本發明(ming)屬于(yu)生(sheng)物醫學檢(jian)驗領域，具(ju)體涉(she)及一種用于(yu)檢(jian)測潛在結核(he)的特異(yi)性標志物及其(qi)應用。

背景技術：

結(jie)(jie)(jie)(jie)核(he)(he)(he)(he)(he)是一種由人(ren)(ren)結(jie)(jie)(jie)(jie)核(he)(he)(he)(he)(he)分枝桿(gan)菌(jun)引起的(de)(de)(de)疾(ji)病(bing)(bing)(bing)(bing)。根據WHO最新數(shu)據顯示，全(quan)球(qiu)約(yue)有30％的(de)(de)(de)人(ren)(ren)口感(gan)染(ran)(ran)結(jie)(jie)(jie)(jie)核(he)(he)(he)(he)(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)菌(jun)，現有結(jie)(jie)(jie)(jie)核(he)(he)(he)(he)(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)人(ren)(ren)約(yue)2000萬，每年新增800-1000萬人(ren)(ren)，每年約(yue)有200萬人(ren)(ren)死于結(jie)(jie)(jie)(jie)核(he)(he)(he)(he)(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)，是其(qi)它(ta)(ta)所有傳染(ran)(ran)病(bing)(bing)(bing)(bing)總和(he)(he)。我(wo)國(guo)結(jie)(jie)(jie)(jie)核(he)(he)(he)(he)(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)情尤為嚴(yan)重，現有結(jie)(jie)(jie)(jie)核(he)(he)(he)(he)(he)感(gan)染(ran)(ran)者5億，占(zhan)全(quan)球(qiu)的(de)(de)(de)20％，每年約(yue)13萬人(ren)(ren)死于結(jie)(jie)(jie)(jie)核(he)(he)(he)(he)(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)，是其(qi)它(ta)(ta)所有傳染(ran)(ran)病(bing)(bing)(bing)(bing)總和(he)(he)的(de)(de)(de)2倍。如不及(ji)時采取措施，未來十年可能有3000萬人(ren)(ren)患病(bing)(bing)(bing)(bing)，將(jiang)會(hui)導致嚴(yan)重的(de)(de)(de)公共衛生和(he)(he)社會(hui)問題(ti)。目前結(jie)(jie)(jie)(jie)核(he)(he)(he)(he)(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)控制的(de)(de)(de)存(cun)在(zai)的(de)(de)(de)主要問題(ti)是病(bing)(bing)(bing)(bing)人(ren)(ren)發(fa)現率低，治(zhi)愈率低。在(zai)診斷方面，現有的(de)(de)(de)檢測方法不能很好的(de)(de)(de)區分潛在(zai)結(jie)(jie)(jie)(jie)核(he)(he)(he)(he)(he)和(he)(he)活動(dong)性結(jie)(jie)(jie)(jie)核(he)(he)(he)(he)(he)，目前還沒(mei)有一種潛在(zai)結(jie)(jie)(jie)(jie)核(he)(he)(he)(he)(he)診斷的(de)(de)(de)金標準(zhun)。

結(jie)(jie)(jie)(jie)(jie)核(he)(he)(he)菌素皮(pi)試(shi)(tuberculin skin test,TST)是一(yi)種(zhong)廣泛使用(yong)的結(jie)(jie)(jie)(jie)(jie)核(he)(he)(he)檢(jian)(jian)測(ce)方法(fa)，已經(jing)有(you)100多(duo)年的歷(li)史，由于(yu)其操作簡單(dan)、檢(jian)(jian)測(ce)成本低，在全(quan)(quan)世(shi)界(jie)得到(dao)廣泛使用(yong)。但是這(zhe)種(zhong)方法(fa)會把接種(zhong)過(guo)卡介苗的非(fei)結(jie)(jie)(jie)(jie)(jie)核(he)(he)(he)患者(zhe)診斷為結(jie)(jie)(jie)(jie)(jie)核(he)(he)(he)陽性(xing)(xing)，其結(jie)(jie)(jie)(jie)(jie)核(he)(he)(he)檢(jian)(jian)測(ce)錯誤率(lv)較高。γ-干擾素釋(shi)放試(shi)驗(yan)(yan)(interferon-γrelease assays，IGRAs)能夠(gou)很(hen)好的克服這(zhe)一(yi)缺點，對結(jie)(jie)(jie)(jie)(jie)核(he)(he)(he)病檢(jian)(jian)測(ce)的靈(ling)敏(min)度和(he)特(te)異(yi)(yi)性(xing)(xing)都很(hen)高。這(zhe)種(zhong)方法(fa)利用(yong)ELISA檢(jian)(jian)測(ce)全(quan)(quan)血中IFN-γ釋(shi)放量(liang)或(huo)ELISPOT檢(jian)(jian)測(ce)外周血單(dan)核(he)(he)(he)細(xi)胞中釋(shi)放IFN-γ的T淋巴細(xi)胞數量(liang)進行檢(jian)(jian)測(ce)。IFN-γ釋(shi)放實驗(yan)(yan)采用(yong)RD-1區(qu)的特(te)異(yi)(yi)性(xing)(xing)抗原ESAT-6，CFP-10和(he)TB7.7(RD-11)，這(zhe)些(xie)區(qu)域特(te)異(yi)(yi)性(xing)(xing)的存在于(yu)人結(jie)(jie)(jie)(jie)(jie)核(he)(he)(he)桿菌，而卡介苗菌株(zhu)BCG和(he)大多(duo)數環境結(jie)(jie)(jie)(jie)(jie)核(he)(he)(he)桿菌沒有(you)這(zhe)些(xie)區(qu)域。

不管是結(jie)(jie)核(he)(he)(he)菌素皮試還是人(ren)干擾素-γ釋放實驗都不能很好的(de)(de)檢出潛在結(jie)(jie)核(he)(he)(he)患者(zhe)，關鍵在于沒有特異(yi)性和(he)靈敏度高(gao)的(de)(de)潛在結(jie)(jie)核(he)(he)(he)抗原。因此，加大(da)結(jie)(jie)核(he)(he)(he)病(bing)菌的(de)(de)基(ji)礎研究，尋找快速，準確，實用的(de)(de)潛在結(jie)(jie)核(he)(he)(he)檢測方法，提高(gao)潛在結(jie)(jie)核(he)(he)(he)病(bing)人(ren)的(de)(de)檢出率，是目前(qian)結(jie)(jie)核(he)(he)(he)病(bing)診斷需要迫(po)切解決的(de)(de)問(wen)題。

技術實現要素：

為了彌補上述(shu)現有技術(shu)的不足，本發明提出一種用于檢測潛在結核的特異性標志(zhi)物(wu)及其(qi)應用。

本發(fa)明(ming)的技(ji)(ji)術問題(ti)通過以下(xia)的技(ji)(ji)術方(fang)案(an)予以解決：

一種用于(yu)檢測潛在結核的(de)特(te)異性標志物(wu)，其為抗(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)Rv2626c、抗(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)Rv3716c、抗(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)TrxC、抗(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)Rv2626c和(he)抗(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)Rv3716c的(de)組(zu)合(he)、抗(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)Rv2626c和(he)抗(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)TrxC的(de)組(zu)合(he)、或抗(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)Rv3716c和(he)抗(kang)(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)TrxC的(de)組(zu)合(he)。

優(you)選地，所述抗原Rv2626c是如序(xu)(xu)列(lie)表(biao)中(zhong)sequence ID No.1所示的(de)氨(an)基(ji)酸序(xu)(xu)列(lie)組成的(de)蛋白質，或是將序(xu)(xu)列(lie)表(biao)中(zhong)的(de)sequence ID No.1的(de)氨(an)基(ji)酸殘基(ji)經過一個(ge)或多(duo)個(ge)氨(an)基(ji)酸殘基(ji)的(de)取(qu)代和/或缺(que)失和/或添加且與sequence ID No.1所示具(ju)有相(xiang)同功能的(de)衍生的(de)蛋白質。

