結核桿菌16kD?CFP10?19kD融合蛋白構建及鑒定的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種結核分枝桿菌三聯重組融合蛋白16kD?CFP10?19kD，并將其應用于肺結核的臨床診斷。選用結核分枝桿菌的三個強抗原表位，利用PCR方法，以H37RV為模板構建的一種結核分枝桿菌三聯重組融合蛋白，利用DNA?水凝膠無細胞體外蛋白表達系統表達融合蛋白，利用金屬螯合親和層析技術對得到的重組蛋白進行純化，最后以其為抗原，利用斑點金免疫滲濾技術制備新型結核分枝桿菌血清學檢測試劑盒。與市場上的同類試劑盒相比，具有特異性強、敏感性高等優點，為結核病的篩查和診斷提供更可靠的工具，亦可用于制備蛋白芯片、疫苗、單抗和多抗等。
【專利說明】
結核桿菌16kD-CFP10-19kD融合蛋白構建及鑒定
技術領域
[0001] 本發明設及基因工程領域，具體的設及一種結核分枝桿菌=聯重組融合蛋白的構 建、鑒定、表達純化及其應用。
【背景技術】
[0002] 結核病是由結核分枝桿菌(Mycobacterituberculosis，TB)引起的慢性傳染病， 嚴重危害人類健康。世界上約有1/3人口染上結核，每年新發病例約900多萬，死亡人數達 200萬，由此可見，全球結核病日益盛行，已經成為全球嚴重的公共衛生和社會問題。研究表 明，受結核菌感染的人群中，10 %的人會發展為結核病。如果不采取有效的控制措施，在未 來的10年，我國可能有近5000萬的感染者發生結核病。早期發現并及時治療是預防控制結 核病的重要工作，然而目前結核病的診斷仍然依賴于臨床資料、細菌學檢測和疲涂片鏡檢， 現有的診斷方法雖然是TB診斷的金標準，但是亦存在諸多不足，如涂片法陽性率低，且培養 時間較長，不適用于肺外結核、小兒結合的診斷，遠不能滿足臨床需求。此外，由于肺結核早 期最常見的癥狀是咳嗽和咳疲，容易使患者和醫生誤W為是感冒或氣管炎而導致誤診，從 而延誤最佳治療時機。由此可見，開發新的快速、簡單、方便、敏感性高的結核病診斷工具是 日益增加的活動性肺結核的迫切需要。
[0003] 伴隨TB診斷技術的快速發展，血清學檢測W其簡潔、快速、經濟、準確、特異性強而 備受關注，可用于人群篩選。但由于結核分枝桿菌抗原多且復雜，在宿主體內表達的數量、 種類或時機可能隨患者的個體免疫背景和病程而有區別，從而表現出不同的抗體譜，只用 單一抗原的結核病血清學診斷敏感性不夠。因此，采用多種抗原聯合檢測的手段，在保證特 異性的基礎上有助于改善靈敏度低的缺點。1化D抗原主要存在于結核桿菌的細胞膜上，有 研究表明，可W從85 %的肺結核患者血清中檢測到16kD蛋白；CFP10的編碼基因位于RD1區， 是重要的T細胞抗原，具有良好的免疫原性，能夠誘導機體產生特異性免疫應答，是結核病 診斷和預防的研究熱點；1化D是結核桿菌細胞壁上的一種脂蛋白，其已經被證明是具有免 疫原性的的抗原，可W被TB患者血清中的抗體所識別，一直W來被廣泛研究，Lyashchenko 等的研究表明，19kD作為抗原診斷結核病可W增加檢測的靈敏度。
[0004] 目前國內外關于19kD融合蛋白的報道較少，因此本研究化D、CFP10、19kD在結 核病血清學檢測方面的優勢，利用基因工程技術構建了 16kD-CFP10-19kDS聯融合蛋白，同 時結合斑點金免疫滲濾技術制備了血清學檢測試劑盒，期望能為結核病感染的診斷提供更 為特異、準確的工具。

【發明內容】

[0005] ( - )要解決的技術問題 本發明目的是構建結核分枝桿菌16kD-CFP10-19kDS聯重組融合蛋白，利用斑點金免 疫滲濾技術(DIGFA)生產特異性高、假陽性低的新型結核分枝桿菌血清學檢測試劑盒，為結 核病提供一種可靠、方便、快速的臨床診斷方法。
