一種檢測結核分枝桿菌及其耐藥基因突變的試劑盒及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及結核分枝桿菌及其耐藥基因突變檢測領域，具體涉及一種檢測結核分 枝桿菌及其耐藥基因突變的試劑盒及其應用。
【背景技術】
[0002] 結核病是由結核分枝桿菌（結核菌）感染所導致的疾病。自20世紀后期開始，結 核病發病率逐漸上升，至今仍然是單一感染因素引起死亡人數最多的疾病之一。根據世界 衛生組織（World化alth化ganization,WHO) 2012年的最新統計報告，全球將近Η分之一 的人口曾經或者現在感染結核分枝桿菌。2010年全國第五次結核病流行病學抽樣調查結果 顯示，我國仍然是結核病高負擔國家，雖然結核病發病率較上次調查呈現下降趨勢，但又出 現了新的問題。由于結核菌生長緩慢，臨床結核病的診斷和耐藥分析一直是一個難題，造成 對結核病患者的不規范治療現象，引起結核分枝桿菌的耐藥性不斷提高，嚴重影響患者的 治療效果。
[0003] 在引起的臨床結核病的致病菌中，除了結核分枝桿菌外，還有一部分非結核分枝 桿菌（ΝΤΜ，指分枝桿菌屬中除了結核分枝桿菌外的其他分枝桿菌菌種）感染率已經占所有 分枝桿菌感染的11. 1 %。ΝΤΜ所致疾病的臨床表現、X線特征和姨涂片與結核分枝桿菌導 致的結核病極其相似，但治療方式卻不同，大多數非結核分枝桿菌（ΝΤΜ)對臨床抗結核藥 物呈天然的抗藥性，治療方案相差較大，因此與結核分枝桿菌結核病的鑒別診斷顯得尤為 重要。所W運用分子診斷手段檢測結核分枝桿菌的同時，需要對引起疾病極為相似的非結 核分枝桿菌進行鑒別診斷。所述引起結核病的常見非結核分枝桿菌包括鳥分枝桿菌、胞內 分枝桿菌、偶然分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌等。
[0004] 隨著科學技術的逐漸發展，結核病的的耐藥機制及分子基礎正被慢慢解開，目前 的研究發現結核菌發生耐藥的原因是抗結核藥物作用相關基因發生突變導致抗結核藥物 與藥物作用結合位點親和力下降所致。越來越多的研究者試圖利用各種快捷方法進行結核 病耐藥檢測。目前耐藥結核病的診斷方法種類繁多，主要可W分為表型檢測和基因檢測兩 個方面。表型檢測方法主要有結核分枝桿菌藥敏試驗、快速檢查耐藥突變顯微鏡觀察法、 瞻菌體藥敏法、流式細胞術藥敏試驗，但送些種方法均存在較大局限性，遠不能滿足臨床需 求。因此結核菌的耐藥研究方向逐漸轉向基因檢測。在臨床上，五種一線抗結核藥物中利福 平（RFP)\異煙阱（ΙΝΗ)是主要藥物，是國家推薦聯合化療方案的基石，但臨床上已經出現 嚴重的對利福平和異煙阱耐藥的結核分枝桿菌結核病。其中利福平耐藥機制比較明確，其 是由于rpoB基因發生突變引起所編碼RNA多聚酶目亞單位變異而導致利福平無法與RNA 聚合酶結合引起耐藥的。現已證明90%~95%的利福平耐藥結核分枝桿菌存在rpoB基因 突變，且集中于8化P核必區。因此，通過對該區域基因序列的突變檢測可W獲得對利福平 的耐藥信息。
[0005] 耐藥結核病基因檢測主要方法有聚合酶鏈反應-單鏈構象多態性分析 (PCR-SSCP)、限制性片段長度多態性分析（PCR-RFLP)、雙脫氧指紋圖法（ddF)、直接測序法 w及基因芯片法等，但送些方法都由于操作繁瑣、成本較高、技術復雜或者效率較低等缺 陷，未能在臨床上大范圍普及使用。
[0006]出于送種考慮，本發明的發明人進行了研究，目的是解決相關領域現有技術所暴 露出來的問題，期望提供一種耗時短、易操作、高通量、成本低的檢測結核分枝桿菌及其耐 藥基因突變的試劑盒及其應用

【發明內容】

[0007] 本發明的目的是提供一種檢測結核分枝桿菌及其耐藥基因突變的試劑盒，其具有 低成本、易操作、耗時短、靈敏度高、特異性好等突出技術效果，可廣泛應用于臨床檢測。
[0008] 本發明的目的是通過如下技術方案來實現的：