優選地(di)，所述抗原(yuan)Rv3716c是如(ru)序列(lie)(lie)表中sequence ID No.2所示的(de)(de)氨基(ji)(ji)酸序列(lie)(lie)組成的(de)(de)蛋白(bai)質，或是將序列(lie)(lie)表中的(de)(de)sequence ID No.2的(de)(de)氨基(ji)(ji)酸殘(can)基(ji)(ji)經過(guo)一個(ge)或多個(ge)氨基(ji)(ji)酸殘(can)基(ji)(ji)的(de)(de)取代和/或缺失和/或添加且(qie)與sequence ID No.2所示具有相同功能的(de)(de)衍生的(de)(de)蛋白(bai)質。

優選地，所(suo)述抗原TrxC是(shi)如(ru)序列表(biao)中(zhong)sequence ID No.3所(suo)示的(de)(de)(de)氨(an)基酸(suan)序列組成(cheng)的(de)(de)(de)蛋(dan)白(bai)質，或是(shi)將序列表(biao)中(zhong)的(de)(de)(de)sequence ID No.3的(de)(de)(de)氨(an)基酸(suan)殘(can)基經(jing)過一個或多個氨(an)基酸(suan)殘(can)基的(de)(de)(de)取代和/或缺失和/或添加且與(yu)sequence ID No.3所(suo)示具有相同功(gong)能的(de)(de)(de)衍生的(de)(de)(de)蛋(dan)白(bai)質。

一種(zhong)所(suo)述的特異(yi)性標志物在(zai)制(zhi)備具有鑒別、診斷、輔助(zhu)診斷、篩查(cha)和/或輔助(zhu)篩查(cha)潛(qian)在(zai)結核用途的產品(pin)中的應用。

優選地，所述(shu)具有鑒別、診斷(duan)、輔助(zhu)診斷(duan)、篩查和/或輔助(zhu)篩查潛(qian)在(zai)結核用途的(de)(de)產品中包括如下內容(rong)的(de)(de)說(shuo)明(ming)書：人的(de)(de)外周全血樣本(ben)經過(guo)所述(shu)特異性(xing)標志(zhi)物刺激(ji)后，以釋放出的(de)(de)IFN-γ或者IFN-γ與TNF-α的(de)(de)比(bi)值作(zuo)為潛(qian)在(zai)結核診斷(duan)因子。

優(you)選地，所(suo)(suo)述(shu)(shu)具有鑒別(bie)、診斷、輔助診斷、篩查和(he)/或輔助篩查潛在(zai)結(jie)核用(yong)途(tu)的產品中包(bao)括如下內(nei)容(rong)的說明書：當(dang)所(suo)(suo)述(shu)(shu)特(te)異性(xing)標(biao)志(zhi)物(wu)是Rv2626c、抗(kang)原(yuan)(yuan)Rv2626c和(he)抗(kang)原(yuan)(yuan)Rv3716c的組(zu)合、或抗(kang)原(yuan)(yuan)Rv2626c和(he)抗(kang)原(yuan)(yuan)TrxC的組(zu)合時，人的外周(zhou)全血樣本經(jing)過所(suo)(suo)述(shu)(shu)特(te)異性(xing)標(biao)志(zhi)物(wu)刺(ci)(ci)激(ji)后，以釋放出的IFN-γ作為(wei)(wei)潛在(zai)結(jie)核診斷因(yin)子；當(dang)所(suo)(suo)述(shu)(shu)特(te)異性(xing)標(biao)志(zhi)物(wu)是抗(kang)原(yuan)(yuan)Rv3716c、抗(kang)原(yuan)(yuan)TrxC、或抗(kang)原(yuan)(yuan)Rv3716c和(he)抗(kang)原(yuan)(yuan)TrxC的組(zu)合時，人的外周(zhou)全血樣本經(jing)過所(suo)(suo)述(shu)(shu)特(te)異性(xing)標(biao)志(zhi)物(wu)刺(ci)(ci)激(ji)后，以釋放出的IFN-γ與TNF-α的比值作為(wei)(wei)潛在(zai)結(jie)核診斷因(yin)子。

一(yi)種用于鑒(jian)別、診(zhen)斷(duan)、輔助診(zhen)斷(duan)、篩(shai)查和(he)/或(huo)輔助篩(shai)查潛(qian)在結核的試劑盒，包含所述(shu)的特異(yi)性標志(zhi)物(wu)。

優選地，所述試劑(ji)盒中還包括配(pei)合所述特異性標志物一起(qi)使用的試劑(ji)。

一種所述的試劑盒在制備具有(you)鑒別、診斷、輔助(zhu)診斷、篩查(cha)(cha)和(he)/或輔助(zhu)篩查(cha)(cha)潛在結(jie)核(he)用途的產品(pin)中的應用。

本發(fa)明與現(xian)有技術對比(bi)的有益效果包括：本發(fa)明經過大量研究，篩選出了(le)Rv2626c、Rv3716c、TrxC抗原(yuan)或(huo)其(qi)兩兩組合(he)作為潛(qian)在(zai)(zai)(zai)結(jie)核(he)(he)檢測的特異性標(biao)志物，能夠判斷(duan)受試(shi)者(zhe)是否(fou)為潛(qian)在(zai)(zai)(zai)結(jie)核(he)(he)患者(zhe)，并可(ke)以將(jiang)潛(qian)在(zai)(zai)(zai)結(jie)核(he)(he)患者(zhe)與結(jie)核(he)(he)病(bing)人區分開，其(qi)在(zai)(zai)(zai)潛(qian)在(zai)(zai)(zai)結(jie)核(he)(he)診(zhen)斷(duan)試(shi)劑(ji)盒，在(zai)(zai)(zai)潛(qian)在(zai)(zai)(zai)結(jie)核(he)(he)鑒別、診(zhen)斷(duan)、輔助(zhu)診(zhen)斷(duan)、篩查(cha)和(he)/或(huo)輔助(zhu)篩查(cha)中具(ju)有較大的應用(yong)價值。

附圖說明

圖1為本發明實施例1中所制(zhi)備的Rv2626c蛋白(bai)表達(da)(da)SDS-PAGE電泳圖。泳道(dao)1為PET-32a空載體轉(zhuan)染大(da)腸(chang)桿菌誘導表達(da)(da)后菌液上清；泳道(dao)2為PET-32a-Rv2626c轉(zhuan)染大(da)腸(chang)桿菌誘導表達(da)(da)后菌液上清；泳道(dao)3為蛋白(bai)分子標記；

圖2為本(ben)發明(ming)實施例1中所制備的Rv3716c蛋白表達SDS-PAGE電泳圖。泳道1為PET-32a空載體轉(zhuan)染大(da)腸桿(gan)菌(jun)(jun)誘(you)導表達后菌(jun)(jun)液上清；泳道2為PET-32a-Rv3716c轉(zhuan)染大(da)腸桿(gan)菌(jun)(jun)誘(you)導表達后菌(jun)(jun)液上清；泳道3為蛋白分(fen)子標記(ji)；

圖(tu)3為(wei)本發明(ming)實施例1中(zhong)所制備的(de)TrxC蛋(dan)白表(biao)達(da)SDS-PAGE電(dian)泳(yong)圖(tu)。泳(yong)道(dao)(dao)1為(wei)PET-32a-TrxC轉(zhuan)(zhuan)染大(da)腸桿菌誘導(dao)(dao)表(biao)達(da)后(hou)菌液上清；泳(yong)道(dao)(dao)2為(wei)PET-32a空(kong)載體轉(zhuan)(zhuan)染大(da)腸桿菌誘導(dao)(dao)表(biao)達(da)后(hou)菌液上清；泳(yong)道(dao)(dao)3為(wei)蛋(dan)白分子標記；

圖4為(wei)本發明實施例1中的(de)IFN-γ對3個(ge)潛在(zai)結核特異(yi)性(xing)抗原的(de)反(fan)應(ying)；

圖(tu)5為本發明實(shi)施(shi)例1中的(de)(de)TNF-α對3個潛在(zai)結(jie)核(he)特(te)異(yi)性抗原的(de)(de)反應(ying)。

