偶發分枝桿菌在發酵生產表博醇中的應用
【專利摘要】本發明公開了一株偶發分枝桿菌(Mycobacterium fortuitum)突變株，該菌株能夠一步發酵生產表博醇，其保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號是CGMCC 9725。表博醇是合成黃體酮、角鯊胺等藥品的重要中間體，采用本發明保藏號為CGMCC 9725的偶發分枝桿菌可將植物甾醇降解生產表博醇，并可將表博醇排出胞外大量積累，底物投料量濃度為2.5％，重量收率可達37～43％，純度高達96.7％，且雜質量較少，生產成本較低，能夠滿足工業化生產需求。CGMCC No972520140925
【專利說明】
偶發分枝桿菌在發酵生產表博醇中的應用
技術領域：
[0002] 本發明涉及一株生產留體激素的偶發分枝桿菌菌株，相關液體菌劑及其在生產表 博醇中的應用，具體地說，本發明涉及一株發酵生產表博醇的偶發分枝桿菌菌株，含有菌株 的菌劑及在生產表博醇中的應用。
【背景技術】：
[0004] 表博醇作為一種留醇降解物，是合成黃體酮、角鯊胺等留體藥品的重要中間體，角 鯊胺是存在于鯊魚組織中的氨基留醇，可從多刺的角鯊魚，海綠角鯊的胃中分泌物中分離 得到，具有廣譜抗菌作用和抗血管生成效應，近年來，研究人員發現這種物質還具有良好的 抗癌功效，由于從角鯊以及相關魚類提取成本高，得率低，并難以產業化，近年來，研究人員 一直在探索一條大規模高效生產角鯊胺的技術路線，而本發明的發酵產物表博醇是合成角 鯊胺的重要中間體，此外，黃體酮也是一種重要的天然孕激素，其規模化生產也需要大量的 表博醇，因此，研究人員迫切需要尋找大規模低成本生產表博醇的工藝途徑和相關菌株。
[0005] 早在1972年，Marsheck et al利用留醇經微生物降解能夠生成表博醇，但表博醇 的收率僅20~40mg/L，沒有進行大規模工業生產的價值。對于表博醇的發酵工藝研究主要 集中在20世紀80年代初期，1978年日本研究人員提出了由植物甾醇降解制備1，4表博醇 及表博醇的方法，兩種物質總收率50~60%，其中以1，4表博醇為主，約占總重的95%以 上，且底物投料濃度僅0. 5%~0. 8%，同樣難以滿足表博醇大規模產業化生產的需要。
[0006] 此后陸續有研究報道在留醇降解制備雄烯二酮（4AD)的過程均發現有表博醇的 產生，但均未以表博醇為目的產物展開詳細的大規模生產相關研究。綜上所述，無論從發酵 工藝，還是產物收率和純度，目前已經公開的方法都不適合大規模的工業化生產。
[0007] 發明技術內容：
[0008] 本發明的第一個目的是提供一株偶發分枝桿菌突變株，使用該突變株，可將植物 甾醇轉化為表博醇，且該突變株能有效抑制表博醇留核1，2位脫氫，以及17位碳側鏈羥甲 基的降解，使表博醇得以累積并分泌到胞外。
[0009] 本發明的第二個目的是提供一種含有偶發分枝桿菌突變株的液體菌劑。在必要的 時候，該液體菌劑還可以包含菌劑制備常用的載體和輔料。
[0010] 本發明的第三個目的是提供偶發分枝桿菌突變株及其菌劑在發酵生產表博醇中 的應用。
[0011] 本發明的第四個目的是提供發酵生產表博醇的方法。
[0012] 本發明公開了 一株偶發分枝桿菌（Mycobacterium fortuitum)突變株 SZ-BBC-101，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號是CGMCC 9725,保藏日期是2014年9月25日。中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心簡 稱CGMCC，位于北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所。
