一種結核分枝桿菌Rv1768基因微滴數字PCR絕對定量檢測試劑盒的制作方法【專利摘要】本發明提供了一種用于檢測結核分枝桿菌的特異性引物和探針組合，采用微滴數字PCR技術檢測全血中結核分枝桿菌特有的,而其他細菌和人體不具有的目的基因Rv1768的拷貝數含量。具有快速、敏感、特異等優點，可用于結核分枝桿菌檢測和預防中。【專利說明】-種結核分枝桿菌Rv1768基因微滴數字PCR絕對定量檢測試劑盒
技術領域：
[0001]本發明設及試劑盒檢測
技術領域：
，具體的說設及一種檢測結核分枝桿菌的微滴數字PCR絕對定量檢測試劑盒。【
背景技術：
】[0002]結核分枝桿菌(Mycobacteriumtube;rculosis,M.憂），俗稱結核桿菌，是引起人結核病的主要病原菌，其感染引起的結核病(Tuberculosis,TB)是全球Ξ大傳染病殺手之一。據2015年最新流行病學統計，全球2014年新增結核病例約960萬人，并導致約150萬人死亡。全球約有將近1/^3的人口感染過結核分枝桿菌，其中90-98%為潛伏感染，其中的2-10%會發展為活動性結核。近年來，由于耐藥株的流行、艾滋病與結核病聯合發病，使結核病的治療難度加大并且嚴重威脅著人類健康。因此早期明確的診斷對于結核病的治療及傳播的控制具有極其重要的意義。[0003]目前臨床上應用的結核病診斷技術主要有結核菌素(PPD)試驗、疲細菌培養、抗酸染色、血清學抗體檢測、定量PCR、IFN-丫的E：LISpot或T-Spot檢測等方法(MitchisonDA.ThediagnosisandtherapyoftuberculosisduringthepastlOOye曰rs[J].AmJRespirCritCareMed，2005,171(7):699-706.)。但是W上方法在臨床應用中各有靈敏度低、耗時、或特異性差，或不能檢測T細胞免疫缺陷的感染者等缺點（MitchisonDA.Thediagnosisandtherapyoftuberculosisduringthep曰stlOOye曰rs[J].AmJRespirCritCareMed,2005,171(7):699-706.)，如pro試驗的假陽性率高，無法區分是MTB感染還是卡介苗(BCG)接種;抗體的檢測無法診斷感染早期抗原出現而抗體還未產生的"窗口期"；采用疲涂片等抗酸染色檢測由于疲液取樣均一性較差等因素造成診斷準確性下降，并且該方法靈敏度較低，檢出率僅約為33%(全國結核病流行病學抽樣調查技術指導組.2000年全國結核病流行病學抽樣調查報告[J].中國防瘦雜志，2002(02):3-46.)。由于血液中結核分枝桿菌含量極低，一般技術很難W血液樣本中結核基因進行準確檢測化imaJF，GuedesGΜ,LimaJF,LiraLA,SantosFC,ArrudaME,MontenegroLM,SchindlerHC.Single-tubenestedPCRassaywithin-houseDNAextractionforMycobacteriumtuberculosisdetectioninbloodandurine[J].RevSocBrasMedTrop,2015,48(6):731-738.)。最近發展的實時定量PCR(quantitativepolymerasechainreaction,qPCR)技術具有較快速、靈敏度高、特異性較強的優點，qPCR技術檢測的是結核特異基因的含量，但樣本通常僅是限于病人疲液而不是血液（由于血液中結核菌含量很低），或對少數免疫低下病人血液(血液中結核菌含量高于正常人的）的檢測。qPCR要求目的基因拷貝數相對較高，對目的基因做出相對定量分析，可能會出現假陽性(如探針保存不當而部分降解）和假陰性結果(對于低拷貝數時）。并且在分析外源基因拷貝數時必須依賴于標準曲線和已知拷貝數的基因，而標準曲線的制備容易受各種因素的影響，故此法對診斷標準的統一性仍值得商権。因此，亟待開發新型、有效的結核病診斷方法，特別是亟需開發結核早期診斷試劑、和嬰幼肺結核和肺內外結核診斷新方法。[0004]微滴數字PCR(化opletdigitalPCR，ddPCR)是近年來興起的一種新的核酸絕對定量技術，又稱為第Ξ代PCR技術。