具體實施方式

下面(mian)結合附圖(tu)通(tong)過具體(ti)實施例對本發明(ming)(ming)進行詳細的介紹，以使更好(hao)的理解本發明(ming)(ming)，但下述(shu)實施例并不限制本發明(ming)(ming)范圍。

本(ben)發明提供一種用于檢測潛在結核的特異性標志(zhi)物，在具體的實施方式中，其為(wei)抗(kang)(kang)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)Rv2626c、抗(kang)(kang)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)Rv3716c、抗(kang)(kang)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)TrxC、抗(kang)(kang)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)Rv2626c和(he)抗(kang)(kang)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)Rv3716c的組(zu)(zu)合(he)(he)、抗(kang)(kang)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)Rv2626c和(he)抗(kang)(kang)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)TrxC的組(zu)(zu)合(he)(he)、或抗(kang)(kang)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)Rv3716c和(he)抗(kang)(kang)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)TrxC的組(zu)(zu)合(he)(he)。

本發明(ming)所稱的(de)“潛在結核”為(wei)感染了結核桿菌，即(ji)體(ti)內攜(xie)帶(dai)有結核桿菌，但體(ti)內的(de)結核桿菌處于休眠期，還(huan)沒(mei)有爆發出來(lai)引起人體(ti)一些臨床(chuang)上(shang)可(ke)見(jian)的(de)結核癥狀(zhuang)。

以(yi)下通過一個優選的實(shi)施(shi)例對本發明作詳(xiang)細闡述(shu)，下述(shu)實(shi)施(shi)例中(zhong)：所(suo)使用的實(shi)驗方(fang)法(fa)、檢測方(fang)法(fa)或分析(xi)方(fang)法(fa)等如無特(te)(te)別說明，均為常(chang)規方(fang)法(fa)；所(suo)用的材料、試(shi)劑等如無特(te)(te)別說明，均可以(yi)從市購獲(huo)得，所(suo)述(shu)的“常(chang)溫”是指(zhi)25-37℃；抗原Rv2626c、抗原Rv3716c或抗原TrxC在下文(wen)中(zhong)也稱“潛在結核特(te)(te)異(yi)性抗原”。

在一(yi)些優選(xuan)的實施例中，可以(yi)優選(xuan)以(yi)下方案中的至少一(yi)個：

所(suo)述抗原Rv2626c是如序(xu)列表中(zhong)sequence ID No.1所(suo)示的(de)氨(an)基酸(suan)(suan)序(xu)列組成(cheng)的(de)蛋(dan)白質，或(huo)(huo)是將序(xu)列表中(zhong)的(de)sequence ID No.1的(de)氨(an)基酸(suan)(suan)殘基經(jing)過一個或(huo)(huo)多個氨(an)基酸(suan)(suan)殘基的(de)取代(dai)和/或(huo)(huo)缺失和/或(huo)(huo)添加且與sequence ID No.1所(suo)示具有(you)相同功能的(de)衍生的(de)蛋(dan)白質。

所(suo)述抗原Rv3716c是(shi)(shi)如序列(lie)表中(zhong)sequence ID No.2所(suo)示(shi)的(de)氨基酸序列(lie)組成的(de)蛋白質，或(huo)是(shi)(shi)將序列(lie)表中(zhong)的(de)sequence ID No.2的(de)氨基酸殘基經(jing)過一個或(huo)多個氨基酸殘基的(de)取代和/或(huo)缺失和/或(huo)添加且與sequence ID No.2所(suo)示(shi)具有相(xiang)同功(gong)能的(de)衍(yan)生(sheng)的(de)蛋白質。

所述抗原(yuan)TrxC是如(ru)序列表(biao)中(zhong)sequence ID No.3所示的(de)氨基(ji)(ji)(ji)酸(suan)序列組成(cheng)的(de)蛋白質，或是將序列表(biao)中(zhong)的(de)sequence ID No.3的(de)氨基(ji)(ji)(ji)酸(suan)殘基(ji)(ji)(ji)經過(guo)一個(ge)或多個(ge)氨基(ji)(ji)(ji)酸(suan)殘基(ji)(ji)(ji)的(de)取(qu)代和(he)/或缺失(shi)和(he)/或添加(jia)且(qie)與sequence ID No.3所示具(ju)有相(xiang)同功(gong)能的(de)衍生的(de)蛋白質。

本(ben)發明還提供一種(zhong)所述的特(te)異性標志物(wu)在制(zhi)備具有鑒別、診(zhen)(zhen)斷(duan)、輔助診(zhen)(zhen)斷(duan)、篩查(cha)和/或輔助篩查(cha)潛(qian)在結核(he)用途的產品中(zhong)的應用。

在一些優選的(de)實施例(li)中，所(suo)述具有鑒(jian)別(bie)、診斷、輔(fu)助(zhu)診斷、篩查和/或輔(fu)助(zhu)篩查潛在結核用途的(de)產品中包括如下內容的(de)說明書：人的(de)外周全血樣本經過所(suo)述特異性標志(zhi)物刺激后，以(yi)釋(shi)放出的(de)IFN-γ或者IFN-γ與(yu)TNF-α的(de)比值作為(wei)潛在結核診斷因子。

在(zai)另一(yi)些(xie)優選的(de)(de)(de)(de)實施例(li)中，所(suo)(suo)(suo)述(shu)具(ju)有鑒(jian)別、診(zhen)斷、輔(fu)助診(zhen)斷、篩查和/或(huo)輔(fu)助篩查潛在(zai)結(jie)核(he)用途(tu)的(de)(de)(de)(de)產品中包括如下內(nei)容(rong)的(de)(de)(de)(de)說明書：當(dang)所(suo)(suo)(suo)述(shu)特異(yi)性標(biao)志(zhi)物是(shi)Rv2626c、抗(kang)(kang)原Rv2626c和抗(kang)(kang)原Rv3716c的(de)(de)(de)(de)組合、或(huo)抗(kang)(kang)原Rv2626c和抗(kang)(kang)原TrxC的(de)(de)(de)(de)組合時，人的(de)(de)(de)(de)外(wai)(wai)周全血樣本經過所(suo)(suo)(suo)述(shu)特異(yi)性標(biao)志(zhi)物刺(ci)激(ji)后，以(yi)(yi)釋(shi)放出的(de)(de)(de)(de)IFN-γ作為潛在(zai)結(jie)核(he)診(zhen)斷因子(zi)；當(dang)所(suo)(suo)(suo)述(shu)特異(yi)性標(biao)志(zhi)物是(shi)抗(kang)(kang)原Rv3716c、抗(kang)(kang)原TrxC、或(huo)抗(kang)(kang)原Rv3716c和抗(kang)(kang)原TrxC的(de)(de)(de)(de)組合時，人的(de)(de)(de)(de)外(wai)(wai)周全血樣本經過所(suo)(suo)(suo)述(shu)特異(yi)性標(biao)志(zhi)物刺(ci)激(ji)后，以(yi)(yi)釋(shi)放出的(de)(de)(de)(de)IFN-γ與(yu)TNF-α的(de)(de)(de)(de)比值(zhi)作為潛在(zai)結(jie)核(he)診(zhen)斷因子(zi)。

本發明還提(ti)供一種用(yong)于鑒(jian)別、診(zhen)斷、輔助診(zhen)斷、篩查和/或輔助篩查潛在結核的(de)試(shi)劑(ji)盒，包(bao)含所述的(de)特異性(xing)標志物。

在一些優選的實施例(li)中，所述(shu)試(shi)劑盒中還包括配合所述(shu)特異性標志物一起使用的試(shi)劑。

本發明(ming)還(huan)提供一(yi)種所(suo)述(shu)的試(shi)劑(ji)盒在制備具有鑒別(bie)、診斷(duan)、輔助診斷(duan)、篩查和/或(huo)輔助篩查潛在結(jie)核用(yong)途的產(chan)品中的應用(yong)。

以下通過更(geng)具體的實(shi)施(shi)例對(dui)本(ben)發明進行詳(xiang)細(xi)闡述。

實施例1

1.分(fen)子(zi)克(ke)隆潛在結核特異性(xing)抗原(yuan)

