誘導3-4小時表達量最多。
[0204] 2、表達條件及表達形式鑒定
[0205] 將CE/pET-30a大腸桿菌工程菌接種于10ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培養液 中，置37°C恒溫振蕩器過夜培養后，按體積百分含量1%轉種到2瓶50ml含50μg/ml硫酸卡那 霉素的LB培養液中，置37°C恒溫振蕩器培養至OD600為0.6 - 0.8時，加入終濃度為0.5mmol/L 的IPTG，分別于37°C與15°C進行誘導4hr，分別得到CE/pET-30a大腸桿菌工程菌37°C誘導后 的菌液和15°C誘導后的菌液。分別將菌液中的菌體超聲破碎，離心后，得到CE/pET-30a大腸 桿菌工程菌37°C誘導后的上清和沉淀以及CE/pET-30a大腸桿菌工程菌15°C誘導后的上清 和沉淀，將各上清和沉淀分別進行SDS-PAGE電泳分析，部分結果如圖9所示。
[0206] 圖9中，1:蛋白質分子量標準（TaKaRa_D530A:從上至下條帶大小依次為97.2， 66 · 4，44 · 3，29 · 0，20 · lkDa); 2: CE/pET-30a大腸桿菌工程菌37°C誘導后的上清；3: CE/pET-30a大腸桿菌工程菌15°C誘導后的上清。
[0207] 圖9表明，CE/pET_30a大腸桿菌工程菌在37°C與15°C分泌表達的重組融合蛋白CE 均存在于其菌液的上清中。
[0208]四、重組融合蛋白CE的高密度、高表達發酵
[0209] 1、對CE/pET_30a大腸桿菌工程菌(重組菌)進行100L發酵罐的高密度發酵，在對數 生長期進行IPTG誘導，誘導后4h放罐。
[0210] 發酵過程如下：
[0211] (1)種子培養
[0212] 以0.1 %的接種量將甘油管中保存的CE/pET_30a大腸桿菌工程菌接入裝有200ml LB培養基(含50μg/ml的卡那霉素）的500ml三角燒瓶中，200r/min，37°C培養8-12h至OD 6q0達 到3.0-6.0,得到種子液。
[0213] ⑵發酵罐培養
[0214] ①發酵培養基和補料培養基的配方如表2所示。
[0215] 表2發酵培養基和補料培養基的配方
[0218] ②將步驟(1)得到的種子液按照2%的接種量接種于發酵培養基中進行發酵培養， 培養溫度37°C、pH6.8、控制溶氧范圍在30-80%，采用指數流加補料策略（以發酵培養的培 養液的糖含量小于lg/L為標準調節補料補加速度）。0〇6〇〇達到25-35時開始誘導表達，誘導 劑IPTG終濃度為0.5mM，誘導4h后終止發酵培養。采用100L發酵罐連續培養5批，結果如表3 所示。
[0219] 表3發酵過程參數記錄
[0220]
[0221] 2、分別取步驟1中CE/pET_30a大腸桿菌工程菌IPTG誘導后lh、2h、3h和4h的發酵液 和誘導前的CE/pET-30a大腸桿菌工程菌的發酵液進行菌體超聲破碎，離心分別取CE/pET-30a大腸桿菌工程菌誘導lh、2h、3h和4h的發酵液的上清和誘導前的CE/pET-30a大腸桿菌工 程菌的發酵液的上清進行SDS-PAGE分析，結果如圖10所示。
[0222] 圖10中，1:蛋白分子量標準；2:誘導前的CE/pET_30a大腸桿菌工程菌的發酵液的 上清;3-6分別代表CE/pET-30a大腸桿菌工程菌誘導lh、2h、3h和4h的發酵液的上清;箭頭所 指為重組融合蛋白CE的條帶。
[0223] 結果表明，IPTG誘導4h時，重組融合蛋白CE的表達量達到最大，目的蛋白表達量大 于4g/L。
[0224] 五、重組融合蛋白CE的純化及鑒定
[0225] 1、菌體收集及破碎
[0226] 采用管式離心機收集CE/pET_30a大腸桿菌工程菌菌體，然后將菌體按體積比1:5 比例重懸于20mM Tris緩沖液(pH8.0)中，以12000psi均質壓力破碎菌體2次。
[0227] 2、上清液收集
[0228] 采用lOOOOrpm離心20min收集破碎后上清液。
[0229] 3、超濾濃縮I
[0230] 大腸桿菌菌體破碎后，釋放出大量雜質且料液的體積較大，不利于層析處理，因此 首先采用超濾方法進行初步分離和濃縮。
