用于檢測結核分枝桿菌pncA基因突變的試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種用于檢測導致結核分枝桿菌化嗦酷胺耐藥基因pncA基因突變熱 點區7個突變的試劑盒，屬于結核病耐藥基因突變檢測技術領域。
【背景技術】
[0002] 結核病是結核分枝桿菌引起的慢性感染性疾病。自柯赫化och)發現結核桿菌W 來，結核病一直威脅人類健康，而且治療結核病的疫苗、藥物和診斷技術一直是人類不斷尋 求解決的目標。近年來，近年，抗生素濫用、環境污染和艾滋病等原因導致，結核病有卷± 重來，發病率和死亡率明顯回升趨勢，已經成為與追疾和AIDS并成為傳染病的Ξ大殺手之 一。更為嚴峻的是，結核桿菌對現有的藥物變得更耐藥。仍然是發展中國家較為嚴重的傳 染病之一。根據世界衛生組織（World化alth化ganization，WHO)統計表明，在2011年， 全球有870萬活動性結核病新發病例（其中13%設及同時感染人類免疫缺陷病毒）和140 萬例死亡，包括HIV感染患者中的43萬例死亡，有31萬耐多藥結核病首發病例，由至少對 異煙阱及利福平耐藥的微生物所致。運些患者60%W上在中國、印度、俄羅斯聯邦、己基斯 坦W及南非。共有84個國家報告了廣泛耐藥結核病病例，撒哈拉W南非洲有最高的人均活 動性結核病發生率，主要由于HIV的流行所致。病例絕對數最多者來自亞洲，印度和中國在 全球具有最重的疾病負擔。目前，我國是當前全球結核病高發國家之一，結核病耐藥情況相 當嚴重，非結核分枝桿菌病也呈現逐年增加的趨勢。我國現有活動性肺結核病患者451萬， 菌檢陽性肺結核患者病人196萬，每年死亡人數約13萬結核桿菌總耐藥率為27. 8%，初始耐 藥率為18. 6%，獲得性耐藥率為46. 5%，耐多藥率為10. 7%，其中異煙阱、利福平和鏈霉素耐 藥情況較為嚴重。
[0003]化嗦酷胺常常會與利福平和異煙阱等一線藥物聯合使用治療結核病，可W使患者 的治療周期9-12月縮短至6個月，可W高效殺死體內耐酸環境中（pH> 5. 5)的菌體，而 其它的藥物難W殺死運類菌。在pncA基因編碼的化嗦酷胺酶作用下，細胞內的化嗦酷胺轉 變為化嗦酸（pyrazinoicacid,P0A)，通過被動擴散和外排作用到達細胞膜表面，質子化 的化嗦酸促使細胞質酸化形成電勢差，影響細胞的跨膜運輸pncA基因突變引起化嗦酷胺 耐藥，該基因長度為561bp，編碼化嗦酷胺酶，耐化嗦酷胺菌株中該基因發生突變的頻率為 68%-95%〇
[0004] 結核分枝桿菌抵制藥物活性的機制，大致通過低細胞膜的通透性和外排累機制， 產生降解或滅活酶類，藥物祀位的改變。或者結核桿菌無法通過質粒的介導從其他細菌獲 得耐藥性，因此染色體介導的耐藥性是MTB產生耐藥的主要基礎。目前對MTB耐藥分子機 制的研究主要集中在藥物的作用祀位及其相關基因的突變上。因此，新的耐藥基因位點的 發現對于快速、高通量、簡便檢測提供了有效的手段和策略。
[0005] 經文獻檢索，未見與本發明檢測突變位點相同的公開報道。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的在于提供一種檢測結核分枝桿菌pncA基因突變的方法。
[0007] 本發明提供了用于檢測結核耐化嗦酷胺藥物pncA基因7個突變位點 (-12TX：、-llA〉G、-7T〉C、c. 3G〉A、c. 233G〉A、c. 408InsA、c. 538-561del和 +l-+18del)的試 劑盒。
[0008] 本發明通過檢測來自耐化嗦酷胺結核菌株的樣本中是否存在pncA基因的7個突 變，從而判斷該患者耐化嗦酷胺藥物的耐藥分子機制，其中-12T〉C，-11A〉G，-7T乂，C. 3G〉A， c. 233G〉A，c. 408InsA，c. 538-561del和+l-+18del突變為pncA基因的突變，運些突變分別 導致口11〇4基因編碼區上游第屯位、第^^一位和第十二位堿基（-12T〉C，-11A〉G，-7TX：)，編 碼區第3位和第233位堿基（C.3G〉A，C.233G〉A)發生改變，C.408InsA和C.538-561del和 +l-+18del導致移碼突變。運些突變影響了pncA基因表達，改變了該基因的氨基酸組成，或 延長或縮短該基因編碼蛋白，從而發揮其抗化嗦酷胺的作用，進而使該菌株產生耐藥。