ddPCR技術通過將微量樣品極度稀釋實現理論上的單分子擴增。與qPCR相比，ddPCR不需要通過CT值來計算目的基因的拷貝數，所W擴增效率并不會對結果產生影響。通過相應儀器對反應結果進行測量后，可W直接通過計數的方法或者使用泊松分布的統計學方法來得到樣本的具體濃度。該技術的提出僅僅只有十幾年的光景，但是它的進步與發展卻相當迅速。ddPCR兼具qPCR方法的優點，其相對qPCR具有更高的靈敏度和更多元分析的能力，為臨床診斷提供獨特的分析優勢，并且也不需要標準曲線的制備。ddPCR已經報道用于拷貝數很低的石蠟包埋肝組織中皿V化邱atitisBVirus,皿V)的檢測化uangJT，LiuYJ，Wan邑J，XuZG，Yan邑Y，aienF，LiuXH，ZhouX，LiuSM.NextgenerationdigitalPCRmeasurementofhepatitisBviruscopynumberinformalin-fixedparaffin-embeddedhepatocellularcarcinomatissue[J].ClinChem，2015，61(1):290-296.)。目前，ddPCR已被用于病毒的分析及腫瘤分子標志物稀有突變的檢測，與疾病相關的基因拷貝數變異檢測W及其他病原微生物的檢測RNA和基因表達分析等，對HIV感染者體內HIV病毒DNA低拷貝檢測靈敏度也有針對性報道(PersaudD，GayH,ZiemniakC,ChenYH,PiatakMJ,ChunTW,StrainM,RichmanD,LuzuriagaK.AbsenceofdetectableHlV-lviremiaaftertreatmentcessationinaninfant[J].NEnglJMed,2013,369(19):1828-1835.)。因此，ddPCR在復雜的異質樣品中的稀有序列檢測方面具有明顯的技術優勢，能夠完成很多qPCR無法完成的檢測任務。【
發明內容】[0005]本發明的目的是提供一種檢測結核分枝桿菌的微滴數字PCR絕對定量檢測試劑盒，用于結核分枝桿菌的高靈敏度、高特異性、快速、定量精確檢測。[0006]本發明的第一個技術目的是提供用于檢測結核分枝桿菌的特異性引物和探針，其核巧酸序列分別為：[0007]Rvl768-F:5'CGGCAACAGATTTGGCGAACA3'（SeqIDNo:2);[0008]Rvl768-R:5'CGCTCCGAACAACGCGGCTAT3'（SeqIDNo:3);[0009]Rvl768-P:5'-FAM-TTAGTGCAGCCAACGCGGCCGCG-BQl-3'(SeqIDNo:4)；[0010]本發明提供了上述特異性引物和探針組合在制備結核分枝桿菌檢測試劑盒或檢測試劑中的應用。[0011]本發明提供了一種含有上述特異性引物和探針組合的試劑盒。所述試劑盒優選為微滴數字PCR絕對定量檢測試劑盒。[0012]本發明的另一個技術目的在于提供一種具有檢測結核分枝桿菌的微滴數字PCR絕對定量檢測試劑盒，其中包含一對特異性引物和1條探針，其核巧酸序列分別為：[0013]Rvl768-F:5'CGGCAACAGATTTGGCGAACA3'（SeqIDNo:2);[0014]Rvl768-R:5'CGCTCCGAACAACGCGGCTAT3'（SeqIDNo:3);[0015]Rvl768-P:5'-FAM-TTAGTGCAGCCAACGCGGCCGCG-BQl-3'(SeqIDNo:4)；[0016]還包含2XddPCR?SuperMixforProbes,微滴發生油，陰性對照和陽性對照。[0017]20yL微滴數字PCR反應體系為:RV1768-F和RV1768-R各，化L，引物的原始濃度為10μΜ，Κν1768-Ρ化L，探針原始濃度為350nmol/L，2XddPCR?SuperMixforProbeslOyL，滅菌超純水化L[0018]所述陽性對照為重組質粒祀T-28a(+)-RV1768,陰性對照為滅菌超純水；[0019]加入30ngAiL樣本全血DNA化L。