1.1提取結(jie)核(he)分枝桿菌H37Rv菌株(北京株)總RNA

1)用接種環取結核分枝桿菌H37Rv菌株(北京株)于7H11固體培養基中，37℃培養5-6周，用接種環挑取單個菌落于體積比為0.1％的7H9吐溫液體培養基中，2周后轉種，待OD₆₀值(zhi)達到0.5-0.8時備(bei)用。

2)離心去除培養基上清，用PBS洗一遍，制備成1×10⁹CFU/份(fen)，加入(ru)新配置的甲醇氯(lv)(lv)仿(fang)混懸液(甲醇和氯(lv)(lv)仿(fang)的體積比為1:3)1ml，渦旋震蕩1分(fen)鐘，立刻加入(ru)Trizol5ml，渦旋震蕩15秒(miao)。

3)于冰(bing)上靜(jing)置10分鐘，12000g離心(xin)10分鐘，取(qu)上層水相，加入(ru)等體(ti)積的異丙醇混勻，-20℃靜(jing)止2小時。

4)10000g離(li)心10分(fen)鐘后(hou)棄上清，用(yong)70％乙(yi)醇洗兩(liang)次，自然干燥后(hou)加入DEPC水溶解，得到H37Rv菌(jun)株總(zong)RNA。

1.2 RT-PCR獲取目的基因片段

1.2.1引物設計

根(gen)據H37Rv菌株基因(yin)組DNA序列(NCBI Reference SEQ:NC_000962.3)設(she)計引物(wu)，分別進行RT-PCR獲(huo)得Rv2626c，Rv3716c和TrxC的全長CDS序列，擴增引物(wu)如下：

Rv2626c上游(you)引物(wu)P1(如(ru)sequence ID No.4所示)：ATGACCACCGCACGCG

Rv2626c下游引物P2(如sequence ID No.5所示)：CTAGCTGGCGAGGGCCAT

Rv3716c上(shang)游引物(wu)P3(如(ru)sequence ID No.6所示)：ATGCAACCCGGAGGCGAC

Rv3716c下游引物(wu)P4(如sequence ID No.7所(suo)示)：TCAGATCCCTGGTACAGGT

TrxC上游(you)引物P5(如sequence ID No.8所(suo)示)：ATGACCGATTCCGAGAAG

TrxC上游引物P6(如sequence ID No.9所示)：CTAGTTGAGGTTGGGAAC

再次設計(ji)引物分別加入酶(mei)切(qie)位點BamHI和EcoRI，酶(mei)切(qie)后連接(jie)在載體PET-32a中，構建成表達載體PET-32a-Rv2626c，PET-32a-Rv3716c和PET-32a-TrxC。

帶酶切位點的引(yin)物如下(xia)：

Rv2626c上游引物(wu)P7(如sequence ID No.10所(suo)示)：

CGGATCCATGACCACCGCACGCG

Rv2626c下(xia)游(you)引物P8(如sequence ID No.11所示)：

GGAATTCCTAGCTGGCGAGGGCCAT

Rv3716c上游引物P9(如sequence ID No.12所示)：

CGGATCCATGCAACCCGGAGGCGAC

Rv3716c下游引物P10(如(ru)sequence ID No.13所示)：

GGAATTCTCAGATCCCTGGTACAGGT

TrxC上游引物(wu)P11(如sequence ID No.14所示)：

CGGATCCATGACCGATTCCGAGAAG

TrxC上游引物P12(如sequence ID No.15所(suo)示)：

GGAATTCCTAGTTGAGGTTGGGAAC

1.2.2逆轉錄(lu)反應(ying)

在(zai)0.2ml EP管中(zhong)，取如上(shang)1.1中(zhong)提取的H37Rv菌株總RNA 1μg，按如下(xia)比例建立逆轉錄反應體(ti)系：

于PCR儀上(shang)50℃反(fan)應30min，然后94℃下2min滅活逆(ni)轉錄酶，合(he)成cDNA于1.2.3中的(de)PCR反(fan)應。

1.2.3 Rv2626c，Rv3716c和TrxC的基(ji)因片段擴增(zeng)

在0.2ml EP管中，取如上1.2.2中H37Rv菌株的(de)cDNA，按如下比例(li)建立基因片段擴增反應體系：

于(yu)PCR儀上94℃5min，然后30個PCR循(xun)環(huan)，每(mei)個循(xun)環(huan)94℃45s，60℃45s，72℃1min，最(zui)后延伸72℃5min。

1.3表達載體構建

將PCR擴增的(de)Rv2626c，Rv3716c和TrxC的(de)基(ji)因片(pian)(pian)段(duan)進行1％瓊脂糖(tang)電泳，在紫外燈下(xia)用(yong)手術刀片(pian)(pian)切下(xia)相應大小的(de)DNA片(pian)(pian)段(duan)，稱重后移入(ru)EP管。根據(ju)DNA片(pian)(pian)段(duan)純化試(shi)劑盒說明書進行回(hui)收(shou)。

1.3.1將(jiang)純化的PCR片(pian)段連接(jie)到PMD-18T載體上

反應體系如下：

1.3.2重組質粒的轉化

1)取一管DH5α感受態細胞于(yu)冰上(shang)融化后加入上(shang)述(shu)連接(jie)產物，輕(qing)輕(qing)混勻。

2)冰上靜置20min。

3)將EP管在42℃下熱激60s。

4)快速取出EP管(guan)在冰(bing)上放(fang)置1-2min。

5)加(jia)入800μL不含抗性(xing)的LB液體培(pei)養基，轉移(yi)至搖(yao)床，37℃搖(yao)震(zhen)蕩培(pei)養1h。

6)取(qu)出EP管(guan)，在常(chang)溫下4000rpm，離心1min，吸取(qu)700μL上清，剩余200μL輕輕吹(chui)打重懸細胞。

7)將重懸細胞均勻涂布于(yu)含有(you)氨(an)芐抗性(100mg/ml)的LB固體培(pei)養(yang)基中，37℃下培(pei)養(yang)12-16h。

1.3.3提(ti)取質粒并測(ce)序

從(cong)含有氨(an)芐抗性(xing)(100mg/ml)的(de)LB固體(ti)培養(yang)基中挑取10個菌落進行(xing)克隆PCR進行(xing)陽性(xing)鑒定(ding)，并接種于一塊新的(de)含抗性(xing)的(de)LB固體(ti)培養(yang)基中。對克隆PCR鑒定(ding)為陽性(xing)的(de)菌落進行(xing)擴大(da)培養(yang)，提(ti)取質(zhi)粒并測(ce)序。質(zhi)粒提(ti)取過程(cheng)按質(zhi)粒提(ti)取試劑盒說明書操(cao)作。

1.3.4酶切與純化

將測序正確的(de)PMD-18T-Rv2626c，PMD-18T-Rv3716c和(he)PMD-18T-TrxC，以及表達載體PET-32a進行(xing)BamHI和(he)EcoRI雙酶(mei)切(qie)。酶(mei)切(qie)產物進行(xing)1％瓊脂糖電泳，目(mu)的(de)片段(duan)切(qie)膠(jiao)回收，并用膠(jiao)純化試劑盒(he)純化。

1.3.5連接與轉化

將純(chun)化的(de)帶酶切位點的(de)Rv2626c，Rv3716c和TrxC基因片(pian)段和載體PET-32a分(fen)別進行如下連(lian)接反應：

將(jiang)經上述(shu)連接(jie)反應(ying)得到的重組的PET-32a-Rv2626c，PET-32a-Rv3716c和PET-32a-TrxC表達載體(ti)分別轉化(hua)大腸桿菌(jun)Rosetta-gami 2(DE3)，并在含(han)有氨芐(50mg/ml)LB固體(ti)培養(yang)基中篩選陽性克隆。

1.4表達

利用大腸桿菌體(ti)外誘導表達潛在結(jie)核特異性抗原的(de)具(ju)體(ti)過程(cheng)為：

1)挑取鑒定為陽性(xing)的(de)菌斑(ban)于3ml含有氨芐抗性(xing)(50mg/ml)的(de)LB液體(ti)培養(yang)中，37℃震蕩培養(yang)12-16小時。

