結核分枝桿菌pcr-lfb檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了結核分枝桿菌PCR?LFB檢測試劑盒，是在對結核分枝桿菌復合群IS6110基因序列分析的基礎上，選取保守基因序列設計出一對特異性寡核苷酸引物和一對經特定標記的寡核苷酸探針，利用PCR技術結合側向流生物傳感器對結核分枝桿菌進行檢測。此技術僅需要常規的PCR儀和一次性側向流生物傳感器便能完成對臨床樣本的檢驗，將分子診斷技術在專業醫療檢測機構，尤其是基層醫療機構推廣，具有潛在的應用價值。檢測時間周期短、檢測效率高；檢測特異性強，準確率高；在進行病原體定性分析是其檢測靈敏度名顯高于普通PCR檢測方法；操作簡單、易于推廣；實驗結果重復性好。
【專利說明】
結核分枝桿菌PCR-LFB檢測試劑盒
[0001 ]
技術領域： 本發明屬病原體檢測領域，具體涉及結核分枝桿菌PCR-LFB檢測試劑盒。
[0002]
【背景技術】： 結核病(tuberculosis，TB)作為一種人重大傳染性疾病，威脅著人類的生命安全。全世 界每年新發結核病例約有1000萬，死亡人數約有200萬。在我國每年新增患者數約200萬，死 亡人數約25萬。截止到2013年，全球約有900萬人患結核病，其中中國患者約占總數的11%; 此外還有150萬結核病患者死亡，其中包括36萬人為結核病和艾滋病毒共感染患者。
[0003] 結核病的檢測方法主要有臨床診斷、病原學診斷、血清學診斷、分子生物學診斷等 方法。然而臨床診斷準確度低;病原學診斷涂片陽性率低;血清學診斷成本高，對操作者要 求高，對實驗室設備要求也高，同時，該方法也不利于傳染病的早期診斷。現在常用且檢測 準確度高的方法主要是借助PCR手段的分子生物學診斷。常規PCR技術，在操作過程中需要 瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增物進行檢測，該方法操作復雜、設備投入高，同時需要核酸染料 EB，從而增加了對實驗環境的污染。鑒于以上原因，常規PCR技術尚不能作為常規檢測技術 被廣泛應用。隨著技術的進步，熒光定量PCR(qPCR)技術由于具有檢測快速、靈敏度高等優 點被越來越多的應用于傳染病的早期檢測。但該技術需要昂貴的定光定量PCR儀，并且需要 專業人員來操作。目前，其應用主要集中在發達國家或有條件的專業檢測機構，這就極大地 限制了該技術的推廣及應用。
[0004] 本研究利用一種一次性側向流生物傳感器實現對檢測核酸擴增物的檢測，檢測結 果通過肉眼即可判讀，時間少于5分鐘。靈敏度是常規電泳法的100倍以上。該技術擺脫了核 酸檢測對昂貴設備(如電泳儀、熒光檢測儀)和對專業化人員的依賴。這為專業實驗室，基層 實驗室、開展結核分枝桿菌的檢測提供了新思路。
[0005]

【發明內容】
： 本發明的目的是為了解決結核分枝桿菌檢測設備昂貴，不利于推廣的問題，而提一種 結核分枝桿菌PCR-LFB檢測試劑盒。
[0006] 結核分枝桿菌特異性寡核苷酸引物和經特定標記的寡核苷酸探針， 它的引物序列： 上游引物:5-CGATCGTGGTCCTGC-3 '， 下游引物：5 ' -AACTACGGTGTTTACGGTGC-3 '。
[0007] 修飾寡核苷酸探針為： PI:5，-GCGGCAAAGC-FAM-3，； P2: 5-Biotin-GAGGGCATCGA-3，。