[0020]本發明的試劑盒的工作程序為：[0021](1)配制20μΙddPCR反應體系；[0022](2)制備微滴，然后將微滴轉入PC財反，于PCR儀中進行擴增；[0023](3)將完成PCR擴增的PC財反放入微滴分析儀中，檢測微滴，分析數據，顯示檢測結果。[0024]在本發明的一個實施例中，制備微滴的方法是采用Bio-Rad公司的QX100?微滴式數字PCR儀的微滴生成器，按照說明書操作進行微滴制備即可。[0025]其中步驟(2)中PCR的擴增程序為95°C，10min預變性;94°C變性30s，60°C退火60s，共45個循環，擴增結束后進行98°C、10min的熱變性。[0026]本發明提供的試劑盒在結核分枝桿菌檢測和預防中的應用也屬于本發明的保護范圍。[0027]為實現上述目的，本發明通過如下方案實現：[00%]通過分子克隆技術將RV1768基因構建至祀T28a的原核表達載體中，采用實時巧光定量PCR技術和ddPCR技術分別對祀T28a-Rvl768重組質粒作出標準曲線，W確定ddPCR技術的靈敏度，通過查閱文獻和引物BLAST確定其特異性。[0029]分別收集6例活動性肺結核病人與W及6例健康人，分別采用實時巧光定量PCR技術和ddPCR技術對上述樣本全血DNA進行檢測，并探討ddPCR技術的檢測效果是否具有統計學意義。[0030]本發明首次通過對毒性結核分枝桿菌特有的，而其他細菌和人體不具有的目的基因Rvl768進行克隆構建，制備出祀T-28a-Rvl768的重組表達質粒，并W此確定針對Rvl768基因進行微滴數字PCR的靈敏度(RV1768重組質粒濃度稀釋達到1.2copiesAiL時仍保持著正相關性)和特異性，通過平行比較檢測樣品，發現ddPCR技術相對于qPCR技術具有更高的靈敏度與特異度，對復雜背景的DNA樣本能有較好的分辨率。ddPCR技術能準確測量結核病人全血中結核分枝桿菌特異基因RV1768基因的拷貝數，對結核病的輔助診斷提供極大的幫助。【附圖說明】[00川圖1為分別設置了56°C、60°C、64°C、68°C、72°C運5個溫度進行梯度PCR反應的反應產物示意圖；[0032]圖1A顯示的是反應產物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖1B顯示的是電泳圖的灰度燒描強度柱狀圖；[0033]圖2為不同終末濃度的巧光探針進行巧光定量PCR反應的巧光強度變化趨勢圖；[0034]圖3為比較實時巧光定量PCR與ddPCR技術的靈敏度；[0035]圖4為實時巧光定量PCR法和ddPCR法分別檢測活動性肺結核病人血液樣本中結核特異基因RV1768的含量；【具體實施方式】[0036]通過W下詳細說明結合附圖可W進一步理解本發明的特點和優點。所提供的實施例僅是對本發明方法的說明，而不W任何方式限制本發明掲示的其余內容。[0037]【實施例1】最佳退火溫度的確定[0038]針對結核分枝桿菌Rvl768基因長1857bp片段，其序列如SeqIDNo:l所示，制備出pET-28a-Rvl768的重組表達質粒，利用軟件設計引物，得到最優化的引物，產物長度為131bp(從Rvl768基因41bp至171bp)，引物由上海英驗公司合成，尸：5'-CGGCAACAGATTTGGCGAACA-3'；R:5'-CGCTCCGAACAACGCGGCTAT-3'。W上引物分別W重組質粒祀T-28a(+)-RV1768為模板，進行退火溫度的梯度PCR。反應體系和反應條件如下：[0039][0040]在TaqDNA聚合酶的作用下，95°C預變性5min;再95°C變性2〇3,55~72°(：退火2〇3，72°C延伸30s，共30個循環;最后72°C延伸5min。[OOW分別設置了56°(：、60°(：、64°(：、68°(：、72°(：運5個溫度進行梯度?0?反應。結果顯示在退火溫度為60°C時，引物的擴增效率最高。[0042]【實施例2】化qman探針最佳反應濃度的優化[0043]探針由上海英驗公司合成，探針:5'-FAM-TTAGTGCAGCCAACGCGGCCGCG-BQ1-3'[0044]反應體系和反應條件如下：[0045][0046]設置探針濃度每管分別為100、150、200、250、300、350、400和450皿〇1/1，加入10化2XTaqMan愈GeneExpressionMasterMix，pET-28a(+)-RV1768模板2μΙ，用超純水補足至20化，然后進行qPCR擴增。