位于重組融合蛋白CE的氨基端，ESAT6 蛋白的抗原表位位于重組融合蛋白CE的羧基端。重組融合蛋白CE的表達量明顯高于重組融 合蛋白EC(即，將重組融合蛋白CE的CFP10蛋白的抗原表位和ESAT6蛋白的抗原表位位置互 換得到的蛋白）。
[0052] 另外，本發明對重組融合蛋白CE特異性地檢測結核分枝桿菌感染上的用途進行了 研究，證明重組融合蛋白CE可以用作特異性檢測結核分枝桿菌感染的皮膚診斷變態反應 原。因此，本發明在結核分枝桿菌感染的檢測及結核病的輔助檢測方面將具有廣闊的應用 前景。
[0053]本發明的有益效果在于：
[0054] 1、本發明證明，PPD可誘導結核分枝桿菌復合群(包括結核分枝桿菌、卡介菌和牛 結核分枝桿菌等)和大多數非結核分枝桿菌致敏的豚鼠產生強的皮膚反應，只有少數非結 核分枝桿菌(包括堪薩斯分枝桿菌、微黃分枝桿菌和草分枝桿菌)致敏的豚鼠產生弱的皮膚 反應。而本發明提供的重組融合蛋白CE作為皮膚變態反應原，用于結核分枝桿菌、牛結核分 枝桿菌致敏的豚鼠，可特異地誘導產生強的遲發型變態反應，而用于卡介菌、大多數環境中 非結核分枝桿菌致敏的豚鼠，不產生或只誘導產生弱的遲發型變態反應。因此，本發明提供 的重組融合蛋白CE對結核分枝桿菌的特異性強于現有商品化的皮膚診斷試劑PPD，可取代 PPD用于鑒別卡介苗接種者以及用作特異地檢測結核菌感染的皮膚診斷變態反應原。本發 明提供的重組融合蛋白CE在制備結核特異性皮膚診斷試劑和制備診斷結核感染的藥物，用 于結核分枝桿菌感染的檢測及結核病的輔助檢測方面將具有廣闊的應用前景。
[0055] 2、本發明提供的重組融合蛋白CE與結核分枝桿菌培養提取蛋白相比，可大規模生 產，并無需生物安全III級的生產車間；而且優化的基因結構使其更適合在大腸桿菌中表 達，獲得較高的表達水平；與天然蛋白具有相同的生物學活性，從而提高了產量，降低了生 產成本，產品價格較低廉。與制備結核分枝桿菌CFP10和ESAT6兩種抗原后再按比例混合免 疫，本發明提供的重組融合蛋白CE成本相對較低，其中CFP10和ESAT6兩種抗原的比例準確。 [0056] 3、人型PPD、卡介菌PPD和非結核分枝桿菌蛋白具有許多同源性，重組38KD蛋白在 結核分枝桿菌、卡介菌和非結核分枝桿菌中均有表達，而CFP10和ESAT6在卡介菌和大多數 非結核分枝桿菌基因組中缺失。本發明的重組融合蛋白CE用作皮膚試驗的變態反應原比人 型PPD、卡介菌PH)和重組38KD蛋白具有更高的特異性，可鑒別結核感染者和卡介苗接種者。 這對于我國計劃免疫中新生兒第一針就接種卡介苗的國家是非常有益的，且本發明提供的 重組融合蛋白CE由兩種結核特異性T細胞抗原CFP10和ESAT6融合而成，含有較多的T細胞抗 原決定簇，能特異地誘導不同結核感染人群產生較強的遲發型變態反應，而使檢測的靈敏 度高于單一抗原組成的產品（如重組ESAT6蛋白和重組38KD蛋白），從而具有高特異性和高 靈敏度。因此，本發明的重組融合蛋白CE作為新的結核特異的皮膚診斷試劑，應用簡便，無 需特殊儀器，適合基層醫療單位對結核高危人群的篩查，以及菌陰肺結核和肺外結核的輔 助診斷及流行病學的調查。
[0057] 下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明做進一步說明，但并不意味著對本發明保 護范圍的限制。
【附圖說明】
[0058] 圖1為C基因第二輪PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0059] 圖2為E基因第二輪PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0060] 圖3為CE基因 PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0061] 圖4為pET-30a( + )載體質粒及含有CE基因的片段的酶切產物及回收產物瓊脂糖凝 膠電泳圖。
[0062]圖5為pET_30a( + )載體質粒及重組質粒的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0063]圖6為重組質粒酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0064]圖7為重組質粒CE/pET_30a測序結果。
