一種結核分枝桿菌erp 12基序突變為pglts的重組質粒pegfp-12的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物工程技術領域，涉及一種結核分枝桿菌ERP 12基序突變為PGLTS 的重組質粒PEGFP-12。
【背景技術】
[0002] 牛結核病是一種慢性消耗性傳染病，影響動物的奶、肉以及家畜產品的產出，造成 了嚴重的經濟損失。結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis)是引起牛結核病的主 要致病菌，其致病性與細菌在組織細胞內大量繁殖引起的炎癥、菌體成分和代謝物質的毒 性以及機體對菌體成分產生的免疫損傷有關。
[0003] Erp (exported repeated protein)，也稱為 P36, Pirg 或 Rv3810,是結核分枝桿菌 的一種重要毒力因子，erp存在于結核分枝桿菌復合體所有成員（結核分枝桿菌、牛型結核 分枝桿菌、非洲分枝桿菌、卡介苗和田鼠分枝桿菌）中，也存在于麻風病致病菌麻風分枝桿 菌，但是后來的研宄證明，在恥垢分枝桿菌和機會性致病結核分枝桿菌（鳥型分枝桿菌、海 分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌和潰瘍分枝桿菌）中也檢測到了該基因的表達。而在其它的細菌 種內沒有發現同族體，使得Erp成為結核分枝桿菌家族的一個特異信號分子。
[0004] erp全長284個氨基酸，由三個不同的區域組成，N-末端（1-80AA)包含22個氨基 酸的信號肽，引導蛋白質在細胞內的運輸；中心是基于PGLTS基序的12個重復區，其中前3 個基序嚴格保守；C-末端（176-284AA)包含富含脯氨酸和丙氨酸的疏水性區域。中間重復 區具有一定的可變性，其主要體現在兩方面。首先，重復區的絕對數是可變的，如麻風分枝 桿菌的PGLTS重復區是4、結核分枝桿菌是12、而恥垢分枝桿菌是21。其次，PGLTS重復區 的序列是可變的。在一些種間，如恥垢分枝桿菌和蟾蜍分枝桿菌有一半的重復區是錯配的。 Erp蛋白的N-端、中間重復序列以及C-末端對于蛋白質的功能有很重要的作用，但是具體 的分子機制尚屬未知，特別是中間的重復序列的PGLTS的保守性與功能的關系目前尚未研 宄。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于克服現有技術中存在的缺陷，提供一種結核分枝桿菌ERP 12 基序突變為PGLTS的重組質粒PEGFP-12,首先合成了中間重復序列完全突變為PGLTS保守 序列，并構建其真核表達載體PEGFP-12,并將該載體與ERP野生型載體PEGFP-ERP分別轉染 人肺泡上皮II型細胞一一A549,之后通過蛋白芯片檢測轉染后細胞相關因子的變化，為研 宄PGLTS基序突變與功能關系提供有力數據。
[0006] 其具體技術方案為：
[0007] -種結核分枝桿菌ERP 12基序突變為PGLTS的重組質粒PEGFP-12,根據結核分 枝桿菌野生型ERP的序列，合成出12基序完全突變為PGLTS的ERP完整序列，并進行人源 化優化，構建到PEGFP-Nl真核生物表達載體上，并命名為PEGFP-12。突變后的序列如SEQ : ID :N0 :1 所示。
[0008] 與現有技術相比，本發明的有益效果為：
[0009] 本發明將該載體轉化到大腸桿菌中大提質粒，將質粒用脂質體轉染法轉到A549 細胞中，然后做蛋白芯片檢測，看轉染后與野生型相比，細胞因子變化情況，為研宄PGLTS 基序突變與功能關系提供有力數據。本發明構建了結核分枝桿菌ERP的12基序突變為 PGLTS的基因重組質粒，將質粒用脂質體轉染法轉到A549細胞中，然后做蛋白芯片檢測，并 與野生型ERP序列相比較，發現基序完全突變為12個PGLTS之后引起細胞細胞炎性相關因 子表達明顯上調，說明突變后能夠引起更明顯的炎性反應，為研宄PGLTS基序突變與功能 關系提供有力數據。
【附圖說明】
[0010] 圖 1 是轉染 pEGFP-Erp-1224hA549 細胞（200X);
[0011] 圖 2 是轉染 pEGFP-Erp-1224hA549 細胞（200 X)。
【具體實施方式】
[0012] 下面結合附圖和具體實施例對本發明的技術方案作進一步詳細地說明。
[0013] 由上金斯瑞生物科技公司合成出12基序完全突變為PGLTS的ERP完整序列，并進 行人源化優化，構建到PEGFP-Nl真核生物表達載體上，克隆位點為Hindlll/PstI，并命名 為PEGFP-12。突變后的序列如SEQ :ID :NO :1所示。
[0014] 將該載體轉化到大腸桿菌中大提質粒，將質粒用脂質體轉染法轉到A549細胞中， 然后做蛋白芯片檢測，看轉染后與野生型相比，細胞因子變化情況，為研宄PGLTS基序突變 與功能關系提供有力數據。
[0015] PEGFP-12與PEGFP-ERP重組質粒分別轉染A549細胞如圖1、圖2所示。將重組質 粒轉化到大腸桿菌DH5 α中進行擴增，提取重組質粒PEGFP-Erp-12與pEGFP-Nl空載體分 別轉染到A549細胞株中，利用熒光顯微鏡觀察，證實了 Erp基因在A549中成功表達，轉染 效率達到了 80%。
[0016] PET28a-GFP-12與PET28A-GFP-ERP重組質粒分別轉染A549細胞，后通過蛋白芯 片檢測細胞因子的變化的數據比較如表1所示：表1為PET28a-GFP-12與PET28A-GFP-ERP 重組質粒轉染A549細胞，通過蛋白芯片檢測細胞因子的表達量。
[0017] 表 1
[0018]
【主權項】
1. 一種結核分枝桿菌ERP 12基序突變為PGLTS的重組質粒PEGFP-12,其特征在于， 根據結核分枝桿菌野生型ERP的序列，合成出12基序完全突變為PGLTS的ERP完整序 列，并進行人源化優化，構建到PEGFP-Nl真核生物表達載體上，并命名為PEGFP-12,突變后 的序列如SEQ :ID :N0 :1所示。
【專利摘要】本發明公開了一種結核分枝桿菌ERP 12基序突變為PGLTS的重組質粒PEGFP-12，根據結核分枝桿菌野生型ERP的序列，合成出12基序完全突變為PGLTS的ERP完整序列，并進行人源化優化，構建到PEGFP-N1真核生物表達載體上，并命名為PEGFP-12。突變后的序列如SEQ：ID：NO：1所示。本發明構建了結核分枝桿菌ERP的12基序突變為PGLTS的基因重組質粒，將質粒用脂質體轉染法轉到A549細胞中，然后做蛋白芯片檢測，并與野生型ERP序列相比較，發現基序完全突變為12個PGLTS之后引起細胞炎性相關因子表達明顯上調，說明突變后能夠引起更明顯的炎性反應，為研究PGLTS基序突變與功能關系提供有力數據。
【IPC分類】C12N15-85
【公開號】CN104862334
【申請號】CN201510309809
【發明人】王玉炯, 李敏, 郝秀靜, 何玉龍, 馬臣杰
【申請人】寧夏大學
【公開日】2015年8月26日
【申請日】2015年6月3日