[0013] 本發明中公開的偶發分枝桿菌（Mycobacterium fortuitum)突變株SZ-BBC-101, CGMCC 9725通過如下方式選育獲得：
[0014] 菌種分離：菌種的分離基物是存放植物留醇庫房附近的土壤，使用固體培養基劃 線，31°C培養，觀察菌落形態，挑選單菌落表面粗糙，邊緣不規則，顏色為灰白色或淡黃色， 顯微鏡微觀為短桿狀進行再培養，使用液體培養基在31°C，150rpm培養。
[0015] 菌種誘導：當菌體密度生長至10s個/ml，離心收集菌體，用檸檬酸鈉溶液洗菌，并 用檸檬酸鈉溶液將菌體稀釋到原體積，并加入亞硝基胍，制成菌懸液，菌懸液37°C水浴30 分鐘，再次離心，菌體用磷酸緩沖液沖洗，并重新在磷酸緩沖液中懸浮分散。
[0017] 菌株生長篩選：將誘變后的菌懸液進行稀釋涂布至初篩固體培養基上，于31°C培 養7天，挑取單菌落接種到復篩固體培養基中，凡在復篩培養基中不能生長的菌體，用初篩 培養基進行進一步的純化培養，得到誘變后的菌株。
[0017] 菌株轉化篩選：將誘變后的菌株接種到液體培養基上，31°C，150rpm培養48小時， 再接種到轉化培養基中，接種量10%，在31°C，200rpm，轉化72小時，取樣送液相檢測，根據 液相結果確定誘變后菌株轉化生成表博醇能力的優略。
[0018] 經過以上誘變篩選工作，得到一株優良的變異菌株，并命名為偶發分枝桿菌 (Mycobacterium fortuitum)突變株SZ-BBC-101，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心，保藏編號是CGMCC 9725,保藏日期是2014年9月25日。中國微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中心簡稱CGMCC，位于北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科 學院微生物研究所。
[0019] 偶發分枝桿菌突變株SZ-BBC-101，CGMCC 9725有如下形態學特征：在不同生長環 境下，菌體形態呈現差別，但基本上均為短桿狀，菌落表面粗糙，邊緣不規則，顏色為灰白色 或淡黃色，菌體尺寸較一般細菌小，長約〇. 6~1. 0微米，寬0. 3~0. 4微米。可將植物甾 醇降解轉化為表博醇，并在胞外大量積累，重量收率可達37~43%，達到工業化生產標準。
[0020] 本發明的發酵反應如附圖1所示。
[0021] 本發明還公開了含有偶發分枝桿菌突變株SZ-BBC-101，CGMCC 9725的液體菌劑， 按重量計，該菌劑含菌體生物量是1 %~1. 5%，余量為培養過CGMCC 9725的液體培養基。
[0022] 本發明還公開了制備偶發分枝桿菌突變株及其液體菌劑的方法。生產液體菌劑的 方法包括下列步驟：
[0023] A斜面種子培養：將CGMCC 9725接種于固體培養基上，30-32°C培養；
[0024] B液體種子培養：從A項培養的固體斜面上刮取菌體，接種到液體培養基中， 150rpm，30-32 °C 培養；
[0025] C計數：按重量計，含菌體生物量是1 %~1. 5%，余量為培養過CGMCC 9725的液 體培養基，得液體菌劑；
[0026] 其中，固體培養基組分是：胰蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，葡萄糖12g/L，牛肉膏 〇. 5g/L，磷酸氫二鉀0. 5g/L，瓊脂1.5% -2. 0%，余量為水。
[0027] 液體培養基組分是：胰蛋白胨5g/L，酵母膏0. 5g/L，葡萄糖6g/L，牛肉膏10g/L，磷 酸氫二鉀2g/L，玉米漿54g/L，余量為水。