2)按1％轉種于新鮮配置的含有氨芐抗性(50mg/ml)的LB液體培養中，37℃震蕩培養至OD₆₀₀值為0.4-0.6。

3)加(jia)入IPTG至終濃度為0.5mM，37℃下誘(you)導培養3-16小(xiao)時(shi)。

4)4℃10000g下離心(xin)5min，分(fen)別收(shou)集上清和沉淀。

1.5純化

所有在(zai)大腸桿菌表(biao)達的蛋(dan)白均帶有組氨酸標簽，可以(yi)通過(guo)Ni-NAT進行(xing)親和純化，具體過(guo)程(cheng)如下：

1)加入150μL細(xi)胞裂解緩沖液(20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10％甘油(you))和蛋(dan)白酶抑制(zhi)劑PMSF。

2)冰(bing)上超聲破碎細胞。

3)加(jia)入(ru)10％triton X-100，使終(zhong)濃度為0.05％，充分(fen)混勻，冰上放(fang)置10分(fen)鐘(zhong)。

4)4℃13000g離心(xin)15min，取上(shang)清。

5)將Ni-NAT用10倍(bei)柱(zhu)體(ti)積的細胞裂解緩沖液(20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10％甘油)平衡。

6)將上清蛋(dan)白(bai)樣品(pin)加入到Ni-NAT柱(zhu)中，流(liu)速為15ml/h。

7)用5倍柱體積的(de)細(xi)胞裂解緩沖液沖洗Ni-NAT一次(ci)，流(liu)速為(wei)30ml/h。

8)用(yong)5倍柱體(ti)積的內毒素(su)緩沖(chong)液(10mM Tris-HCl pH7.9，0.5％ASB-14)沖(chong)洗Ni-NAT一次，流速為30ml/h。

9)用5倍(bei)柱體積的(de)洗(xi)脫液(20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10％甘油，250mM咪唑(zuo))沖洗(xi)Ni-NAT一次(ci)，流速為15ml/h，收集(ji)洗(xi)脫液。

10)12.5％SDS-PAGE分析蛋白純化(hua)情況。

1.6結果

如圖(tu)1、2和(he)(he)3所示，與對照PET-32a空載體(ti)轉(zhuan)染(ran)大腸(chang)桿菌(jun)Rosetta-gami 2(DE3)相比，PET-32a-Rv2626c，PET-32a-Rv3716c和(he)(he)PET-32a-TrxC轉(zhuan)染(ran)大腸(chang)桿菌(jun)Rosetta-gami 2(DE3)后(hou)在0.5M IPTG誘導下有(you)特異性的蛋(dan)白條(tiao)帶出現(xian)。通過與蛋(dan)白分(fen)子標記對比，Rv2626c，Rv3716c和(he)(he)TrxC分(fen)子大小為12KDa、10KDa和(he)(he)10KDa。

2.評估(gu)潛在結核(he)(he)患者和結核(he)(he)病(bing)人對潛在結核(he)(he)特異性抗原的反(fan)應

2.1實驗樣本

實驗樣(yang)本如表1所示：

表(biao)1受試者樣本特征(zheng)情況(kuang)表(biao)

結(jie)(jie)(jie)核(he)(he)病人(ren)樣本(ben)(ben)：40例結(jie)(jie)(jie)核(he)(he)病人(ren)外周(zhou)全血實驗(yan)樣本(ben)(ben)采(cai)集自深圳市第(di)三人(ren)民醫院結(jie)(jie)(jie)核(he)(he)科門診或住院的(de)結(jie)(jie)(jie)核(he)(he)病人(ren)，經結(jie)(jie)(jie)核(he)(he)桿(gan)菌培養(yang)所(suo)有受(shou)試(shi)者干擾素釋放實驗(yan)均為陽性。

根據潛在(zai)(zai)結(jie)核(he)的定義選(xuan)取(qu)的潛在(zai)(zai)結(jie)核(he)患者樣本(ben)為(wei)：35例潛在(zai)(zai)結(jie)核(he)患者來自于其家庭成(cheng)員(yuan)至少有一(yi)個是結(jie)核(he)病陽(yang)性，且在(zai)(zai)一(yi)起共(gong)同(tong)生(sheng)活超(chao)過半年以上，且排除結(jie)核(he)桿菌(jun)培養(yang)為(wei)陽(yang)性的患者。

2.2γ-干擾素釋(shi)放試驗

γ-干擾素釋(shi)放(fang)試(shi)(shi)驗(yan)(yan)采用QuantiFERON-TB Gold In-Tube(QFT-GIT)試(shi)(shi)劑(ji)盒(Cellestis，Qiagen GmBH)，所有實(shi)驗(yan)(yan)步驟按廠家(jia)說明書進行操作。本實(shi)驗(yan)(yan)35名潛在(zai)結核患者和40名結核病人(ren)γ-干擾素釋(shi)放(fang)試(shi)(shi)驗(yan)(yan)均為陽性(xing)(xing)，說明γ-干擾素釋(shi)放(fang)試(shi)(shi)驗(yan)(yan)不(bu)能(neng)很(hen)好區分潛在(zai)結核和活動性(xing)(xing)結核。

2.3潛在(zai)結(jie)核特異性抗原(yuan)檢測(ce)

2.3.1外(wai)周(zhou)全血分析

1)將肝(gan)素(su)鈉靜脈全血用(yong)RPMI1640稀(xi)釋10倍。

2)往(wang)48孔平底細胞培養(yang)板中(zhong)加(jia)入稀釋外周全(quan)血，每(mei)孔400μL，每(mei)個樣(yang)本4個重(zhong)復。

3)每孔添(tian)加4μL青霉(mei)素(10000U/ml)和4μL鏈霉(mei)素(10mg/ml)。

4)每個樣本(ben)分別添加Rv2626c，Rv3716c和TrxC潛在結核特(te)異性(xing)抗(kang)原，終濃度(du)為5ug/ml；同時設置一個空白對照，該孔不(bu)添加任何(he)潛在特(te)異性(xing)抗(kang)原。

5)37℃、5％二(er)氧化碳培(pei)養(yang)箱培(pei)養(yang)6天。

6)離心收集血清。

2.3.2 IFN-γ和TNF-α檢測

IFN-γ和(he)TNF-α檢測采用達科為生物工程有限公司(si)人IFN-γELISA Kit和(he)人TNF-αELISA Kit。操作過程按說明書(shu)進行。