[0008] 結核分枝桿菌PCR-LFB檢測試劑盒，它包括：引物、探針和側向流生物傳感器，所述 的引物、探針為上述的結核分枝桿菌特異性寡核苷酸引物和經特定標記的寡核苷酸探針； 所述的側向流生物傳感器是由下述方法制備的： 1 )30nm膠體金制備:在525nm有最大吸收峰（紫外掃描光譜），0D值為0.882，氯金酸:檸 檬酸三鈉1:1.25; 2) 膠體金與鏈霉親和素標記：以標記lmL膠體金為例，加入14yL 0.2M K2CO3混勻，使膠 體金pH在SA等電點附近;加入lyL濃度為lOyg/yl的SA，手搖混勻lOmin;加入20yL10% BSA封 閉 lOmin，再加入20yL10% PEG20000封閉 lOmin，4° C，7000rpm，離心 15min，去上清，用（10mM PBS+0.5% Triton X-100+0.3% BSA，pH 7.4的復溶液按原體積復溶，金標結合墊切成0.9cm X 30cm大小，用移液器將復溶后的標記物鋪在金標結合墊上，37° C干燥3-4小時，備用。每根 膜條處理量為1.809mL; 3) 樣品墊處理:樣品墊切成1.7cmX30cm大小，用移液器將配制好的樣品墊處理液鋪在 樣品墊上，37°C烘干，每根膜條處理量為3.417mL; 4) 活化的Biotin與BSA偶聯：Sulfo-NHS-Biotin與BSA按摩爾比為20:1于4°C偶聯過 夜。0.2μπι微孔濾膜過濾，隨后劃于硝酸纖維素膜質控線--C線上。具體操作步驟為：稱取 O.lg BSA溶于 10 mL PBS緩沖液中，調節ρΗ7.4;加入5mg Sulfo-NHS-Biotin于3.7mL BSA 中，混勻，并于4°C條件下，攪拌偶聯過夜;0 · 22μπι過濾，-20°C保存。
[0009] 5)控制線制備：硝酸纖維素膜一NC膜上C線標記偶聯好的Biotin，按比例稀釋成 1 · 0mg/mL，按lyL/cm劃在NC膜上，37 °C干燥3-4小時，備用。
[0010] 6)檢測線制備:NC膜上檢測線一T線，標記Rabbit anti-FAM，按lyL/cm劃在NC膜 上，37°C烘干。
[0011] 7)試紙條組裝:取PVC底板作為試紙條的支撐，粘面至上，將上述準備好劃有C線、T 線的NC膜粘在中央位置，然后粘貼膠體金結合墊使其壓在NC膜末端下方2_處，將樣品墊粘 貼在試紙條最下端，最后粘貼吸水紙在PVC底板的最上端，使其尾部壓在NC膜上。
[0012] 本發明提供了結核分枝桿菌PCR-LFB檢測試劑盒，是在對結核分枝桿菌復合群 IS6110基因序列分析的基礎上，選取保守基因序列設計出一對特異性寡核苷酸引物和一對 經特定標記的寡核苷酸探針，利用PCR技術結合側向流生物傳感器對結核分枝桿菌進行檢 測。此技術僅需要常規的PCR儀和一次性側向流生物傳感器便能完成對臨床樣本的檢驗，將 分子診斷技術在專業醫療檢測機構，尤其是基層醫療機構推廣，具有潛在的應用價值。
[0013] 本試劑盒主要包括結核分枝桿菌DNA提取方法、針對結核分枝桿菌的一對特異性 引物、兩條特定標記的核酸探針、陽性對照、陰性對照、PCR Buffer、側向流生物傳感器及其 配套的緩沖液。
[0014] 本發明所涉及檢測基本原理(如圖1所示）：PCR擴增結束后(擴增復合物兩端分別 被Biotion和FAM標記），取10yL PCR擴增物與90yL展開液在酶標板中充分混勻，形成待測 液。將制備好的側向流生物傳感器下部樣品墊浸入酶標板待測液中。擴增復合物中的 Biotin位點與金標墊中鏈霉親和素-納米金復合物結合，形成新的復合物。隨待測液自下而 上層析，當到達T線時被抗-FAM單克隆抗體所捕獲，形成三明治結構。最后，由于反應過程中 納米金顆粒在T線處的富集，產生肉眼可見的紅色條帶;過剩的納米金-鏈霉親和素繼續層 析至C線被Biotin捕獲，形成肉眼可見的紅色條帶，此時檢測結果為陽性。若只有質控線呈 紅色，檢測結果為陰性。若T線和C線均為無色條帶，表明該生物傳感材料已失效。