擴增條件確定化95°C，5min預變性;95°C，15s;60°C，30s，40個循環，在退火步驟中采集巧光信號。結果顯示當探針濃度達到350皿ol/L時，巧光強度不再隨濃度的升高而升高。如圖2所示。[0047]【實施例3】繪制重組質粒的標準曲線[004引將重組質粒pET-28a(+)-RV1768進行梯度倍比稀釋：109、108、107、106、105、104、103、102、10和lcopies/化，各取W上倍比稀釋的重組質粒DNA化L分別用于qPCR和ddPCR，并將結果繪制出標準曲線。[00例qPCR標準曲線的繪制:[0050]反應體系和反應條件如下：[0化1][0052]qPCR反應總體系為20化，反應探針終濃度為300皿ol/LeqPCR使用2步擴增法，程序如下:94°C，5min預變性;94°C變性15s，60°C退火60s，共40個循環，在退火步驟中采集巧光信號。每個模板重復3個平行擴增，重復3輪實驗。擴增結束后使用StepOnePlus自帶軟件進行分析實驗數據，并通過計算獲得qPC財示準曲線，R2值W及擴增效率。[005引ddPCR標準曲線的繪制:[0054]反應體系和反應條件如下：[0化5][0化6][0化7]ddPCR反應總體系為20yL，反應探針終濃度為300皿ol/L。將配制好的20化PCR反應液，轉移至微滴發生卡（DG8ca;rt;ridge)孔中，再加入70化微滴發生油（dropletgenerationoil)至oU孔中，利用QX100?微滴式數字PCR儀的微滴生成器制備反應微滴。將每個樣品的微滴分別轉移至96孔PCR反應板中對應的反應孔中，用侶膜熱封（18(rC，5sec)后，于普通PCR儀上進行擴增，本實驗的PCR擴增是在Bio-RadS1000PCR儀上完成的。ddPCR擴增使用3步法，設置程序如下：95°C，lOmin預變性;94°C變性30s，60°C退火60s，共45個循環，擴增結束后進行98°C、10min的熱變性。將PCR擴增后的96孔板放入QXlOO?微滴式數字PCR儀的微滴分析器中，檢測FAM的巧光信號，96個樣品檢測用時約化，儀器會自動分析樣品的各微滴巧光信號，然后由如an化Soft1.7.4完成對數據的自動處理。[0058]圖3圓點標注曲線為使用實時巧光定量PCR技術繪制的標準曲線，方形點標注曲線為使用ddPCR技術繪制的標準曲線。結果顯示:使用實時巧光定量PCR法檢測時，當重組質粒濃度達到102copiesAiLW下時已偏離標準曲線，說明實時巧光定量PCR最低檢測濃度是102copiesAiL。使用ddPCR法檢測時，當RV1768重組質粒濃度稀釋達到1.2copiesAiL時仍保持著正相關性，說明ddPCR最低檢測濃度是1.2copiesAiLW下因而其靈敏度遠高于qPCR的最低檢測濃度（102copiesAiL)。[0059]【實施例4】對臨床樣本的檢測[0060]收集6例肺結核病人W及6例健康人，分別采用實時巧光定量PCR技術和ddPCR技術對上述樣本全血DNA進行檢測，并探討ddPCR技術的檢測效果是否具有統計學意義。[0061]1、全血樣本的總DNA的提取[0062]全血樣本DNA采用AXYGEN公司全血DNA提取試劑盒提取，具體步驟如下所述：[0063]1)吸取30化蛋白酶K溶液于高壓滅菌的EP管中。[0064]2)加入200化的全血。[0(?日]3)加入20化L的Buffer化于滿旋震蕩上震蕩30s。[0066]4)70°C干浴鍋中干浴20min，中途需拿出滿旋震蕩3次W上。[0067]5)加入200yL無水乙醇滿旋震蕩15s。[0068]6)將上述溶液放入吸附柱中，10000巧m離屯、2min。[0069]7)加入BufferW1B溶液400化洗兩次。[0070]8)加入BufferW2溶液600化洗兩次。[0071]9)空轉一次后，待酒精揮發完畢加入80~11化L無菌水洗脫。[0072]10)每份樣本采用紫外分光光度計測量其濃度，最后使用無菌雙蒸水調節其濃度一致，備用。