[0028] 本發明還公開了偶發分枝桿菌突變株及其菌劑在發酵生產表博醇中的應用。
[0029] 本發明還公開了生產表博醇的方法，該方法包括下列步驟：
[0030] ①發酵培養：將含有偶發分枝桿菌液體菌劑接種到轉化培養基中培養，接種量為 10%~15%，轉化溫度為30-321：，發酵培養的轉速為200-400印111，空氣流量為30-3517 min，罐壓為（λ 045±0· 055MPa ;
[0031] ②分離提取：加熱分層，取油層，乙醇萃取，濃縮離心，正己烷過濾除油，乙醇活性 炭脫色，濃縮，乙醇精制，析晶，干燥得表博醇；
[0032] 其中轉化培養基組分為：玉米漿54g/L，牛肉膏10g/L，胰蛋白胨5g/L，磷酸氫二 鉀2g/L，葡萄糖6g/L，酵母膏0. 5g/L，硫酸銨10g/L，檸檬酸lg/L，吐溫-801g/L，卵磷脂 0· 25g/L，豆油160g/L，植物留醇25g/L，余量為水；
[0033] 在本發明中植物留醇是β -谷留醇，豆留醇，菜油留醇，菜籽留醇，玉米留醇或木 甾醇中的一種或多種。
[0034] 在本發明中，表博醇是合成黃體酮、角鯊胺等藥品的重要中間體。 本發明的有益效果 1. 本發明利用一株突變的偶發分枝桿菌發酵生產表博醇，使用合適的發酵液，接種濃 度和發酵培養條件，顯著提高了偶發分枝桿菌生產表博醇的效率，并縮短的發酵工藝流程， 節約發酵時間，并顯著減少副產物的產生； 2. 本發明采用的偶發分枝桿菌生產表博醇，可將表博醇排出胞外大量積累，由于該突 變株1，2脫氫的活性喪失，因此不再產生1，4表博醇，節約了純化流程，降低了純化成本。 3. 本發明的制備表博醇的方法還具有下面特點： 底物投料量大，重量收率可達37~43 %，獲得的表博醇成品純度高達96. 7 %，且雜質 量較少，生產成本較低，能夠滿足工業化生產的要求，為利用微生物發酵法大規模生產表博 醇提供了新的思路。本發明涉及的突變菌株以及相關發酵方法具有廣闊的產業化應用前 旦
【附圖說明】：
[0036] 圖1是生物發酵反應示意圖。
[0037] Α表示植物甾醇，Β表示表博醇。
[0038] 圖2是表博醇精致成品的高效液相色譜圖。
【具體實施方式】：
[0040] 下面結合具體的實施例來進一步闡述本發明。應當理解，這些實施例僅用于說明 本發明，而不能限制本發明的保護范圍。
[0041] 實施例1.偶發分支桿菌突變株SZ-BBC-101的選育獲得。
[0042] 1. 1菌種分離：在本工廠廠區存放植物留醇的廠房附近的土壤取樣，使用固體培 養基劃線，31°C培養，觀察菌落形態，挑選單菌落表面粗糙，邊緣不規則，顏色為灰白色或淡 黃色，顯微鏡微觀為短桿狀進行再培養，使用液體培養基在31°C，150rpm培養。
[0043] 固體培養基配方及配制方法：胰蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，葡萄糖12g/L，牛肉 膏〇. 5g/L，磷酸氫二鉀0. 5g/L，按實際需要秤取以上物質，加入純化水，攪拌溶解，lmol/L 氫氧化鈉溶液調PH7. 5,加入瓊脂2. 0 %，加熱溶清，如制作斜面，溶清后分裝至試管或茄型 瓶中，121°C滅菌20分鐘，冷卻到70°C擺放斜面或倒平板，冷卻至室溫凝固后，31°C空培養 48小時，無菌落出現則可以使用。
[0044] 液體培養基配方及配制方法：胰蛋白胨5g/L，酵母膏0. 5g/L，葡萄糖6g/L，牛肉膏 l〇g/L，磷酸氫二鉀2g/L，玉米漿54g/L，lmol/L氫氧化鈉溶液調pH7. 0~7. 2,用純化水定 容至1L，121°C滅菌20分鐘。