[0006] (二)技術方案 本發明根據NCBI數據庫檢索得到結核桿菌曲本V標準菌株16kD、CFPl〇W及38kD基因序 列，設計合成引物，經PCR、TA克隆后，酶切純化3段基因片段，與祀T28a載體進行依次重組， 首先構建祀T28a-16kD重組質粒，鑒定成功基礎上繼續酶切與CFP10片段連接，鑒定成功后， 進一步酶切與19kD片段連接，酶切鑒定，最終獲得pET-28a-16kD-CFP10-l化D重組表達載 體，測序鑒定16kD- CFP10-19kD重組融合序列重組成功。
[0007] 本發明應用DNA-水凝膠無細胞體外蛋白表達系統表達重組融合蛋白。首先合成X- DNA，應用心a /酶切對融合蛋白質粒進行線性化，同無核酸酶水、T4 DNA連接酶、T4 DNA連 接酶緩沖液等組成DNA凝膠反應混合液;然后基于磁力攬拌方式制備DNA凝膠微顆粒，并對 其進行純化和鑒定;最后按照RTS 100 試劑盒制備商業化無細胞反應液，確定無細 胞反應的最佳解育時間、X-DNAW及基因模版的最適濃度。最終獲得一種表達結核分枝桿菌 16kD-CFP10-19kDS聯重組融合蛋白的DNA-水凝膠無細胞蛋白表達系統。
[000引本發明應用金屬馨合親和層析介質技術(metal chelate chromatogra地y)純化 上述步驟中得到的重組融合蛋白，對純化后的融合蛋白進行氨基酸序列測定，同時應用BCA 法測定融合蛋白濃度，應用化ISA法測定融合蛋白活性。最終獲得純度大于96 %的結核分枝 桿菌16kD-CFP10-19kDS聯融合蛋白。
[0009] 本發明將上述獲得的高純度重組融合蛋白包被在硝酸纖維素膜上，用膠體金標記 葡萄球菌A蛋白（SPA)，然后組裝滲濾裝置，建立并優化斑點金免疫滲濾檢測體系，最終獲得 基于斑點金免疫滲濾技術的新型結核分枝桿菌血清學診斷試劑盒。臨床血清樣本檢測實驗 表明，該試劑盒的敏感性為95.2 %，假陽性為2.8 %。
[0010] (S)有效效益 采用本發明提供的結核分枝桿菌16kD-CFP10-19kD重組融合蛋白制備的診斷試劑盒， 與市場上的同類試劑盒相比，具有特異性強、靈敏度高等優點，更好的滿足了結核分枝桿菌 感染臨床診斷的需要。
【附圖說明】
[0011] 圖1是表達載體祀T-16kD-CFP10-19kD的構建流程圖。
[001 ^ 圖2是表達載體pET-1化D-CFP10-19kD的酶切電泳圖，A:單基因酶切點電泳圖，1: Marker，2:l化0,3:〔。？10,4:1940;8:融合基因酶切電泳圖，1:]\&1'1?5'，2:酶切前的重組質 粒，3:16kD，4:16kD+CFP 10，5:16kD+CFP 10+19kD。
[0013] 圖3是X-DNA的4條寡核巧酸序列及檢驗電泳圖，1:X1，2:X1巧2,3:X1巧化X3,4:X1+ X化X3巧4。
[0014] 圖4是DNA-水凝膠蛋白表達系統表達蛋白的金屬馨合層析親和純化凝膠電泳圖， 1: Marker，2:純化前，3:純化后。
【具體實施方式】
[00巧]1.1基因融合 通過計算機分析TB H37RV基因組全序列，選擇其強抗原表位16kD(GE肥BANK locus: NP_214765)、CFP10蛋白（GE肥BANK lo州s:NP_218391)和 19kD(GE肥BANK lo州s:CP007027) 的DM序列為模板，設計擴增引物為： 16kD擴增引物： 16-CFP10-19a：GGAAGGCATATGAACAATCTCGCATTGTGGTCGC 16-CFP10-19b：TTATTAGGATCCTCCGCCACCCTTCGTGATGGCGATG CFPIO擴增引物： 16-CFP10-19C：GGCCGCGGATCCATGGCAGAGATGAAGAC 16-CFP10-19d：CGGCGGGAATTCGAAGCCCATTTGCGA 19kD擴增引物： 16-CFP10-19e：AATAGAATTCGGAGGTGGCGGTAGTGTGAAGCGTGGACT GA 16-CFP10-19f：GTCCGGAAGCTTTTAGGAACAGGTCACCTCGATTTCG 50 ml 擴增體系：d 地 2〇 31.5 miaOXbuffer 5.0 ml，4XdNTP 4.0 ml,上、下游引物 混液4.0 ml，DNA 1.5 mljaqplus 0.2 ml(lU)。