[0009]本發明提供一種檢測結核分枝桿菌及其耐藥基因突變的試劑盒，其包括PCR反 應試劑、固相支持物、含有堿性磯酸酶標記鏈霉親和素的雜交液W及顯色試劑；其中，所述 PCR反應試劑包括用于擴增祀核酸的生物素標記的引物，所述固相支持物的表面固定有用 于檢測結核分枝桿菌及其耐藥基因突變的核酸探針。
[0010] 本發明的試劑盒直接將堿性磯酸酶標記鏈霉親和素加入到雜交液中，可W在核酸 探針與祀核酸雜交的過程中同步實現堿性磯酸酶標記鏈霉親和素與生物素的結合過程，從 而可W在固相支持物表面形成堿性磯酸酶標記核酸雜交體的偶聯物，省去了傳統反向分子 雜交技術中在雜交反應后需要單獨進行酶聯反應的步驟W及其他多個操作步驟，極大縮短 了傳統方法檢測祀核酸的耗時。
[0011] 在本發明的試劑盒中，所述堿性磯酸酶是一種同源二聚體蛋白，是一種含鋒的金 屬酶。每分子酶至少含2個化原子。酶上包含3種類型的金屬結合位點，即所謂的催化結 合位點、結構結合位點和調節結合位點。其中兩個催化結合位點的結合則只會導致一個亞 單位的磯酸化，即負協作亞單位之間發生相互作用。
[0012] 在本發明的試劑盒中，所述生物素有兩個環狀結構I和II。其中，I環為咪哇麗 環，是其與鏈霉親和素結合的主要部位；II環為喔吩環，C2上有一戊酸側鏈；生物素分子通 過其末端的駿基與本發明所述的祀核酸連接，從而標記在祀核酸分子上。
[0013] 在本發明的試劑盒中，所述鏈霉親和素是由鏈霉菌分泌的一種蛋白質，其分子由4 條相同的膚鏈組成，每條膚鏈都能結合一個生物素，因此每個鏈霉親和素分子能結合4個 生物素分子。此外，每條膚鏈的氨基酸組成中，甘氨酸和丙氨酸的含量較大，膚鏈中的色氨 酸殘基是連接生物素的活性基團。所述鏈霉親和素與生物素二者親和結合的常數（K)為 10巧L/mol。在本發明的方法中，祀核酸與核酸探針雜交的同時，鏈霉親和素與生物素也進 行親和結合，因此雜交液中的堿性磯酸酶標記鏈霉親和素分子與固定在固相支持物表面的 核酸探針分子在一步反應中競爭性結合生物素標記的祀核酸分子。
[0014] 本發明的發明人經過大量實驗與創造性勞動發現，在本發明的方法中，將所述堿 性磯酸酶標記鏈霉親和素直接加入到雜交液中，一方面能夠使得堿性磯酸酶標記鏈霉親和 素與生物素標記祀核酸充分的結合；另一方面還能夠促進核酸雜交效率，縮短核酸雜交反 應的時間。
[0015] 根據本發明的一個具體實施例，所述堿性磯酸酶標記鏈霉親和素在雜交液中的濃 度為0. 05~2μg/ml，優選0. 1~1. 5μg/ml，更優選0. 5~1. 2μg/ml。在本發明的方法中， 可W列舉的所述堿性磯酸酶標記鏈霉親和素在雜交液中的濃度包括但不限于；〇. 05μg/ml、0.06μg/ml、0. 07μg/ml、0. 08μg/ml、0. 09μg/ml、0. 1μg/ml、0. 2μg/ml、0. 3μg/ml、 0. 4μg/ml、0. 5μg/ml、0. 6μg/ml、0. 7μg/ml、0. 8μg/ml、0. 9μg/ml、1μg/ml、1. 1μg/ml 矛口 1. 2μ邑/ml。
[0016] 在本發明的試劑盒中，所述堿性磯酸酶標記鏈霉親和素在雜交液中的濃度是本發 明的重要方面。本發明的發明人經過大量試驗與創造性勞動發現，如果堿性磯酸酶標記鏈 霉親和素在雜交液中的濃度過低，郝么影響祀核酸檢測的靈敏度；如果堿性磯酸酶標記鏈 霉親和素在雜交液中的濃度過高，郝么容易帶來非特異性吸附現象，影響祀DNA檢測結果 的準確性。
[0017] 根據本發明的一個具體實施例，所述雜交液包括鋒離子、鎮離子、蛋白、非離子型 表面活性劑和陽離子型聚合物；其中，所述蛋白選自白蛋白、酪蛋白和明膠，所述非離子型 表面活性劑選自吐溫和曲拉通，所述陽離子型聚合物選自陽離子聚丙帰醜胺、多聚賴氨酸 和聚合氯化鉛。