2.4實驗結果(guo)與判讀

應用潛(qian)在(zai)結(jie)(jie)(jie)核(he)(he)特(te)異性(xing)(xing)(xing)抗原(yuan)Rv2626c，Rv3716c和(he)(he)TrxC對40名(ming)結(jie)(jie)(jie)核(he)(he)病人(ren)(ren)和(he)(he)35名(ming)潛(qian)在(zai)結(jie)(jie)(jie)核(he)(he)患(huan)者(zhe)外(wai)周(zhou)全血(xue)(xue)(xue)進(jin)行特(te)異性(xing)(xing)(xing)刺激，然(ran)后應用ELISA檢測血(xue)(xue)(xue)清樣本中(zhong)的(de)(de)IFN-γ和(he)(he)TNF-α的(de)(de)含(han)量(liang)，我們發(fa)現潛(qian)在(zai)結(jie)(jie)(jie)核(he)(he)患(huan)者(zhe)血(xue)(xue)(xue)清中(zhong)IFN-γ的(de)(de)含(han)量(liang)明顯高(gao)(gao)于(yu)結(jie)(jie)(jie)核(he)(he)病人(ren)(ren)，與之(zhi)相反，潛(qian)在(zai)結(jie)(jie)(jie)核(he)(he)患(huan)者(zhe)血(xue)(xue)(xue)清中(zhong)TNF-α的(de)(de)含(han)量(liang)明顯低于(yu)結(jie)(jie)(jie)核(he)(he)病人(ren)(ren)，結(jie)(jie)(jie)果如(ru)圖4和(he)(he)圖5所示(shi)，表明經潛(qian)在(zai)結(jie)(jie)(jie)核(he)(he)特(te)異性(xing)(xing)(xing)抗原(yuan)刺激，IFN-γ可以(yi)作(zuo)為(wei)潛(qian)在(zai)結(jie)(jie)(jie)核(he)(he)患(huan)者(zhe)特(te)異性(xing)(xing)(xing)檢測因(yin)子(zi)(zi)，TNF-α可以(yi)作(zuo)為(wei)結(jie)(jie)(jie)核(he)(he)病人(ren)(ren)特(te)異性(xing)(xing)(xing)檢測因(yin)子(zi)(zi)。我們把受(shou)試的(de)(de)35名(ming)潛(qian)在(zai)結(jie)(jie)(jie)核(he)(he)患(huan)者(zhe)設(she)為(wei)診斷(duan)組(zu)(zu)，另外(wai)40名(ming)結(jie)(jie)(jie)核(he)(he)病人(ren)(ren)作(zuo)為(wei)對照組(zu)(zu)，以(yi)診斷(duan)組(zu)(zu)陽(yang)性(xing)(xing)(xing)率最高(gao)(gao)和(he)(he)對照組(zu)(zu)陽(yang)性(xing)(xing)(xing)率最低為(wei)標準(zhun)，利用受(shou)試者(zhe)工(gong)作(zuo)特(te)征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC curve)篩選出(chu)最佳(jia)陽(yang)性(xing)(xing)(xing)判(pan)斷(duan)閾值(如(ru)表2所示(shi))。受(shou)試者(zhe)血(xue)(xue)(xue)清中(zhong)IFN-γ和(he)(he)TNF-α含(han)量(liang)高(gao)(gao)于(yu)陽(yang)性(xing)(xing)(xing)判(pan)斷(duan)閾值的(de)(de)判(pan)定為(wei)陽(yang)性(xing)(xing)(xing)，低于(yu)陽(yang)性(xing)(xing)(xing)判(pan)斷(duan)閾值的(de)(de)判(pan)斷(duan)為(wei)陰(yin)性(xing)(xing)(xing)。

IFN-γELISA檢(jian)測(ce)中，如表2所示，Rv2626c，Rv3716c和TrxC對潛(qian)在(zai)結(jie)核(he)(he)患(huan)者(zhe)陽性判(pan)定數均為(wei)31個，陽性率為(wei)31/35＝88.5％；Rv2626c，Rv3716c和TrxC對結(jie)核(he)(he)病人陽性率分別為(wei)7.5％，12.5％和10％。由(you)此可以看出，三者(zhe)相比，Rv2626c對潛(qian)在(zai)結(jie)核(he)(he)患(huan)者(zhe)檢(jian)測(ce)的準確(que)率最高(gao)。

TNF-αELISA檢(jian)測中，如表2所示，Rv2626c，Rv3716c和(he)TrxC對(dui)潛在結核(he)患者陽(yang)性判(pan)定數(shu)均為4個，陽(yang)性率為4/35＝11.4％；Rv2626c，Rv3716c和(he)TrxC對(dui)結核(he)病人陽(yang)性率分別為70％，72.5％和(he)57.5％。由此可(ke)以(yi)看出，Rv2626c和(he)Rv3716c對(dui)結核(he)病人的檢(jian)測準確率要好于TrxC。

表(biao)2：IFN-γ和TNF-α對(dui)潛(qian)在結核特異(yi)性抗(kang)原的反應結果

于(yu)此同時我(wo)們發現，Rv2626c分別聯(lian)(lian)合(he)其它兩種(zhong)特異(yi)性(xing)(xing)抗原(yuan)(yuan)Rv3716c和(he)TrxC能(neng)明顯(xian)提(ti)(ti)高潛(qian)在(zai)(zai)(zai)結(jie)核(he)患者(zhe)陽(yang)(yang)性(xing)(xing)檢(jian)測率(lv)，檢(jian)測數(shu)據如表3所示。對(dui)于(yu)聯(lian)(lian)合(he)抗原(yuan)(yuan)檢(jian)測來說，陽(yang)(yang)性(xing)(xing)判斷標(biao)準為只要(yao)有一(yi)種(zhong)抗原(yuan)(yuan)檢(jian)測結(jie)果為陽(yang)(yang)性(xing)(xing)即判定為陽(yang)(yang)性(xing)(xing)。從(cong)(cong)(cong)表3中(zhong)可以看出，Rv2626c+Rv3716c在(zai)(zai)(zai)潛(qian)在(zai)(zai)(zai)結(jie)核(he)患者(zhe)中(zhong)的(de)陽(yang)(yang)性(xing)(xing)率(lv)從(cong)(cong)(cong)88.5％提(ti)(ti)高到(dao)100％，在(zai)(zai)(zai)結(jie)核(he)病人(ren)中(zhong)的(de)陽(yang)(yang)性(xing)(xing)率(lv)從(cong)(cong)(cong)7.5％提(ti)(ti)高到(dao)17.5％；Rv2626c+TrxC在(zai)(zai)(zai)潛(qian)在(zai)(zai)(zai)結(jie)核(he)患者(zhe)中(zhong)的(de)陽(yang)(yang)性(xing)(xing)率(lv)從(cong)(cong)(cong)88.5％提(ti)(ti)高到(dao)97.14％，在(zai)(zai)(zai)結(jie)核(he)病人(ren)中(zhong)的(de)陽(yang)(yang)性(xing)(xing)率(lv)從(cong)(cong)(cong)7.5％提(ti)(ti)高到(dao)12.5％。

表3 IFN-γ對(dui)聯合抗(kang)原的(de)反應(ying)結果

基于(yu)IFN-γ可以作為(wei)潛(qian)在結(jie)(jie)(jie)核(he)患(huan)者(zhe)(zhe)特(te)異(yi)(yi)性(xing)(xing)檢(jian)測因(yin)子，TNF-α可以作為(wei)結(jie)(jie)(jie)核(he)病人特(te)異(yi)(yi)性(xing)(xing)檢(jian)測因(yin)子，猜想(xiang)，利(li)(li)用IFN-γ/TNF-α比值(zhi)(zhi)作為(wei)潛(qian)在結(jie)(jie)(jie)核(he)診斷因(yin)子可能有(you)(you)助于(yu)提高(gao)檢(jian)測特(te)異(yi)(yi)性(xing)(xing)和靈(ling)(ling)敏度(du)。IFN-γ/TNF-α比值(zhi)(zhi)為(wei)同一病人血(xue)清樣(yang)本經潛(qian)在結(jie)(jie)(jie)核(he)特(te)異(yi)(yi)性(xing)(xing)抗原刺激后IFN-γ釋(shi)放量除以TNF-α釋(shi)放量，并利(li)(li)用受試(shi)者(zhe)(zhe)工作特(te)征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC curve)篩選出最(zui)佳陽性(xing)(xing)判(pan)斷閾值(zhi)(zhi)(如表4所示(shi))，Rv2626c，Rv3716c和TrxC在潛(qian)在結(jie)(jie)(jie)核(he)患(huan)者(zhe)(zhe)中的(de)陽性(xing)(xing)率均為(wei)94.2％，在結(jie)(jie)(jie)核(he)病人中的(de)陽性(xing)(xing)率分別為(wei)7.5％，5％和5％。因(yin)此利(li)(li)用IFN-γ/TNF-α比值(zhi)(zhi)檢(jian)測中，Rv3716c和TrxC具有(you)(you)最(zui)佳檢(jian)測效果，對潛(qian)在結(jie)(jie)(jie)核(he)患(huan)者(zhe)(zhe)檢(jian)測的(de)靈(ling)(ling)敏度(du)為(wei)94.2％，特(te)異(yi)(yi)性(xing)(xing)為(wei)95％。