[0016] 取結核分支桿菌出7Rv的菌體，加100 ml蛋白酶K(10 mg/ml)，置56 °C水浴消化4 h，用常規酪/氯仿法純化，用上述引物進行PCR擴增。其中，1化D上游引物增加分沁1酶切位 點，下游增加 fe?況酶切位點；CFP10上游引物增加 fem況酶切位點，下游增加&?〇凡酶切位 點；19kD上游引物增加&?〇凡酶切位點，下游增加化'nc/ m酶切位點。
[0017] 將克隆片段進行修飾，產物經瓊脂糖凝膠電泳純化后切割，將含DNA條帶的膠塊按 DNA快速純化試劑盒(購自碧云天公司，產品名稱:PCR/DNA純化試劑盒)說明書進行操作，回 收 DNA。質粒 DNA 和 16kD、CFP10、19kD 片段均經內切酶切，50 ml 體系：10Xbuffer 5.0 ml, DNA 12 ml,化nc/虹和M/e I各15 U，d地2〇補至50 ml;37 °C水浴6 11。50 ml酶切產物經瓊 脂糖凝膠電泳分離，切割DM條帶瓊脂塊，利用DM快速純化試劑盒回收DM。
[0018] 將16kD、CFP10和19kD基因片段依次克隆至祀T28a質粒(具有化'nc/虹和M/e I酶切 位點，購自大連寶生物工程有限公司），即首先構建祀T28a-1化D重組質粒，鑒定成功基礎上 繼續酶切與CFP10片段連接，鑒定成功后，進一步酶切與19kD片段連接，酶切鑒定。20 ml連 接體系：(1地2〇 15.0 miaOXbuffer 2.0 ml,祀 T28a 2.0 ml,基因片段 1.0 ml，T4 DNA 連 接酶20 U。質粒自身連接對照，20 ml連接反應體系：d地2〇 16.0 ml, 10 X buffer 2.0 ml, pET28a 2.0 ml，T4 DNA連接酶20 U。按上述加樣后，混勻、稍離屯、，14 °C-16 °C連接過夜。 轉化E.coli涂平板(含有15微克/毫升卡那霉素的LB固體培養基)并挑克隆提質粒測序，確 定序列正確的克隆。重組質粒的酶切(M/e 1/化'nc/虹）電泳圖如附圖2所示。
[0019] 1.2產物測序 采用T7 promoter:5-'TAATACGACTCACTATAGGG-3'和T7 terminator:5'- GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3 '通用引物。所有擴增引物和測序引物的合成W及重組質粒序列 pET28a-16kD-CFP10-19kD的測定都由生工生物工程有限公司提供服務。測得目的融合基因 的核巧酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0020] 1.3目的蛋白的表達純化 1.3.1 X-DNA的制備 X-DNA由四條末端反向互補的40 bp長的DNA分子經過一個特殊的退火程序形成。用于 合成X-DNA的寡核巧酸序列為： XI:5 '-p-CGACCGATGAATAGCGGTCAGATCCGTACCTACTCGGGCC-3, X2:5'-p-CGAGTAGGTACGGATCTGCGTATTGCGAACGACTCGGGCC-3' X3：5'-p-CGAGTCGTTCGCAATACGGCTGTACGTATGGTCTCGGGCC-3' X4：5'-p-CGAGACCATACGTACAGCACCGCTATTCATCGGTCGGGCC-3' 將根據序列合成的四條寡核巧酸分子等量混合(控制每條寡核巧酸分子的終濃度為 0.2 111]\0后置于口0?儀中。退火體系:95°(：變性2 111111，65°(：保持2 111111，60°(：保持5.5 111111， 之后每隔30 S將溫度調低1 °C，一直連續降至20 °CdX-DNA的核酸電泳圖如附圖3所示。
[0021] 1.3.2 DNA水凝膠微顆粒的制備 使用I酶將驗證正確克隆的重組質粒(pET28a-16kD-CFP10-19kD)進行線性化，W 用于進行X-DNA的連接。