[0045] 1. 2菌體誘變：當菌體生長密度達到10s個/ml，將液體菌劑涂布于固體培養基 平板上，并于涂布接種后再在固體培養基平板中央及周邊數處均勻點放亞硝基胍小顆粒， 31°C培養7天后，用接種環緊靠各個亞硝基胍抑菌圈外側，將菌苔挑于無菌生理鹽水中制 成菌懸液，用以進行突變株篩選。
[0046] 1. 3突變株篩選：將誘變后的菌懸液進行稀釋涂布，培養基使用初篩培養基，于 31°C培養7天。挑取單菌落接種到復篩培養基中，凡是在復篩培養基中不能生長的菌體，用 初篩培養基進行進一步的純化培養，得到誘變后的菌株。
[0047] 初篩培養基配方及配制方法：葡萄糖10g/L，磷酸氫二鈉4g/L，磷酸二氫鉀4g/L， 七水硫酸鎂0. 3g/L，七水硫酸亞鐵0. 05g/L，瓊脂20g/L，pH7. 5,培養基121°C滅菌20分鐘。
[0048] 復篩培養基配方及配制方法：表博醇5g/L，磷酸氫二鈉4g/L，磷酸二氫鉀4g/L，七 水硫酸鎂〇. 3g/L，七水硫酸亞鐵0. 05g/L，瓊脂20g/L，pH7. 5,培養基121°C滅菌20分鐘。
[0049] 1. 4菌種搖瓶轉化能力測試：將誘變后的菌株接種到液體培養基上，31 °C， 150rpm，培養48小時，再接種到轉化培養基中，接種量10%，在31°C，200rpm，轉化72小時， 取樣送液相檢測，根據液相結果對比突變后的菌株轉化能力優劣，最終確定目標菌株。
[0050] 液體培養基配方及配制方法：胰蛋白胨5g/L，酵母膏0. 5g/L，葡萄糖6g/L，牛肉膏 l〇g/L，磷酸氫二鉀2g/L，玉米漿54g/L，余量為水，lmol/L氫氧化鈉溶液調pH7. 0~7. 2， 121°C滅菌20分鐘。
[0051] 轉化培養基配方及配制方法：玉米漿54g/L，牛肉膏10g/L，胰蛋白胨5g/L，磷酸氫 二鉀2g/L，葡萄糖6g/L，酵母膏0. 5g/L，硫酸銨10g/L，檸檬酸lg/L，吐溫-801g/L，卵磷脂 0· 25g/L，豆油64g/L，植物留醇10g/L，余量為水。
[0052] 經過以上誘變選育工作，得到一株優良的突變株，分類命名為偶發分枝桿菌 (Mycobacterium fortuitum)突變株SZ-BBC-101，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心，保藏編號是CGMCC 9725,保藏日期是2014年9月25日。中國微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中心簡稱CGMCC，位于北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科 學院微生物研究所。
[0053] 偶發分枝桿菌突變株SZ-BBC-101，CGMCC 9725有如下特征：在不同生長環境下， 菌體形態呈現差別，但基本上均為短桿狀，菌落表面粗糙，邊緣不規則，顏色為灰白色或淡 黃色，菌體尺寸較一般細菌小，長約〇. 6~1. 0微米，寬0. 3~0. 4微米。可將植物甾醇降 解轉化為表博醇，并在胞外大量積累，純化方便，產率高。
[0054] 實施例2.偶發分枝桿菌突變株SZ-BBC-101液體菌劑制備方法。
[0055] 2. 1斜面固體培養基的配制：胰蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，葡萄糖12g/L，牛肉 膏〇. 5g/L，磷酸氫二鉀0. 5g/L，按實際需要秤取以上物質，余量為水，攪拌溶解，lmol/L氫 氧化鈉溶液調PH7. 5,加入瓊脂2. 0%，加熱溶清，分裝至茄型瓶中，加入量約為茄型瓶的 20%，然后塞好膠塞，于121°C滅菌20分鐘，冷卻到70°C擺放斜面，冷卻至室溫凝固后，31°C 空培48小時，無菌落出現則可以使用。