[0018] 根據本發明的一個具體實施例，在所述雜交液中，鋒離子為0. 001~0. 1111〇1/1，鎮 離子為0.001~0.1111〇1/1，蛋白占雜交液的0. 1%~10% (w/v)，非離子型表面活性劑占雜 交液的0. 01~2% (v/v)，陽離子型聚合物占雜交液的0. 01~0. 5% (w/v);優選地，鋒離 子為0. 005~0. 05mol/l，鎮離子為0. 005~0. 05mol/l，蛋白占雜交液的1 %~5 % (w/v)， 非離子型表面活性劑占雜交液的0. 05~1 % (v/v)，陽離子型聚合物占雜交液的0. 05~ 0. 2% (w/v)〇
[0019] 根據本發明的一個具體實施例，所述鋒離子可W選自含鋒離子的可溶性鹽。可用 作本發明的所述含鋒離子的可溶性鹽的實例包括：硫酸鋒、氯化鋒W及其他各種在溶液狀 態可W解離出鋒離子的鹽。
[0020] 根據本發明的一個具體實施例，所述鎮離子可W選自含鎮離子的可溶性鹽。可用 作本發明的所述含鎮離子的可溶性鹽的實例包括：硫酸鎮、己酸鎮、氯化鎮W及其他各種在 溶液狀態可W解離出鎮離子的鹽。
[0021]根據本發明的一個具體實施例，所述吐溫選自吐溫20燈ween-20)、吐溫 21(Tween-21)、吐溫 40(Tween-40)、吐溫 60(Tween-60)、吐溫 61(Tween-61)、吐溫 80燈ween-80)、吐溫81OVeen-Sl)和吐溫85燈ween-85)，其中吐溫20是特別優選的。 [002引根據本發明的一個具體實施例，所述曲拉通選自曲拉通X-100(TritonX-100)、曲 拉通X-114燈ritonX-114)和曲拉通X-200燈ritonX-200)，其中，曲拉通X-100是特別優 選的。
[0023] 在本發明的試劑盒中，本發明的發明人經過大量實驗與創造性勞動發現，酸、堿、 鹽離子或溫度條件的變化都可能會改變甚至使堿性磯酸酶完全失去活性，因此為了實現本 發明的目的，雜交液成分的選擇是極為重要的。在本發明的試劑盒中，發明人通過在雜交液 中添加鋒離子、鎮離子、蛋白和非離子型表面活性劑，一方面有助于提高核酸雜交效率，另 一方面防止雜交液中的堿性磯酸酶標記鏈霉親和素因吸附而變性，再一方面防止堿性磯酸 酶標記鏈霉親和素分子之間因相互作用而導致的聚合變性。
[0024]在本發明的試劑盒中，所述蛋白分子與非離子表面活性劑在雜交液中還能夠進一 步發生協同效應，共同通過范德華力結合到固相支持物的表面，有效防止未反應的堿性磯 酸酶標記鏈霉親和素和/或生物素標記祀標核酸在固相支持物表面的非特異性吸附，起到 很好的封閉作用，從而使本發明的方法可W省去雜交反應前的預雜交步驟。
[00巧]在本發明的試劑盒中，所述陽離子型聚合物能夠與生物素標記的祀核酸分子（通 過PCR擴增獲得的生物素標記祀核酸分子）產生靜電吸附作用，使單鏈核酸分子（帶許多 負電荷）帶上一個正電荷部分，從而在核酸分子雜交過程中同步吸附到固相支持物的表 面。由于堿性磯酸酶標記鏈霉親和素也帶有正電荷，送樣就避免了堿性磯酸酶非特異性吸 附到固相支持物的表面。此外，所述陽離子型聚合物可W使得堿性磯酸酶標記鏈霉親和素 在雜交液中形成均勻懸液，使得雜交反應完成W后標記在核酸偶聯物上的堿性磯酸酶保持 活性狀態，從而使得堿性磯酸酶構象的平衡轉換朝著天然狀態移動。
[0026] 在本發明的試劑盒中，所述雜交液中還可W包括雜交促進劑，所述雜交促進劑在 本質上是本領域技術人員所已知的，可作為本發明所述雜交促進劑的實例包括但不限于： 硫酸葡聚糖、聚己二醇、酪或硫氯酸脈。
[0027] 在本發明的試劑盒中，所述雜交液中還可W包括其他成分，可W列舉的雜交液中 其他成分的實例包括但不限于；氯化鋼、雜交緩沖溶液、Denhar化'S溶液、十二烷基肌氨 酸鋼或十二烷基礙酸鋼。可W用于本發明所述雜交緩沖溶液的實例包括但不限于：巧樣 酸-巧樣酸鋼緩沖溶液或Tris-鹽酸緩沖溶液。
[0028] 在本發明的試劑盒中，所述雜交液不包括己二胺