[0022] 將Span 80與Tween 80兩種表面活性劑分別W4.5 %(wt/wt)W及0.5 %(wt/wt)的 比例添加到礦物油中，充分振蕩混勻。冰浴后取出1 ml置于玻璃小杯，加入一顆3 mmX8 mm 規格的磁力攬拌子，并將轉速控制為3000 rpm(最大轉速）。穩定后迅速將冰浴上配制好的 10 iil DNA凝膠反應混合液Wl:100的體積比加入，繼續攬拌1 min,使DNA凝膠反應液（水 相)均勻地分散在礦物油（油相）中，形成油包水乳液。油相中添加的表面活性劑能夠有效地 防止分散在油相中的DNA凝膠反應液的小液滴重新聚合，起到了穩定乳液的作用。將分散均 勻的乳液放置于16 °C解育過夜，分散在油相中的小液滴發生交聯反應，形成均勻的固體凝 膠微顆粒。
[0023] 10 DNA凝膠反應混合液體系:X-DNA stock solution 3.5山，線性質粒模板2 yl,Nuclease-free water 3 yl, 10 XT4 ligase buffer 1 yl ,T4 ligase(5 U/uDO.S y lo
[0024] 1.3.3 DM-水凝膠微顆粒的收集、純化 取分散在油相中合成的DNA-水凝膠樣品，W礦物油萃取殘留的表面活性劑，W正己燒 溶解殘余的礦物油。通風楓干燥15 min后，去離子水清洗，清除殘留的正己燒。
[0025] 1.3.4使用DNA-水凝膠無細胞蛋白表達體系進行融合蛋白表達 使用商業化無細胞反應液試劑盒（購自Roche公司，產品名稱：RTS 100反coJi肌 kit)進行融合蛋白的無細胞表達。將10 iil體積的DNA-水凝膠加入無細胞反應液中，反應體 系在Proteomaster中24 °C、900 rpm振蕩。于無細胞反應的不同時間取合成的蛋白進行檢 測，篩選最佳無細胞反應的最佳解育時間。
[0026] 1.3.5目的蛋白純化 對收集的蛋白用Ni柱(GE公司）進行純化，用如下溶液洗脫:300 mM咪挫，50 mM化is- 肥1，500 ml化CIdI化D、CFP10和19kD融合基因表達蛋白共428個氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
[0027] 1.4融合蛋白鑒定 1.4.1純度測定 經SDS-PAGE電泳檢測（蛋白上樣量為7.2 iig)，為單一區帶，薄層掃描鑒定純度為97.9 %，檢測結果見附圖4。
[002引1.4.2濃度測定 經BCA法測定，W牛血清白蛋白作為標準參比品，融合蛋白濃度為6.28 mg/ml。
[00巧]1.4.3活性測定 W純化的融合蛋白為抗原包被于酶標板上，包被量2 yg/孔，使用確診肺結核患者和健 康者的血清測定492 nm波長處0D值。結果如下：
J ^ ;三口 '1 乂刀'1 乂'11 心 b 丄 BU 嗎 I 以W rj JiniL、?yiL AV、J3Z1 夕QZX-f》如已、t公 / M J i HU '巧/X?_ 1丄口。'|化 AC> 2.1試劑盒組成及制備 本發明試劑盒W純化的結核分枝桿菌16kD-CFP10-19kD重組融合蛋白作為TB抗原，將 其包被到硝酸纖維素膜上，作為檢測點，該抗原可捕獲血清標本中的IgG結核抗體，被捕獲 的結核抗體可W與葡萄球菌A蛋白（SPA)膠體金綴合物相結合呈現紅色斑點。反應孔中間無 紅色斑點，表示血清樣品中結核抗體陰性，質控點應出現紅色。
[0030] 試劑盒主要組成成分為免疫滲濾裝置，主要由塑料小盒、吸水墊料和硝酸纖維素 膜片=部分組成，硝酸纖維素膜上包含檢測區和質控區。
[0031] 2.1.1檢測點包被重組融合蛋白1化D-CFP10-19kD，包被濃度不作稀釋。
[0032] 2.1.2質控點包被羊抗鼠 IgG，包被濃度作1:16稀釋。
[0033] 2.1.3免疫滲濾反應體系優化 (1)反應膜最佳干燥條件的確定 設置相對濕度梯度20 %、30 %、40 %，干燥時間30 min、40 min、50 min、60 min、70 min,干燥溫度為37 °C，采用陽性血清進行檢測，確定最佳干燥濕度及干燥時間。