[0009] 發明人用候選基因篩查的方法，在中國16株耐化嗦酷胺結核菌株中進行檢測， 在六株耐藥結核菌種發現與耐化嗦酷胺相關的pncA基因新突變7個，其中5個為新突變 (-12TX：、-llA〉G、-7T〉C、c. 408InsA、c. 538-561del和+l-+18del)，該突變的頻率為43.7〇/〇， 運說明在耐化嗦酷胺的結核菌株中，pncA基因突變具有較高的發生頻率，因此pncA基因突 變可W作為臨床化嗦酷胺耐藥菌株耐藥分子機制的診斷依據。并且目前，在國際和國內均 未見其中5個突變的報道。
[0010]本發明用于檢測pncA基因 7 個突變（-12T〉C，-11A〉G，-7T〉C，C. 3G〉A，C. 233G〉A， c. 408InsA，c. 538-561del和+l-+18del)的試劑盒，包括用于檢測pncA基因的7個突變所 需的試劑和能選用的用于擴增pncA基因的試劑和PCR引物。
[0011]用于檢測pncA基因 7 個突變（-12T〉C，-11A〉G，-7T〉C，C. 3G〉A，C. 233G〉A， c. 408InsA，c. 538-561del和+l-+18del)的試劑盒，包括W下一種或幾種試劑的組合： (1) 從待檢樣品中提取DNA的試劑； (2) 用于擴增結核菌樣本DNA的pncA基因7個突變的PCR引物和相關的PCR反應試 劑； (3)PCR產物純化試劑； (4) 對PCR產物進行直接測序的試劑。
[0012]用于檢測pncA基因 7 個突變（-12T〉C，-11A〉G，-7T〉C，C. 3G〉A，C. 233G〉A， c. 408InsA，c. 538-561del和 +l-+18del)的試劑盒，所用的PCR引物為： pncA-F:5' -TGTCGCTCACTACATCACC-3'pncA-R:5, -TCGTAGGTCATAGCGTAGG-3' 用于檢測pncA基因 7 個突變（-12T〉C，-11A〉G，-7T〉C，c. 3G〉A，c. 233G〉A，c. 408InsA，c. 538-561del和+l-+18del)的試劑盒，所述檢測PCR擴增產物的試劑選自測序檢測試劑、 限制性內切酶長度多態性檢測試劑、序列特異性引物檢測試劑、探針雜交檢測試劑及SNP 分型檢測試劑。
[001引采用PCR擴增-直接測序的方法來檢測樣本的突變情況，具體操作步驟如下： (1) 采集待測個體的樣本，為培養的結核菌樣本，提取全基因組DNA; (2) W提取的DNA為模板，隊本發明設計的針對pncA基因編碼區及上下游區域的引物 進行DNA序列的擴增，得到相應的PCR擴增產物； (3)將得到的PCR產物純化后，進行直接測序分析，將所測得的序列與pncA基因及其上 下游的正常序列進行比對，確定7個突變是否存在； (4)根據W上實驗結果分析患者是否為pncA基因突變導致的耐化嗦酷胺結核分枝桿 困困株； (5) 按照正常編碼序列閱讀框對突變序列進行翻譯，進一步確定錯義突變和移碼突變 的存在。
[0014] 發明人在收集耐藥結核分枝桿菌進行實驗的過程中，收集到16株耐化嗦酷胺的 結核菌株，在取得患者同意的前提下，對患者感染的結核分枝桿菌進行基因檢測。同時，我 們還收集了患者的基本信息和臨床信息，詳細詢問了其感染和發病過程，建立了結核分枝 桿菌耐藥株的樣本庫。將滅活的結核分枝桿菌凍存于-80 °C冰箱。用柱吸附的方法提取結 核菌的基因組DNA，保存于-40°C冰箱，每份DNA樣本具有對應的患者資料和耐藥信息。用引 物設計軟件Prime巧和01 igo6設計PCR擴增引物，包括了結核菌pncA基因編碼區上游161 位堿基到編碼區下游321位堿基的DNA片段，用于PCR擴增。PCR擴增產物直接用PCR引物 進行正反向測序(測序所用儀器為ABI公司3730型DNA測序儀)。將得到的序列與GenBank 中的序列進行比對，確定pncA基因突變的存在。
[001引pncA基因突變的核巧酸或氨基酸序列如下：
pncA基因突變的核巧酸和氨基酸序列中，用方框標出的是突變的堿基或氨基酸，用開 放框標出的是移碼突變后的氨基酸，用橫線標出的是起始密碼子；位于pncA基因編碼序列 前的第7 (T乂)，11 (A〉G)和12 (T〉C)位堿基的突變，使pncA基因上游的調控序列發生變 化，導致pncA蛋白的轉錄和翻譯發生改變