[0065] 圖8為CE/pET-30a大腸桿菌工程菌IPTG誘導前后的SDS-PAGE結果。
[0066] 圖9為CE/pET_30a大腸桿菌工程菌表達形式鑒定的SDS-PAGE結果。
[0067]圖10為CE/pET_30a大腸桿菌工程菌發酵誘導時間與表達量關系的SDS-PAGE結果。
[0068] 圖11為重組融合蛋白CE純化過程中DEAE sepharose Fast Flow柱純化洗脫液主 峰的RP-HPLC分析結果。
[0069] 圖12為重組融合蛋白CE純化過程中Aminobutyl Sepharose 6Fast Flow柱純化洗 脫液主峰的RP-HPLC分析結果。
[0070] 圖13為重組融合蛋白CE純化過程中Q Sepharose High Performance柱純化洗脫 液主峰的RP-HPLC分析結果。
【具體實施方式】
[0071 ]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0072]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0073]卡介菌(M. bovis BCG，簡稱BCG)為成都生物制品研究所凍干卡介苗，結核分枝桿 菌 H37Rv(M · tuberculosis )、牛結核分枝桿菌（M.bovis)、猿分枝桿菌(M.simiae，ATCC 25275)、蘇加分枝桿菌（Μ· szulgai，ATCC 35799)、戈登分枝桿菌（Μ· gordonae，ATCC 14470)、胞內分枝桿菌(M. intracellulare，ATCC 13950)、淺黃分枝桿菌(M.gilvum，ATCC 43909)、不產色分枝桿菌(Μ· nonchromogenicum，TMC 1481)、金色分枝桿菌(Μ· aurum，ATCC 23366)、堪薩斯分枝桿菌(M. kansasii，ATCC 12478)、微黃分枝桿菌(M. f lavescens，ATCC 14474)和草分枝桿菌(M. ph 1 ei，ATCC 11758)均為中國藥品生物制品檢定所產品，產品目錄 號分別為 95054、95055、95017、95019、95018、95002、95032、95007、95027、95013、95030和 95024。
[0074]豚鼠（普通級)為北京市海淀區興隆實驗動物養殖廠產品。
[0075]結核菌素純蛋白衍化物(PH)) (50IU/ml)為成都生物制品研究所產品。
[0076]弗氏不完全佐劑為Sigma產品。
[0077] 聚山梨酯80為Amresco產品。
[0078]改良羅氏培養基和蘇通培養基均為中國人民解放軍第三〇九醫院產品。
[0079] 重組CFP10蛋白和重組ESAT6蛋白均為中國人民解放軍第三〇九醫院產品。
[0080] CFP10蛋白和ESAT6蛋白的編碼基因序列見Mycobacterium tuberculosis H37Rv complete genome，GenBank登錄號為AL123456·3。
[0081] 下述實施例中的培養基均用水配制。
[0082] 實施例1、重組融合蛋白CE的編碼基因的克隆及重組融合蛋白CE的表達和純化
[0083] -、兩個蛋白抗原表位融合的設計
[0084] 分析結核分枝桿菌CFP10和ESAT6的基因序列和蛋白質結構，確定兩個蛋白抗原表 位融合的區域、組合和順序，根據大腸桿菌的密碼子使用頻率，選擇其中高頻率的密碼子即 最佳密碼子或偏愛密碼子，去除一些稀有或利用率低的密碼子，通過同義密碼子替換原有 密碼子進行優化，以便所設計的基因在大腸桿菌中高水平地表達，提高蛋白產量，使蛋白生 產更有效和經濟。
[0085] 設計得到SEQ ID No. 1所示的序列。SEQ ID No. 1中第1-6位為限制性核酸內切酶 Nde頂每切識別位點5 '-CATATG-3 '（包括起始密碼子5 '-ATG-3 '），第4-303位為CFP10蛋白抗 原表位的編碼基因（以下簡稱為C基因）序列，第304-327位為連接臂的編碼基因序列5'-GGTGGTGGCGGATCTGGTGGCGGT-3'，第328-612位為優化后的ESAT6蛋白抗原表位的編碼基因 (以下簡稱為E基因）序列，第613-615位為終止密碼子5'-TAA-3'，第617-622位為限制性核 酸內切酶Xho頂每切識別位點5 ' -CTCGAG-3 '。