[00341 親1后欣瞧午極條件說搖違胳結要
-:陰性反應，+:陽性反應，++:較強陽性反應，+++:強陽性反應 由表1可W看出：相對濕度為20 %條件下，短時間干燥會導致試劑的穩定性差，過長時 間干燥又會影響檢測結果的準確性；而在相對濕度為30 %、40 %條件下，干燥時間為40 min、50 min、60 min和70 min時，試劑的敏感性和穩定性都較好，且檢測結果比較接近。考 慮到實驗過程的易操作性，因此選擇將反應膜在相對濕度為30 %-40 %的條件下干燥60 min。
[0035] (2)最佳抗原包被濃度及最適羊抗鼠 IgG工作濃度的確定 將包被抗原稀釋為1:1、1:2、1:4、1:8共四個濃度梯度，將羊抗鼠 IgG稀釋為1:4、1:8、1: 16、1:32四個濃度梯度，將待測陽性參考血清稀釋為1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、1:10共六個濃 度梯度，W包被抗原濃度、羊抗鼠 IgG濃度為變量，配合不稀釋的金標記SPA分別對六個梯度 的待測陽性參考血清開展棋盤滴定實驗，分析實驗結果，確定最適抗原包被濃度及羊抗鼠 IgG濃度。
[0036] 表2最佳抗原包被濃度及羊抗鼠 IgG工作濃度選擇實驗結果 + :陽性，+/-:弱陽性，陰性
由表2確定抗原不作稀釋進行包被，羊抗鼠 IgG作1:16稀釋后作為工作濃度使用。
[0037] (3)最適金標SPA濃度確定 將金標SPA稀釋為1:1、1:2、1:4、1:8、1:10五個濃度梯度，W其為變量，結合已確定的最 適抗原包被濃度和最佳羊抗鼠 IgG工作濃度，分別對六個梯度的待測陽性參考血清開展棋 盤滴定實驗，分析實驗結果，確定最適金標稀釋度。
[0038] 表3最適金標SPA濃度選擇實驗結果
+:陽性，+/-:弱陽性，-:陰性 由表3可W看出：金標SPA不作稀釋為最適工作濃度。
[0039] (4)反應膜最佳封閉方式的選擇 將羊抗鼠 IgG點樣于硝酸纖維素膜中央作為檢測點，分四種不同方式進行封閉后開展 免疫滲濾試驗，觀察不同封閉方式對反應效果的影響。
[0040] ① W含1 % BSA的0.01 M TBST于室溫下置于圓周振蕩搖床上封閉4 h; ② W含5%脫脂奶粉的0.01 M TBST于室溫下置于圓周振蕩搖床上封閉4 h; ③ W含1 % BSA的0.01 M TBST于4 °C條件下過夜封閉； ④ W含5 %脫脂奶粉的0.01 M TBST于4 °C條件下過夜封閉； ⑤ W含 1 % BSA的0.01 M TBST于37 °C下封閉45 min; ⑥ W含5 %脫脂奶粉的0.01 M TBST于37 °C下封閉45 min。
[0041] 根據實驗結果得出：6組檢測點均顯色且能夠與背景有效區分，但相對于其它組 另IJ，④組中不僅背景低，且顯色更加均勻。因此選擇含5 %脫脂奶粉的0.01 M TBST作為封閉 液，封閉條件為4 °C下過夜封閉。
[0042] 2.1.4試劑盒的制造 (1)抗原的包被 取1 的抗原蛋白（不作稀釋）點樣于1X1 cm2大小的硝酸纖維素膜中屯、偏左位置作 為檢測點，取1山的羊抗鼠 IgG(l: 16稀釋)點樣于硝酸纖維素膜中屯、偏右位置作為質控點， 30 %-40 %的條件下干燥60 min。
[0043] (2)封閉 將點樣后的抗原膜浸于含有5 %脫脂奶粉的0.01 M TBST封閉液中，4 °C條件下靜置過 夜封閉。
[0044] (3)洗膜 棄去封閉液，用超純水快速洗膜一次，然后將膜浸于0.01 M TBS溶液中，轉移到圓周搖 床上，120巧m震蕩洗膜5 min,取出后自然驚干。
[0045] (4)組裝滲濾裝置 將吸水材料置于免疫滲濾卡中，最上層覆蓋濾紙，將抗原膜轉移到濾紙上，壓緊滲濾卡 蓋，使滲濾卡孔對準抗原膜中央，完成免疫滲濾裝置的組裝。成品試劑盒包括反應板、封閉 液、洗涂液、金標液、陽性對照和陰性對照。