表(biao)4 IFN-γ/TNF-α比值對潛在結核檢測診(zhen)斷效(xiao)果

2.5結論

從本(ben)實驗可以看出，利用(yong)潛(qian)在(zai)結核(he)特(te)異(yi)(yi)性抗(kang)(kang)原(yuan)Rv2626c，Rv3716c和(he)TrxC能(neng)夠很好的區分潛(qian)在(zai)結核(he)患者和(he)結核(he)病人。運(yun)用(yong)Rv2626c+Rv3716c或(huo)Rv2626c+TrxC雙抗(kang)(kang)原(yuan)進行IFN-γ單(dan)因(yin)子ELISA檢測(ce)，可以提高潛(qian)在(zai)結核(he)診(zhen)斷(duan)的靈敏度(du)，但代價是降低(di)了(le)檢測(ce)的特(te)異(yi)(yi)性。而(er)運(yun)用(yong)Rv3716c和(he)TrxC其中(zhong)任何一個(ge)單(dan)抗(kang)(kang)原(yuan)進行IFN-γ/TNF-α比(bi)值的雙因(yin)子檢測(ce)，潛(qian)在(zai)結核(he)診(zhen)斷(duan)靈敏度(du)從88.5％提高到94.2％，特(te)異(yi)(yi)性從92.5％提高到95％，沒有因(yin)靈敏度(du)提高而(er)降低(di)特(te)異(yi)(yi)性。

目前，還(huan)沒有一款產品能(neng)夠很好的(de)區分(fen)潛(qian)在結(jie)(jie)(jie)核(he)(he)和(he)(he)活(huo)動(dong)性結(jie)(jie)(jie)核(he)(he)，以γ-干擾素釋(shi)放(fang)試驗(interferon-γrelease assays，IGRAs)為例，它能(neng)同時檢測(ce)出潛(qian)在結(jie)(jie)(jie)核(he)(he)和(he)(he)活(huo)動(dong)性結(jie)(jie)(jie)核(he)(he)，但是不(bu)能(neng)將兩者區分(fen)開。本實(shi)驗35名潛(qian)在結(jie)(jie)(jie)核(he)(he)患者和(he)(he)40名結(jie)(jie)(jie)核(he)(he)病人運(yun)用(yong)QuantiFERON-TB Gold In-Tube(QFT-GIT)試劑盒進行檢測(ce)均呈陽性。而采用(yong)潛(qian)在結(jie)(jie)(jie)核(he)(he)特異性抗原Rv2626c，Rv3716c和(he)(he)TrxC，并運(yun)用(yong)我們(men)開發(fa)的(de)IFN-γ和(he)(he)TNF-α雙(shuang)因子(zi)檢測(ce)能(neng)很好的(de)區分(fen)潛(qian)在結(jie)(jie)(jie)核(he)(he)和(he)(he)活(huo)動(dong)性結(jie)(jie)(jie)核(he)(he)。

實施例2

潛在結核ELISA診斷(duan)試劑盒的(de)制備。

1、待測樣本準備

待(dai)測樣本分(fen)為三組，分(fen)別(bie)為健康(kang)人(ren)，潛在結核(he)患者(zhe)和(he)結核(he)病人(ren)。

健(jian)康人(ren)樣(yang)本數為(wei)(wei)18個，血液樣(yang)本來自(zi)深圳市第三人(ren)民醫院門(men)診部和住院部，經(jing)結核桿菌(jun)培(pei)養為(wei)(wei)陰性，且都(dou)有卡介(jie)苗(miao)接種經(jing)歷。

潛在結(jie)核患者樣本(ben)數(shu)為21個，血液樣本(ben)來自(zi)于上述(shu)實(shi)施例1所述(shu)，且都有(you)卡(ka)介苗接種經歷。

結核病人樣本數為(wei)29個，血液(ye)樣本來自于上述實施例1所述，且都有卡介苗接種經(jing)歷(li)。

2、診斷過程涉及的(de)試劑

診(zhen)斷過程涉及的試劑包(bao)括ELISA板，IFN-γ包(bao)被抗(kang)(kang)(kang)體和檢(jian)(jian)測抗(kang)(kang)(kang)體，TNF-α包(bao)被抗(kang)(kang)(kang)體和檢(jian)(jian)測抗(kang)(kang)(kang)體，包(bao)被抗(kang)(kang)(kang)體緩(huan)沖液(ye)(ye)，檢(jian)(jian)測抗(kang)(kang)(kang)體稀釋液(ye)(ye)，洗(xi)滌緩(huan)沖液(ye)(ye)，終(zhong)止緩(huan)沖液(ye)(ye)，TMB，Streptavidin-HRP，RPMI1640，青霉素，鏈(lian)霉素，Rv3716c和TrxC。結核(he)診(zhen)斷特(te)異(yi)性抗(kang)(kang)(kang)原ESAT-6，CFP-10和TB7.7來自(zi)于QFT-GIT試劑盒。

3、潛(qian)在結核(he)ELISA診斷試劑盒制(zhi)備過(guo)程

1)用0.15M pH7.2的PBS作為包被(bei)抗(kang)(kang)體(ti)緩沖液稀釋IFN-γ包被(bei)抗(kang)(kang)體(ti)和(he)TNF-α包被(bei)抗(kang)(kang)體(ti)，具體(ti)稀釋度(du)依據不同抗(kang)(kang)體(ti)公司原料，生產(chan)批(pi)號和(he)棋(qi)盤滴(di)定(ding)實驗而定(ding)。

2)往(wang)96孔(kong)(kong)ELISA板中加(jia)入(ru)(ru)含有包(bao)(bao)被(bei)抗(kang)體的(de)工(gong)作(zuo)液，每(mei)孔(kong)(kong)100μL。每(mei)五孔(kong)(kong)為一個檢測單元，前四孔(kong)(kong)加(jia)入(ru)(ru)IFN-γ包(bao)(bao)被(bei)抗(kang)體工(gong)作(zuo)液，第五孔(kong)(kong)加(jia)入(ru)(ru)TNF-α包(bao)(bao)被(bei)抗(kang)體工(gong)作(zuo)液。

3)4℃過夜。

4)倒掉包被抗體工(gong)作液(ye)，用(yong)洗滌緩沖液(ye)洗滌5遍。

5)自然風干。

4、潛在結(jie)核ELISA診斷(duan)試劑盒操作過程

4.1全血樣本制備

1)將(jiang)肝(gan)素鈉靜脈全血用RPMI1640稀釋(shi)10倍。

2)往(wang)48孔平底細胞(bao)培養板中加入稀(xi)釋外(wai)周(zhou)全(quan)血，每孔400μL，每個樣本4個重復。

3)每孔(kong)添加(jia)4μL青霉素(su)(10000U/ml)和4μL鏈霉素(su)(10mg/ml)，得到全血樣本(ben)。

4.2 IFN-γ和TNF-αELISA分析(xi)

ELISA分析參照達科(ke)為(wei)生(sheng)物工程(cheng)有限(xian)公司IFN-γ和TNF-α檢測試劑(ji)盒(he)說明(ming)進行，具(ju)體加(jia)樣(yang)過程(cheng)和順序如表5所示(shi)：

表(biao)5：IFN-γ和TNF-αELISA分(fen)析的加樣順序表(biao)

5、陽性判定方法

ESAT-6和CFP-10刺(ci)激陽(yang)性(xing)(xing)判(pan)定(ding)(ding)閾值為IFN-γ25pg/ml，Rv3716c刺(ci)激后陽(yang)性(xing)(xing)判(pan)定(ding)(ding)閾值為IFN-γ/TNF-α2.07，TrxC刺(ci)激后陽(yang)性(xing)(xing)判(pan)定(ding)(ding)閾值為IFN-γ/TNF-α1.93。具體陽(yang)性(xing)(xing)判(pan)定(ding)(ding)標(biao)準(zhun)如(ru)表6所(suo)示。