[0231] 重組融合蛋白CE蛋白理論分子量為21，035Da，因此首先選用300KD超濾膜進行透 析，以截留離心殘留的微量固形物及部分高分子雜質，然后采用5KD超濾膜進行濃縮以去除 小分子雜質，濃縮至3-5倍體積時用3-5倍置換液I(20mM Tris，pH8.0)進行緩沖液置換。
[0232] 4、DEAE sepharose Fast Flow柱純化
[0233] 采用緩沖液CIA相（20mM Tris，pH8.0)和C1B相（20mM Tris，0.3M NaCl，pH8.0)。用 CIA相平衡陰離子交換柱DEAE sepharose Fast Flow柱(柱的內徑為200mm)2.0-4.0個柱體 積，收集平衡液;將步驟3得到的濃縮液上柱，收集穿出液;采用0-70 % B線性梯度洗脫，收集 洗脫液，洗脫體積為10個柱體積，流速為30L/h，檢測波長為280nm。對洗脫液的主峰進行RP-HPLC分析，RP-HPLC分析條件為:C4分析柱(型號Kromasil C4 300-5C4)，溫度30°C，檢測波 長214nm，流速lmL/min。按表4進行梯度洗脫(其中流動相A為0.1 %三氟乙酸-水溶液，流動 相B為0.08 %三氟乙酸-乙腈溶液），得到主峰蛋白。結果如圖11所示。
[0234] 表4洗脫程序
[0235]
[0236] 5、Aminobutyl Sepharose 6Fast Flow柱純化
[0237] 采用緩沖液C2A相(20mM Tris，pH8.0)和C2B相（20mM Tris，0.3M NaCl，pH8.0)。用 C2A相平衡離子交換柱Aminobutyl Sepharose 6Fast Flow柱（柱的內徑為100mm)2.0-4.0 個柱體積，將步驟4得到的主峰蛋白用C2A相稀釋1-2倍上柱，采用20 % C2B相預洗1.5-2.0個 柱體積后20 % B-70 % B線性梯度洗脫，收集洗脫液，洗脫體積為10個柱體積，流速為15L/h， 檢測波長為280nm。對洗脫液的主峰進行RP-HPLC分析，RP-HPLC分析條件為:C4分析柱(型號 Kromasi 1 C4 300-5C4)，溫度30°C，檢測波長214nm，流速lmL/min。按表5進行梯度洗脫（其 中流動相A為0.1 %三氟乙酸-水溶液，流動相B為0.08 %三氟乙酸-乙腈溶液），得到主峰蛋 白。結果如圖12所示。
[0238] 表5洗脫程序
[0239]
[0240] 6、超濾濃縮Π
[0241 ] 經步驟5的Aminobutyl Sepharose 6Fast Flow層析后收集的主峰蛋白，采用5KD 超濾膜進行緩沖液置換。首先將目的蛋白濃縮3-5倍體積后，然后用置換液n(20mM Tris， pH8.0溶液)置換3-5倍體積至透過液電導至2.0以下。
[0242] 7、Q Sepharose High Performance柱純化
[0243] 采用緩沖液C3A相（20mM Tris，pH8.0)和C3B相（20mM Tris，0.3M NaCl，pH8.0)。用 C3A相平衡離子交換柱Q Sepharose High Performance柱(柱的內徑為50mm)2·0_4·0個柱 體積，收集平衡液，將步驟6得到的濃縮液上柱，收集穿出液，采用0-70 % B線性梯度洗脫，收 集洗脫液，洗脫體積為10個柱體積，流速為30L/h。檢測波長為280nm。對洗脫液的主峰進行 RP-HPLC分析，RP-HPLC分析條件為:C4分析柱(型號Kromasil C4 300-5C4)，溫度30°C，檢測 波長214nm，流速lmL/min。按表6進行梯度洗脫(其中流動相A為0.1 %三氟乙酸-水溶液，流 動相B為0.08%三氟乙酸-乙腈溶液），收集主峰蛋白。結果如圖13所示。
[0244] 表6洗脫程序
[0245]
[0246] 8、超濾濃縮ΙΠ
[0247] 經步驟7的Q Sepharose High Performance層析后收集主峰蛋白，經5KD超濾膜濃 縮至1.0-1.51^，用置換液111(5.4888/1枸櫞酸鈉(二水）、0.2818/1枸櫞酸(一水）、0.48/1聚 山梨酯20，pH 6.3)置換12-15倍體積，控制最終濃縮液總體積為1 -1.5L。按照設定體積加入 終濃度94.5g/L海藻糖(二水)攪拌溶解，調節pH至6.3 ± 0.1，最后用置換液III (5.488g/L枸 櫞酸鈉(二水）、〇. 281 g/L枸櫞酸(一水）、0.4g/L聚山梨酯20，pH 6.3)補齊至設定體積。