[0086] 根據SEQ ID No.l得到CFP10和ESAT6蛋白抗原表位依次連接形成的重組融合蛋白 CE，CFP10蛋白的抗原表位位于重組融合蛋白CE的氨基端，ESAT6蛋白的抗原表位位于重組 融合蛋白CE的羧基端。重組融合蛋白CE的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。SEQ ID No.2中 第1-100位為CFP10蛋白抗原表位序列，第101-108位為連接臂，第109-203位為ESAT6蛋白抗 原表位序列。
[0087] 重組融合蛋白CE的編碼基因（以下簡稱為CE基因）序列如SEQ ID No.l中第4-612 位所示。
[0090] 二、通過基因工程技術克隆重組融合蛋白CE的編碼基因
[0091] 1、根據重組融合蛋白CE的編碼基因序列，設計并合成表1所示的引物，用于擴增CE 基因。
[0092]表1用于擴增CE基因的引物
[0093]

[0095] 2、含有C基因的片段KC的全基因合成PCR
[0096] (1)以表1中的(：101卩、(：1011?、(：102卩、(：1021?、(：103卩、(：1031?、(：104卩、(：1041?、(：105卩、 C10BAMH這10條引物互相作為引物和模板，進行第一輪PCR擴增，得到第一輪PCR擴增產物。 [0097] 具體原理如下：
[0102]引物c 1 Ο 5 F和C 1 0 B A Μ Η互相作為引物和模板擴增出片段5 : 5 ' -
[0103]以片段1和片段2為模板，以CIO 1F和C102R為引物，擴增出片段1 + 2:5'-
[0104]以片段1+2和擴增片段3為模板，以C101F和C103R為引物，擴增出片段1+2+3:
[0106]以擴增片段1+2+3和擴增片段4為模板，以C101F和C104R為引物，擴增出片段1+2+3 +4 ：
[0108]以擴增片段1+2+3+4和擴增片段5為模板，以C101F和C10BAMH為引物，擴增出片段1 +2+3+4+5(該片段含有C基因和部分連接臂）：
[0110] 第一輪PCR的反應體系：10XPCR緩沖液5yl、dNTPs 4μ1、引物C101F 5μ1、引物 C101R 0·5μ1、引物C102F 0·5μ1、引物C102R 0·5μ1、引物C103F 0·5μ1、引物C103R 0·5μ1、 引物C104F 0·5μ1、引物C104R 0·5μ1、引物C105F 0·5μ1、引物C10BAMH 5yl、PyrobestTM DNA聚合酶ΙμL、無菌水26μ1，總計50μ1。
[0111] 第一輪PCR的反應條件：95°C預變性5min; 94°C變性30s，50°C退火30s，72°C延伸 2min，30 個循環；72°C 延伸 lOmin; 16°C 降溫 2min。
[0112] (2)以ΙμL第一輪PCR擴增產物作為模板，用表1中的C10FF和C10BAMRR為引物，進行 第二輪PCR擴增，得到第二輪PCR擴增產物(即，含有C基因的片段KC)，序列如下：
[0114] 第二輪PCR的反應體系:第一輪PCR擴增產物ΙμL、10 XPCR緩沖液5μ1、dNTPs4yl、弓丨 物C10FF 5μ1、引物C10BAMRR 5yl、DNA聚合酶ΙμL、無菌水29μ1，總計50μ1。
[0115] (3)電泳回收目的片段
[0116] 將步驟(2)得到的第二輪PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖1所示。
[0117] 圖1中，1: DNA分子量標準（由上至下條帶大小依次為500bp、400bp、300bp、200bp、 150bp、100bp、50bp); 2:步驟(2)得到的第二輪PCR擴增產物;箭頭所指為含有C基因的片段 KC〇
[0118] 在長波紫外線照射下，用干凈的手術刀片在膠上切下要回收的含有C基因的片段 KC的瓊脂塊，放入無菌的離心管中。參照瓊脂糖DNA回收試劑盒中的說明書回收該片段并進 行測序，測序結果正確，定量后，將其貯存于_20°C備用。
[0119] 3、含有E基因的片段KE的全基因合成PCR
[0120] (1)以表1中的E6BGLF、E61F、E61R、E62F、E62R、E63F、E63R、E64F、E64R、E65F、E65R 這11條引物互相作為引物和模板，進行第一輪PCR擴增，得到第一輪PCR擴增產物。
[0121] 具體原理如下：
[0122] 引物E61F