[0015] 本發明的優點： 檢測時間周期短、檢測效率高;檢測特異性強，準確率高;在進行病原體定性分析是其 檢測靈敏度名顯高于普通PCR檢測方法;操作簡單、易于推廣;實驗結果重復性好。
[0016]
【附圖說明】： 圖1.檢測基本原理示意圖； 圖2. 30nm膠體金的吸收光譜圖； 圖3.側向流生物傳感器的組裝結構圖； 圖4.結核分枝桿菌PCR-LFB法的特異性檢測結果； 圖5.結核分枝桿菌PCR-LFB法的靈敏性檢測結果。
[0017]【具體實施方式】： 實施例1結核分枝桿菌鑒定特異性核酸序列的設計及合成 根據結核分枝桿菌復合群共有的插入序列IS6110基因設計特異性寡核苷酸引物。引物 序列如下： 上游引物:5-CGATCGTGGTCCTGC-3 '， 下游引物：5 ' -AACTACGGTGTTTACGGTGC-3 '。
[0018]用于與IS6110擴增片段雜交的修飾寡核苷酸探針為： PI:5，-GCGGCAAAGC-FAM-3，； P2: 5-Biotin-GAGGGCATCGA-3，。
[0019]以上引物及探針的特異性通過NCBI網站Blast工具軟件進行分析，證明該序列與 核酸數據庫中其它序列不存在交叉反應，初步證明其針對結核分支桿菌具有特異性。寡核 苷酸引物、探針由上海生工生物工程有限公司合成。擴增基因序列如SEP ID NO. 1所示. 實施例2側向流生物傳感器的制備 (l)30nm膠體金制備：在525nm有最大吸收峰（紫外掃描光譜），如圖2所示，0D值為 0.882，氯金酸:檸檬酸三鈉1:1.25。
[0020] (2)膠體金與鏈霉親和素（SA)標記：以標記lmL膠體金為例，加入14yL 0.2M K2C〇3 混勻，使膠體金pH在SA等電點附近；加入lyLSA(lOygAU)，手搖混勻lOmin;加入20yL10% BSA封閉lOmin，再加入20yL10% PEG20000封閉lOmin，4° C，7000rpm，離心 15min，去上清，用 復溶液（10禮？83+0.5%1^丨〇11乂-100+0.3%834，？!17.4)按原體積復溶，金標結合墊切成 0.9cm X 30cm大小，用移液器將復溶后的標記物鋪在金標結合墊上，37° C干燥3-4小時，備 用。每根膜條處理量為1.809mL。
[0021] (3)樣品墊處理:樣品墊切成1.7cmX 30cm大小，用移液器將配制好的樣品墊處理 液鋪在樣品墊上，37 °C烘干，備用。每根膜條處理量為3.417mL。
[0022] (4)活化的Biotin與BSA偶聯：Sulfo-NHS-Biotin與BSA按摩爾比為20:1 于4°C偶 聯過夜。0.2μπι微孔濾膜過濾，隨后劃于硝酸纖維素膜質控線(C線)上。具體操作步驟為:稱 取O.lg BSA溶于 10 mL PBS緩沖液中，調節ΡΗ7.4;加入5mg Sulfo-NHS-Biotin于3.7mL BSA 中，混勻，并于4°C條件下，攪拌偶聯過夜;0 · 22μπι過濾，-20°C保存。
[0023] (5)控制線制備：硝酸纖維素膜(NC膜)上C線標記偶聯好的Biotin，按比例稀釋成 1 · 0mg/mL，按lyL/cm劃在NC膜上，37 °C干燥3-4小時，備用。
[0024] (6)檢測線制備:NC膜上檢測線（T線）標記Rabbit anti_FAM(lmg/mL)按lyL/cm劃 在NC膜上，37 °C烘干，備用。