[0073]2、qPCR法對樣本的檢測[0074]應用全血DNA提取試劑盒提取待測樣本的全血DNA，經由紫外分光光度計測量0D260/0D280和瓊脂糖凝膠進行質量鑒定。[0075]反應體系和反應條件如下：[0076][0077][0078]qPCR反應總體系為20化，反應探針終濃度為350皿oI/LdqPCR使用2步擴增法，程序如下:94°C，5min預變性;94°C變性15s，60°C退火60s，共40個循環，在退火步驟中采集巧光信號。每個模板重復3個平行擴增，重復3輪實驗。擴增結束后使用StepOnePlus自帶軟件獲得實驗數據。[00巧]3、ddPCR法對樣本的檢測[0080]應用全血DNA提取試劑盒提取待測樣本的全血DNA，經由紫外分光光度計測量0D260/0D280和瓊脂糖凝膠進行質量鑒定。[0081]反應體系和反應條件如下：[0082][0083]ddPCR反應總體系為20yL，反應探針終濃度為350皿ol/L。將配制好的20化PCR反應液，轉移至微滴發生卡（DG8ca;rt;ridge)孔中，再加入70化微滴發生油（dropletgenerationoil)至oU孔中，利用QX100?微滴式數字PCR儀的微滴生成器制備反應微滴。將每個樣品的微滴分別轉移至96孔PCR反應板中對應的反應孔中，用侶膜熱封（18(rC，5sec)后，于Bio-RadS1000PCR儀上完成擴增。ddPCR擴增使用3步法，設置程序如下：95°C，lOmin預變性;94°C變性30s，60°C退火60s，共45個循環，擴增結束后進行98°C、10min的熱變性。將PCR擴增后的96孔板放入QX100?微滴式數字PCR儀的微滴分析器中，檢測FAM的巧光信號，96個樣品檢測用時約化，儀器會自動分析樣品的各微滴巧光信號，然后由如antaSoftl.7.4完成對數據的自動處理。[0084]結果如圖4A所示，實時巧光定量PCR檢測RV1768基因在活動性肺結核病人血液樣本的含量，結果顯示差異無統計學意義(P>〇.〇5);ddPCR檢測RV1768基因在活動性肺結核病人血液樣本的含量，如圖4B結果顯示差異有顯著的統計學意義(p<0.0001)。【主權項】1.一種用于檢測結核分枝桿菌RV1768的特異性引物和探針組合，其特征在于，核苷酸序列分別為：Rvl768-F:5'CGGCAACAGATTTGGCGAACA3'（SeqIDNo:2);Rvl768-R:5'CGCTCCGAACAACGCGGCTAT3'（SeqIDNo:3);Rvl768-P:5'-FAM-TTAGTGCAGCCAACGCGGCCGCG-BQl-3'（SeqIDNo:4)。2.-種含有權利要求1所述的特異性引物和探針組合的結核分枝桿菌檢測試劑盒。3.如權利要求2所述的試劑盒，其為微滴數字PCR絕對定量檢測試劑盒。4.如權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，包含一對特異性引物和1條探針，其核苷酸序列分別為：Rvl768-F:5'CGGCAACAGATTTGGCGAACA3'（SeqIDNo:2);Rvl768-R:5'CGCTCCGAACAACGCGGCTAT3'（SeqIDNo:3);Rvl768-P:5'-FAM-TTAGTGCAGCCAACGCGGCCGCG-BQl-3'（SeqIDNo:4);還包含2XddPCR?SuperMixforProbes，微滴發生油，陰性對照和陽性對照；20yL微滴數字PCR反應體系為:Rvl768-F和Rvl768-R各，2yL，引物的原始濃度為ΙΟμΜ，Rvl768_PlyL，探針原始濃度為350nmol/L，2XddPCR?SuperMixforProbes10yL，滅菌超純水3yL;所述陽性對照為重組質粒pET-28a(+)-RV1768，陰性對照為滅菌超純水；加入30ng/yL樣本全血DNA2yL。5.權利要求1-4任一所述的試劑盒在在結核分枝桿菌檢測和預防中的應用。【文檔編號】C12Q1/68GK106011296SQ201610621187【公開日】2016年10月12日【申請日】2016年8月1日【發明人】章曉聯,譚楊,宋能【申請人】武漢大學