表6：陽性判定表

6、應用制備的ELISA試劑盒進行潛在結核診斷的實(shi)驗(yan)結果

對18個健康人，21個潛在結(jie)(jie)核(he)(he)患者和(he)29個結(jie)(jie)核(he)(he)病人應用達(da)科(ke)為公司制備(bei)的潛在結(jie)(jie)核(he)(he)ELISA檢(jian)測試(shi)(shi)劑盒進行檢(jian)測，結(jie)(jie)果(guo)如(ru)表(biao)7所示。由(you)于Rv3716C和(he)TrxC刺激(ji)得(de)到的實驗結(jie)(jie)果(guo)相似，故表(biao)7只列出了Rv3716C刺激(ji)后(hou)得(de)到的檢(jian)測結(jie)(jie)果(guo)。從表(biao)7中可以看到，孔1(陰(yin)性(xing)(xing)對照)全部為陰(yin)性(xing)(xing)，孔2(陽(yang)性(xing)(xing)對照)全部為陽(yang)性(xing)(xing)，說明試(shi)(shi)劑盒制備(bei)沒有(you)問(wen)題(ti)，達(da)到質量控(kong)制要求。

表7：采(cai)用Rv3716C抗(kang)原的潛在結核ELISA診斷試劑盒檢(jian)測結果(guo)

本(ben)(ben)實(shi)施例(li)僅詳(xiang)細介紹了使(shi)(shi)用(yong)潛(qian)在(zai)(zai)結(jie)(jie)(jie)核(he)(he)(he)特異(yi)性(xing)抗(kang)原(yuan)(yuan)(yuan)Rv3716c或TrxC來制(zhi)(zhi)備(bei)(bei)潛(qian)在(zai)(zai)結(jie)(jie)(jie)核(he)(he)(he)診(zhen)(zhen)(zhen)斷(duan)(duan)試(shi)(shi)劑(ji)(ji)盒，但(dan)其(qi)(qi)保(bao)(bao)護范(fan)圍不(bu)(bu)限于使(shi)(shi)用(yong)潛(qian)在(zai)(zai)結(jie)(jie)(jie)核(he)(he)(he)特異(yi)性(xing)抗(kang)原(yuan)(yuan)(yuan)Rv3716C或TrxC，還(huan)包(bao)括使(shi)(shi)用(yong)潛(qian)在(zai)(zai)結(jie)(jie)(jie)核(he)(he)(he)特異(yi)性(xing)抗(kang)原(yuan)(yuan)(yuan)Rv2626c。此外，本(ben)(ben)實(shi)施例(li)僅詳(xiang)細介紹了使(shi)(shi)用(yong)潛(qian)在(zai)(zai)結(jie)(jie)(jie)核(he)(he)(he)特異(yi)性(xing)抗(kang)原(yuan)(yuan)(yuan)聯合(he)活動性(xing)結(jie)(jie)(jie)核(he)(he)(he)檢測(ce)抗(kang)原(yuan)(yuan)(yuan)SAT-6，CFP-10和(he)(he)TB7.7，但(dan)其(qi)(qi)保(bao)(bao)護范(fan)圍不(bu)(bu)限于聯合(he)SAT-6，CFP-10和(he)(he)TB7.7，還(huan)包(bao)括聯合(he)其(qi)(qi)他(ta)活動性(xing)結(jie)(jie)(jie)核(he)(he)(he)檢測(ce)特異(yi)性(xing)抗(kang)原(yuan)(yuan)(yuan)。另(ling)外，潛(qian)在(zai)(zai)結(jie)(jie)(jie)核(he)(he)(he)診(zhen)(zhen)(zhen)斷(duan)(duan)試(shi)(shi)劑(ji)(ji)盒還(huan)可以(yi)結(jie)(jie)(jie)合(he)ELISA/ELISPOT/流式(shi)方法，制(zhi)(zhi)備(bei)(bei)相應的潛(qian)在(zai)(zai)結(jie)(jie)(jie)核(he)(he)(he)ELISA診(zhen)(zhen)(zhen)斷(duan)(duan)試(shi)(shi)劑(ji)(ji)盒、潛(qian)在(zai)(zai)結(jie)(jie)(jie)核(he)(he)(he)ELILSPOT診(zhen)(zhen)(zhen)斷(duan)(duan)試(shi)(shi)劑(ji)(ji)盒和(he)(he)潛(qian)在(zai)(zai)結(jie)(jie)(jie)核(he)(he)(he)流式(shi)診(zhen)(zhen)(zhen)斷(duan)(duan)試(shi)(shi)劑(ji)(ji)盒，本(ben)(ben)實(shi)施例(li)僅詳(xiang)細介紹了潛(qian)在(zai)(zai)結(jie)(jie)(jie)核(he)(he)(he)ELISA診(zhen)(zhen)(zhen)斷(duan)(duan)試(shi)(shi)劑(ji)(ji)盒的制(zhi)(zhi)備(bei)(bei)，但(dan)其(qi)(qi)保(bao)(bao)護范(fan)圍不(bu)(bu)限于使(shi)(shi)用(yong)其(qi)(qi)它通用(yong)技(ji)(ji)術使(shi)(shi)用(yong)本(ben)(ben)抗(kang)原(yuan)(yuan)(yuan)，還(huan)包(bao)括結(jie)(jie)(jie)核(he)(he)(he)ELILSPOT診(zhen)(zhen)(zhen)斷(duan)(duan)試(shi)(shi)劑(ji)(ji)盒和(he)(he)結(jie)(jie)(jie)核(he)(he)(he)流式(shi)診(zhen)(zhen)(zhen)斷(duan)(duan)試(shi)(shi)劑(ji)(ji)盒及其(qi)(qi)他(ta)通用(yong)技(ji)(ji)術使(shi)(shi)用(yong)本(ben)(ben)抗(kang)原(yuan)(yuan)(yuan)的試(shi)(shi)劑(ji)(ji)盒。

本(ben)發(fa)明(ming)的實(shi)施例(li)2詳細介紹了使(shi)用潛(qian)(qian)在(zai)(zai)結(jie)(jie)核(he)(he)特(te)異性抗原(yuan)(yuan)并聯(lian)合活(huo)動性結(jie)(jie)核(he)(he)檢(jian)測(ce)抗原(yuan)(yuan)在(zai)(zai)制備潛(qian)(qian)在(zai)(zai)結(jie)(jie)核(he)(he)診(zhen)斷試劑盒(he)方面(mian)的應用，聯(lian)合后的效果是(shi)通(tong)過一(yi)(yi)個(ge)產品就(jiu)能同時區(qu)分健康人、潛(qian)(qian)在(zai)(zai)結(jie)(jie)核(he)(he)患(huan)(huan)者和活(huo)動性結(jie)(jie)核(he)(he)患(huan)(huan)者。在(zai)(zai)其(qi)他實(shi)施例(li)中，還可以提供(gong)一(yi)(yi)種(zhong)只檢(jian)測(ce)潛(qian)(qian)在(zai)(zai)結(jie)(jie)核(he)(he)的試劑盒(he)，與(yu)實(shi)施例(li)2的區(qu)別(bie)僅在(zai)(zai)于只使(shi)用本(ben)發(fa)明(ming)篩選出(chu)的潛(qian)(qian)在(zai)(zai)結(jie)(jie)核(he)(he)特(te)異性抗原(yuan)(yuan)，不聯(lian)合其(qi)他活(huo)動性結(jie)(jie)核(he)(he)檢(jian)測(ce)抗原(yuan)(yuan)，其(qi)他制備步(bu)驟(zou)和使(shi)用方法均相同，從而開發(fa)出(chu)一(yi)(yi)種(zhong)只檢(jian)測(ce)潛(qian)(qian)在(zai)(zai)結(jie)(jie)核(he)(he)的試劑盒(he)。

以(yi)上內(nei)容是結(jie)合具體的(de)優選實施方式對(dui)本(ben)(ben)發明(ming)所作(zuo)的(de)進一步詳(xiang)細說明(ming)，不能認(ren)定本(ben)(ben)發明(ming)的(de)具體實施只(zhi)局限于這些說明(ming)。對(dui)于本(ben)(ben)發明(ming)所屬技術(shu)(shu)領域(yu)的(de)技術(shu)(shu)人員來說，在不脫離本(ben)(ben)發明(ming)構思(si)的(de)前提(ti)下，還可以(yi)做出(chu)若干等同替代或(huo)明(ming)顯變型，而且性能或(huo)用途(tu)相(xiang)同，都應(ying)當視(shi)為屬于本(ben)(ben)發明(ming)的(de)保(bao)護(hu)范圍。