[0056] 2. 2液體種子培養基的配制：胰蛋白胨5g/L，酵母膏0. 5g/L，葡萄糖6g/L，牛肉膏 l〇g/L，磷酸氫二鉀2g/L，玉米漿54g/L，lmol/L氫氧化鈉溶液調pH7. 0~7. 2,余量為水， 12 rc滅菌20分鐘，冷卻到室溫。
[0057] 2. 3將偶發分枝桿菌突變株SZ-BBC-101接種到斜面固體培養基上，于31°C培養7 天。從斜面固體培養基上刮取菌體接種到液體種子培養基中，在31°C，150rpm，培養48小 時，得液體菌劑。
[0058] 2. 4取樣計數，按生物量測定方法測菌體含量，按重量計，該液體菌劑的含生物量 約為1 %~1. 5%，余量為培養過偶發分枝桿菌突變株的培養基。
[0059] 生物量測定方法：取100ml樣品，抽濾，濾渣刮下，放置在濾紙上將培養基吸干，稱 重結果如下。
[0060]
[0061] 實施例3.偶發分枝桿菌突變株SZ-BBC-101菌株及液體菌劑的應用。
[0062] 3. 1檢測方法
[0063] (1)高效液相色譜檢測條件
[0064] 流動相：甲醇：水=70 : 30,流速：1.0ml/min，檢測波長：254nm，柱溫：25°C，進 樣量：1〇μ 1，溶液配制：準確稱取15mg供試品，用甲醇稀釋至50ml，操作：分別進10μ 1空 白溶液和測試液。
[0065] (2)重量收率=(表博醇重量+底物重量）X 100%。
[0066] 3.2乩搖瓶轉化
[0067] 發酵培養：將液體菌劑接種到滅菌后的轉化培養基中，接種量為10%，于31°C， 200rpm，轉化72小時，轉化培養基配方為玉米楽54g/L，牛肉膏10g/L，胰蛋白胨5g/L，磷酸 氫二鉀2g/L，葡萄糖6g/L，酵母膏0. 5g/L，硫酸銨10g/L，梓檬酸lg/L，吐溫-801g/L，卵磷 脂0.258/1，豆油16(^/1，總含量95%植物留醇258/1，余量為水 ；
[0068] 分離提取：取樣，薄層色譜（TLC)點板檢測，轉化完全，加熱至75-80°C，并充分攪 拌混勻，靜置分層，取油層，用3體積95%乙醇萃取三次，乙醇萃取液濃縮至絕大部分結晶 析出，離心得到表博醇萃取粗品，1. 5體積的正己烷攪拌保溫（55-57°C ) 2小時，過濾除油 得到表博醇除油半成品，7體積95%乙醇，5%重量的活性碳攪拌保溫（58-60°C ) 2小時，離 心分離活性炭，料液濃縮得到表博醇脫色半成品，2體積95%乙醇攪拌保溫（58-60°C ) 2小 時，充分溶解，冷卻水緩慢降溫至30°C，再用冰水冷卻到15°C析晶，離心分離得到表博醇精 制半成品，70°C，-0. 07MPa，干燥12小時，得到表博醇精制成品，送高效液相色譜檢測含量， 表博醇重量收率如下。
[0069]

[0070] 3· 3 50L發酵罐轉化
[0071] 發酵培養：將液體菌劑接種到滅菌后的轉化培養基中，轉化培養基裝樣量為27L， 接種量為10 %，共計30L，轉化溫度31°C，攪拌速度400rpm，空氣流量為30-35L/min，罐壓為 0. 05MPa，轉化66小時。轉化培養基配方為玉米漿54g/L，牛肉膏10g/L，胰蛋白胨5g/L，磷 酸氫二鉀2g/L，葡萄糖6g/L，酵母膏0. 5g/L，硫酸銨10g/L，梓檬酸lg/L，吐溫-801g/L，卵 磷脂0.258/1，豆油16(^/1，總含量95%植物留醇25 8/1，余量為水。
