一種結核分枝桿菌分泌蛋白的泛素結合結構域的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種結核分枝桿菌分泌蛋白的泛素結合結構域，屬于細胞生物學領 域。
【背景技術】
[0002] 結核病（Tuberculosis, TB)是由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis)引 起的古老疾病，它與艾滋病、瘧疾并稱為當今世界威脅人類健康的三大傳染病。研究表明 結核分枝桿菌基因組共編碼11種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Serine/threonine protein kinase，STPK)和兩種真核樣酪氨酸磷酸酶（PtpA和PtpB)，它們在結核分枝桿菌感染宿主 巨噬細胞的過程中可被分泌至宿主細胞的胞質中，這些蛋白分別與宿主細胞中不同的蛋白 分子相互作用，并且通過調控宿主細胞中各個靶蛋白的磷酸化水平來達到干擾真核生物信 號通路的目的。這些病原菌-宿主互作蛋白及其相關的炎癥和免疫信號通路將可能為抗結 核新藥設計提供全新的理想靶點。
[0003] 結核分枝桿菌在宿主細胞內分泌的PtpA蛋白屬于低分子量酪氨酸磷酸酯酶家 族，也叫做LowMWPTPs。研究表明：PtpA蛋白與真核細胞中的酪氨酸磷酸酯酶有很強的相似 性，它在病原宿主互作過程中起著重要的作用，參與調控多種重要的生理病理過程，并且已 發現PtpA蛋白與宿主中兩個蛋白分子(包括自噬相關蛋白VPS33B和V-ATPase復合體的H 亞基)存在相互作用，從而干擾宿主細胞的自噬過程以及對結核分枝桿菌的清除作用。但目 ill有關PtpA蛋白對細胞信號通路等方面的影響尚未明確。
[0004] 促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAP激酶，MAPK) 級聯反應通路是真核生物信號傳遞網絡中的重要途徑之一，在基因表達調控和細胞質功能 活動中發揮關鍵作用。JNK和P38信號轉導通路是MPK通路的兩個重要分支，它們在細胞 增殖、細胞分化、細胞凋亡和細胞應激等多種生理和病理過程中起重要作用，而JNK和P38 蛋白激酶分別是兩個信號通路的中的關鍵調控因子。當外界有細胞因子（TNFa，IL-1)、生 長因子（EGF)、特定抗原，以及紫外線和放射線等存在時，JNK和P38蛋白就會接受上游信 號分別被磷酸化活化成P-JNK和P-P38,并且進一步磷酸化激活下游蛋白，進而激活信號通 路，調控目的基因的轉錄水平。我們之前的研究確定了可以抑制JNK和P38兩條信號通路 的結核分枝桿菌分泌蛋白PtpA，并發現泛素分子可以顯著提高PtpA的酶活性。
[0005] 本發明旨在進一步揭示泛素調控PtpA的磷酸酶活性的分子機制及其調控序列及 關鍵的調控位點，進而特異地調控PtpA酶活性及結核分枝桿菌的胞內存活。

【發明內容】

[0006] 本發明要解決的技術問題是提供一種結核分枝桿菌分泌蛋白的泛素結合結構域 (Ubiquitin-interacting motif-like, UIML 結構域)，其氨基酸序列如（a)或（b)或（c):
[0007] (a) SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列；
[0008] (b )在（a )中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個氨基酸或幾個氨基酸且具有 泛素結合結構域功能的由（a)衍生的多肽或其類似物；
[0009] (C)與（a)、（b)中氨基酸序列整體相似度在85%以上的由（a)衍生的多肽或其類 似物。
[0010] 所述結核分枝桿菌分泌蛋白是PtpA蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。所 述結核分枝桿菌分泌蛋白PtpA可抑制JNK和P38兩條信號通路，泛素與PtpA通過WML結 構域直接結合后顯著提高PtpA的磷酸酯酶活性。
[0011] 所述泛素結合結構域是一種新的類似于真核細胞蛋白的UIM結構域的類ΠΜ泛素 結合結構域，是從PtpA蛋白的第115位氨基酸到第161位氨基酸，其中，疏水氨基酸序列 EEVFAVIESA (136-145)能夠與泛素發生疏水相互作用。
[0012] 所述WML結構域的A26位點（即PtpA分子的A140位點）是可改變結核分枝桿菌 分泌蛋白與泛素分子結合能力的關鍵位點，該特異位點的突變（A140E)可導致Ub與PtpA結 合能力及其酶活調控功能的喪失。
[0013] 所述WML結構域及其關鍵位點可用于制備抗結核藥物和新型疫苗，還可用于制 備調控JNK和P38的磷酸化水平的藥物。
[0014] 本發明要解決的第二個技術問題是提供所述WML結構域蛋白的制備方法，是將 HML結構域基因連接到載體pGEX-6P-l，得到重組質粒pGEX-6P-1-PtpA-UML ;將重組質粒 轉化到大腸桿菌BL21中，用IPTG在30°C條件下誘導蛋白表達；超聲破菌、高速離心后收取 上清液；將上清液緩緩流過填充好的Glutathione-Sepharose beads中，然后加入柱洗漆緩 沖液充分洗滌柱子，最后加入2-3ml洗脫液洗脫蛋白；將收集的洗脫液加入到IOKD的蛋白 濃縮管中，3500rpm離心濃縮20分鐘；再在蛋白濃縮管中加入2mlPBS混勻后離心，分裝蛋 白，-80°C保存待用。
[0015] 本發明成果揭標了宿主泛素分子被結核分枝桿菌分泌蛋白PtpA分子所利用而提 高后者酶活的分子機制及其特異性結合序列及關鍵位點。本發明為基于PtpA分子的抗結 核藥物篩選和疫苗開發提供了特異性靶序列，基于該特性靶序列的抗結核新藥和新型疫苗 將有望提高抗結核治療的有效性和特異性并進而降低抗結核藥物的毒副作用。此外，由于 臨床上多種疾病的發生都與JNK和P38信號通路的活性相關，調控JNK和P38的磷酸化水 平對于很多疾病都有控制作用。因此本發明成果將來還可為臨床多種疾病的治療提供新的 工具和思路，尤其在抗腫瘤等多種藥物的開發和臨床應用等方面將有著廣闊的前景，也可 以直接應用于科研領域或指導開發可逆性調控JNK和P38信號通路的制劑。
【附圖說明】
[0016] 圖I =PtpA蛋白序列及晶體結構的解析。
[0017] 圖2 :結核分枝桿菌分泌蛋白PtpAUML與宿主的Ub分子直接相互作用。
[0018] 圖3 :PtpA的A140E突變對泛素對PtpA磷酸酯酶活性調控能力的影響。
[0019] 圖4 :PtpA的A140E突變導致泛素喪失對其介導的去磷酸化p-JNK和p-P38的活 性調控功能。
【具體實施方式】
[0020] 結核分枝桿菌分泌蛋白PtpA的制備方法、泛素蛋白的制備方法，以及泛素對 PtpA去磷酸化p-JNK和p-P38蛋白的影響、體外實驗反應體系等參見中國發明專利申請 201310466907. 2 (-種使p-JNK和p-P38去磷酸化的結核分枝桿菌分泌蛋白PtpA)。