[0025] (7)試紙條組裝:取PVC底板作為試紙條的支撐，粘面至上，將上述準備好劃有C線、 T線的NC膜粘在中央位置，然后粘貼膠體金結合墊使其壓在NC膜末端下方2mm處，將樣品墊 粘貼在試紙條最下端，最后粘貼吸水紙在PVC底板的最上端，使其尾部壓在NC膜上，組裝完 成，如圖3所示。
[0026]實施例3結核分枝桿菌的檢測方法 (1)患者痰標本的處理及結核分枝桿菌DNA提取:加入2倍痰液體積的4%氫氧化鈉溶液， 振蕩混勻，室溫放置30min，期間振蕩混勻，使其充分液化;6000 X g離心10 min，棄上清;加 1.5 mL 0.01mol/L PBS (pH 7.8)，充分振蕩混勻。6000Xg離心10 min,棄上清。收集沉淀 物，加入 100yL DNA提取液（10 mmol Tris，150mmol NaCL，0.01% Triton Χ-100,0·05% Tween 20，200此/仙蛋白酶K)充分振蕩混勻，60°C水浴15min; 95°C加熱5 min，瞬時離心；加 等體積三氯甲烷，振蕩混勻，12 000Xg離心5 min;取上清5yL，直接用于PCR擴增。
[0027] (2)PCR擴增反應程序： PCR反應體系組成：10XPCR緩沖液，0.2 mM dNTP，0.5 μπιο?各引物及探針，lyL模板 DNA，0.5 U ragDNA聚合酶，DDW補至總體積為25μΙ^ΡΟ?反應條件:95°C預變性30s;95°C變 性5s，59 °C退火延伸15s，共40個循環;隨后，95 °C變性5s，50 °C退火延伸15s，共5個循環，4 °C 保存。
[0028] (3)側向流生物傳感器對PCR擴增物的檢測:PCR擴增結束后，取10yL擴增產物于生 物傳感器的下部樣品墊上，隨后將生物傳感器下部放入90yL的展開液（0.01 M PBS，pH 7.4)中，5min后讀取結果，質控線和檢測線呈紅色，結果為陽性;若僅質控線呈紅色，結果為 陰性，若兩條線都無色則判讀無效。
[0029] 實施例4試劑盒特異性檢測 分別對牛型結核分支桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、酵母菌、單增李斯特 菌的基因組DNA，用上述的PCR-LFB方法進行檢測。結果表明，只有結核分支桿菌基因組DNA 檢測結果呈陽性，而其它非目的菌的檢測結果均呈陰性，說明該方法對結核分枝桿菌的檢 測具有特異性，如圖4所示。
[0030] 實施例5試劑盒靈敏性檢測 提取結核分支桿菌DNA，測定其初始濃度，對其進行梯度稀釋。每個反應中核酸濃度依 次為l〇ng、lng、100pg、10pg、lpg、100fg、10fg、lfg。以上述濃度DNA作為模板分別進行PCR擴 增，并采用瓊脂糖凝膠電泳和PCR-LFB進行對比檢測。結果表明，電泳法的最低檢測限為 lpg，而PCR-LFB最低檢測限為10f g，如圖5所示。
[0031 ]實施例6結核分枝桿菌特異PCR-LFB法的臨床樣本檢測 采用本發明的方法和試劑盒對54份臨床痰液樣本進行檢測，與培養法和涂片法進行比 較。在54份標本中，PCR-LFB檢測陽性率為75.9%，顯著高于涂片法的16.7%和培養法的 24.1 %。在9份培養陽性的標本中，PCR法檢測全部陽性，兩者陽性復合率為100%，如表1所示。