[0248] 9、除菌過濾
[0249] 將步驟8得到的超濾濃縮液經0.22μπι除菌過濾器過濾于無菌PE瓶(Nalgene)中即 為原液。于_70±10°C避光密封保存，有效期暫定為24個月。
[0250] 六、重組融合蛋白CE的鑒定
[0251] 1、步驟五最后純化的重組融合蛋白CE的N端15個氨基酸分析結果為 MAEMKTDAATLAQEA，與設計的重組融合蛋白CE(SEQ ID如.2所示的蛋白州端的15個氨基酸 序列完全一致。
[0252] 2、純化的重組融合蛋白CE的質譜測定分子量為21035Da，與理論計算的分子量 2103?a(SEQ ID如.2所示的蛋白的分子量)非常接近。
[0253] 采用該實施例步驟五最后純化的重組融合蛋白CE進行下述實施例2和3。
[0254] 實施例2、純化的重組融合蛋白CE用于豚鼠皮膚試驗
[0255] 將實施例1制備的純化的重組融合蛋白CE用于豚鼠的皮膚試驗，以其作為皮膚變 態反應原，獲得了理想的遲發型超敏反應，特異性高于現有商品化的結核菌素純蛋白衍化 物(pro)。
[0256] -、菌體的培養和熱滅活菌體的制備及定量
[0257] 以下操作均在無菌條件下進行：
[0258] 1、種子培養
[0259] 將13種菌株標準株結核分枝桿菌H37Rv(M. tuberculosis)、卡介菌(M.bovis BCG， 簡稱BCG)、牛結核分枝桿菌(M.bovis)、猿分枝桿菌(M. simiae，ATCC 25275)、蘇加分枝桿菌 (M.szulgai，ATCC 35799)、戈登分枝桿菌（M.gordonae，ATCC 14470)、胞內分枝桿菌 (M. intracellulare，ATCC 13950)、淺黃分枝桿菌(M. gilvum，ATCC 43909)、不產色分枝桿 菌(]\1.]1〇11。]11'〇1]1〇8611；[。11111，1]\0481)、金色分枝桿菌(]\1.&111'11111，41'0^ 23366)、堪薩斯分枝桿 菌(M. kansasii，ATCC 12478)、微黃分枝桿菌(M. flavescens，ATCC 14474)和草分枝桿菌 (M.phlei，ATCC 11758)的干粉管分別用無菌水混勻，分別接種至改良羅氏培養基，37°C培 養3周，等生長成菜花狀，再分別轉種在50ml蘇通培養基的三角錐形瓶中，放37°C培養3周使 其成膜生長，如菌膜生長不多，需再轉種，直至菌膜成片浮在培養基表面時，再擴大培養。 [0260] 2、擴大培養
[0261] 每個500ml三角燒瓶中裝蘇通培養基200ml，將上述步驟1的種子瓶內的菌膜分別 轉種于蘇通培養基液體上面，勿震蕩，盡量使菌膜浮在培養基表面，37°C培養3-4周。
[0262] 3、菌株滅活
[0263] 將步驟2的各菌株培養瓶置80°C恒溫水浴熱滅活3小時。
[0264] 4、菌體洗滌
[0265] 將步驟3得到的各菌液于5000rpm離心10min，棄上清，用無菌PBS洗滌菌沉淀，反復 三次。在電子天平上稱取各細菌重量。
[0266] 5、菌體破碎
[0267] 用適量的無菌PBS混懸步驟4得到的各菌沉淀，在冰浴條件下超聲破碎菌體(共15 分鐘）。
[0268] 6、確定菌濃度
[0269] 用無菌roS稀釋步驟5得到的各菌體，使菌濃度為20mg/ml (濕重）。臨用前，加入等 體積的弗氏不完全佐劑，使各分枝桿菌終濃度為l〇mg/ml，得到各滅活的分枝桿菌菌液。 [0 270]二、皮膚試驗
[0271] 1、豚鼠致敏
[0272] 豚鼠觀察7d后，背部剪毛，進行PPD皮試，PPD皮試方法為:皮內注射5IU PPD，注射 后24h、48h、72h觀察注射部位有無紅腫和硬結反應。若無反應或反應很弱(直徑小于5mm)的 豚鼠，則為PH)皮試陰性，用于致敏。
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