[0046] 2.1.5操作方法及結果判定 (1)操作方法 ① 向檢測板的反應孔中間加1滴封閉液，待薄膜吸入； ② 取10山血清樣本，加入反應孔中間，待薄膜吸入； ③ 在反應孔中間加6滴洗涂液，待薄膜吸入； ④ 在反應孔中間加1滴金標液，待薄膜吸入； ⑤ 在反應孔中間加6滴洗涂液，待薄膜吸入，目測結果。
[0047] (2)結果判定 陽性-質控點顯示紅色，反應孔中間有紅色斑點出現； 陰性-質控點顯示紅色，反應孔中間無紅色斑點出現或僅痕跡。
[004引2.2試劑盒性能評價 2.2.1血清樣本檢測 應用實驗制備的試劑盒對臨床參比血清樣本進行檢測(60份），根據實驗結果判定此檢 測系統是否可行。檢測結果見表4。 r00491 車/1 GfUArfn謹說女齡；lilll蛙里
-:陰性反應，+:陽性反應，++:較強陽性反應，+++:強陽性反應。
[0050]從實驗統計結果可W看出：陰性和陽性符合率均達100 %，因此我們認為采用運一 檢測系統是可行的。
[0051 ] 2.2.2皿V、肥V等抗體陽性血清交叉反應檢測 采用本發明試劑盒對皿V(乙型肝炎）、HCV(丙型肝炎）患者的血清進行檢測，從而進一 步評價試劑盒的特異性，檢測結果見表5。
[0化2] 表5皿V、HCV等抗陽性血清的巧叉反應檢測結果
從檢測結果可W看出，該試劑盒與上述患者血清均無交叉反應發生。
[0化3] 2.2.3同已經商品化的同類產品進行比較 取經商品化試劑盒檢測的陽性及陰性血清樣本30例，采用本試劑盒進行檢測，統計檢 測結果，計算試劑盒的靈敏度、特異度、假陽性率、假陰性率W及檢測符合率等，實驗結果見 下表6。
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才玄II合的hk標?lU才娃里 從表格可W看出，本發明試劑盒與參比品廣州健侖生物科技有限公司試劑盒的檢測符 合率為96.7 %。 去c_o b肯由片-/f如化右"K日/.V3：；擊文||公故^以古：^;而1：；擊4主田
從表格可W看出，本發明試劑盒與參比品上海奧普生物醫藥有限公司試劑盒的檢測符 合率為97.4 %。
【主權項】
1. 一種編碼結核分枝桿菌三聯重組融合蛋白16kD-CFP10-19kD的融合基因，其特征在 于:它的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。2. -種結核分枝桿菌三聯重組融合蛋白16kD-CFP10-19kD，其特征在于：它是由權利 要求1中的融合基因編碼，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。3. -種結核分枝桿菌三聯重組融合蛋白的表達載體，其特征在于：它是將權利要求1 中的融合基因按照圖1所示的構建方式連接到pET28a載體上，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2 所示。4. 一種DNA-水凝膠無細胞蛋白表達系統，其特征在于：它是以由四條寡核苷酸序列退 火結合而成的X-DNA為骨架的水凝膠結構，其合成后驗證結果如圖3所示。5. -種結核分枝桿菌抗原斑點金免疫快速檢測試劑盒，含有滲濾測定裝置、點樣膜、 標記物和洗脫液，其特征在于:所述的點樣膜是點有結核分枝桿菌抗原（三聯重組融合蛋 白）的硝酸纖維素膜;所述的標記物為膠體金標記葡萄球菌A蛋白結合物;所述的洗脫液為 pH 7.4的0.01 M TBS緩沖液;抗原和標記物之間采用血清中的連接抗體進行搭橋。6. 根據權利要求5所述的結核分枝桿菌抗原斑點金免疫快速檢測試劑盒，其特征在 于:抗原包被濃度不作稀釋，膠體金標記葡萄球菌Α蛋白工作濃度不作稀釋，質控點羊抗鼠 IgG包被濃度作1:16稀釋，反應膜的封閉條件為4 °C過夜封閉，反應膜的干燥條件為在相對 濕度為30 %_40 %的環境中干燥60 min。
【文檔編號】C07K19/00GK106047909SQ201510788381
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2015年11月17日
【發明人】張新慧, 馮書陽, 呂靜
【申請人】沈陽萬類生物科技有限公司