[0032] 實施例7 采用本發明的方法和試劑盒，選用本發明設計的引物與已報道的針對IS6110的基因 (基因序列如SEPIDN0.2所示）的特異引物(上游引物:5'-CGATCGTGGTCCTGC-3'，下游引 物:5 '-AACTACGGTGTTTACGGTGC -3'）進行檢測比較。本發明篩選的引物序列，對結核分枝 桿菌檢出具有較高的敏感性。對54份臨床痰液樣本進行檢測，其檢測陽性率為75.9%，而已 報道引物序列對這54份標本檢測的陽性率僅為61.3%。
【主權項】
1. 結核分枝桿菌特異性寡核苷酸引物和經特定標記的寡核苷酸探針， 它的引物序列： 上游引物:5-CGATCGTGGTCCTGC-3 '， 下游引物：5 ' -AACTACGGTGTTTACGGTGC-3 ' ； 修飾寡核苷酸探針為： PI:5，-GCGGCAAAGC-FAM-3，； P2: 5-Biotin-GAGGGCATCGA-3 '。2. 結核分枝桿菌PCR-LFB檢測試劑盒，它包括：引物、探針和側向流生物傳感器，其特征 在于:所述的引物、探針為權利要求1所述的結核分枝桿菌特異性寡核苷酸引物和經特定標 記的寡核苷酸探針。3. 根據權利要求2所述的結核分枝桿菌PCR-LFB檢測試劑盒，其特征在于:所述的側向 流生物傳感器，是由下述方法制備的： 1 )30nm膠體金制備:在525nm有最大吸收峰（紫外掃描光譜），0D值為0.882，氯金酸:檸 檬酸三鈉1:1.25; 2) 膠體金與鏈霉親和素標記：以標記lmL膠體金為例，加入14yL 0.2M K2CO3混勻，使膠 體金pH在SA等電點附近;加入lyL濃度為lOyg/yl的SA，手搖混勻lOmin;加入20yL10% BSA封 閉 lOmin，再加入20yL10% PEG20000封閉 lOmin，4° C，7000rpm，離心 15min，去上清，用（10mM PBS+0.5% Triton X-100+0.3% BSA，pH 7.4的復溶液按原體積復溶，金標結合墊切成0.9cm X 30cm大小，用移液器將復溶后的標記物鋪在金標結合墊上，37° C干燥3-4小時，備用;每根 膜條處理量為1.809mL; 3) 樣品墊處理:樣品墊切成1.7cmX30cm大小，用移液器將配制好的樣品墊處理液鋪在 樣品墊上，37°C烘干，每根膜條處理量為3.417mL; 4) 活化的Biotin與BSA偶聯：Sulfo-NHS-Biotin與BSA按摩爾比為20:1于4°C偶聯過 夜； 0.2μπι微孔濾膜過濾，隨后劃于硝酸纖維素膜質控線--C線上；具體操作步驟為：稱取 O.lg BSA溶于 10 mL PBS緩沖液中，調節ρΗ7.4;加入5mg Sulfo-NHS-Biotin于3.7mL BSA 中，混勻，并于4°C條件下，攪拌偶聯過夜;0· 22μπι過濾，-20°C保存； 5) 控制線制備:硝酸纖維素膜一NC膜上C線標記偶聯好的Biotin，按比例稀釋成l.Omg/ mL，按lyL/cm劃在NC膜上，37 °C干燥3-4小時，備用； 6) 檢測線制備:NC膜上檢測線一T線，標記Rabbit anti-FAM，按lyL/cm劃在NC膜上，37 °C烘干； 7) 試紙條組裝:取PVC底板作為試紙條的支撐，粘面至上，將上述準備好劃有C線、T線的 NC膜粘在中央位置，然后粘貼膠體金結合墊使其壓在NC膜末端下方2mm處，將樣品墊粘貼在 試紙條最下端，最后粘貼吸水紙在PVC底板的最上端，使其尾部壓在NC膜上。
【文檔編號】C12Q1/68GK105936941SQ201610521609
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2016年7月5日
【發明人】尹銳, 王康宇, 孫亞娟, 王艷芳, 王 義, 張美萍, 孫春玉, 于雙, 賢加歡
【申請人】吉林農業大學