量大、工作量小、可靠性高的優點，從樣品的處理到定量檢測環境中硫化桿菌屬(Sulfobacillus)的時間縮短至4小時，而且由于是一種起始檢測法，檢測結果更加準確。
文檔編號G01N21/64GK101705286SQ20091020458
公開日2010年5月12日 申請日期2009年12月1日 優先權日2009年12月1日
發明者劉興宇, 劉文彥, 姚國成, 陳勃偉 申請人:北京有色金屬研究總院