[0072] 取樣，薄層色譜（TLC)點板檢測，轉化完全，加熱至75-80°C，并充分攪拌混勻，靜 置分層，取油層，用3體積95 %乙醇萃取三次，乙醇萃取液濃縮至絕大部分結晶析出，離心 得到表博醇萃取粗品，1. 5體積的正己烷攪拌保溫（55-57°C ) 2小時，過濾除油得到表博醇 除油半成品，7體積95%乙醇，5%重量的活性碳攪拌保溫（58-60°C ) 2小時，離心分離活性 炭，料液濃縮得到表博醇脫色半成品，2體積95%乙醇攪拌保溫（58-60°C ) 2小時，充分溶 解，冷卻水緩慢降溫至30°C，再用冰水冷卻到15°C析晶，離心分離得到表博醇精制半成品， 70°C，-0. 07MPa，干燥12小時，得到表博醇精制成品送高效液相色譜檢測，高效液相色譜譜 圖見圖2,表博醇重量收率43. 0%。
[0073] 根據圖2顯示的產物及雜質如下：
本發明相關技術方案的保護范圍并不限于實施例中的內容，實施例的內容僅起到解釋 本發明技術方案的示例性作用，與實施例相關技術方案的變體或常規參數調整后的技術方 案仍在本發明的保護范圍內。
【主權項】
1. 一株偶發分枝桿菌（Mycobacteriumfortuitum)突變株SZ-BBC-lOl，其在中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號是CGMCC 9725。2. -種含有權利要求1所述突變株的液體菌劑，按重量計，該菌劑含菌體生物量是 1%~1. 5%〇3. -種制備權利要求2所述液體菌劑的方法，該方法包括下列步驟： A斜面種子培養：將權利要求1所述的偶發分枝桿菌突變株SZ-BBC-IOl接種于固體培 養基上，30-32 °C培養； B液體種子培養：從A步驟中培養的固體斜面上刮取菌體，接種到液體培養基中， 150rpm，30-32 °C 培養； C獲得液體菌劑：按菌體濕重計，獲得含菌體生物量是1 %~1. 5%的液體菌劑，余量為 培養權利要求1所述偶發分枝桿菌突變株的液體培養基； 其中，所述固體培養基包括：胰蛋白胨l〇g/L，酵母膏10g/L，葡萄糖12g/L，牛肉膏 〇. 5g/L，磷酸氫二鉀0. 5g/L，瓊脂1. 5 % -2. 0 %，余量為水； 所述液體培養基包括：胰蛋白胨5g/L，酵母膏0. 5g/L，葡萄糖6g/L，牛肉膏10g/L，磷酸 氫二鉀2g/L，玉米漿54g/L，余量為水。4. 權利要求1所述的突變株在發酵生產表博醇中的應用，所述表博醇的結構式為：5. 權利要求2所述的液體菌劑在發酵生產表博醇中的應用，其中所述表博醇的結構式 為：6. -種生產表博醇的方法，該方法包括下列步驟： ① 發酵培養：將權利要求2所述的液體菌劑接種到轉化培養基中培養，接種量為 10%~15%，轉化溫度為30-321：，轉速為200-400印111，空氣流量為30-35171^11，罐壓為 0. 045±0. 055MPa ; ② 分離提取：加熱分層，取油層，乙醇萃取，濃縮離心，正己烷過濾除油，乙醇活性炭脫 色，濃縮，乙醇精制，析晶，干燥得表博醇； 其中所述轉化培養基包括：玉米漿54g/L，牛肉膏10g/L，胰蛋白胨5g/L，磷酸氫二 鉀2g/L，葡萄糖6g/L，酵母膏0. 5g/L，硫酸銨10g/L，檸檬酸lg/L，吐溫-801g/L，卵磷脂 0· 25g/L，豆油160g/L，植物留醇25g/L，余量為水； 所述植物留醇為β_谷留醇，豆留醇，菜油留醇，菜籽留醇，玉米留醇或木留醇中的一 種或多種。7.根據權利要求6中的方法，該方法包括下列步驟： ① 發酵培養：將液體菌劑接種到轉化培養基中培養，接種量為10%，于31°C，轉速 400rpm轉化，轉化時間為66小時，空氣流量為35L/min，罐壓為0. 050MPa ; ② 分離提取：取樣，薄層色譜（TLC)點板檢測，轉化完全，加熱至75-80°C，并充分攪拌 混勻，靜置分層，取油層，用3體積95%乙醇萃取三次，乙醇萃取液濃縮至絕大部分結晶析 出，離心得到表博醇萃取粗品，1. 5體積的正己烷攪拌保溫2小時，保溫溫度為55-57°C，過 濾除油得到表博醇除油半成品，7體積95%乙醇，5%重量百分比的活性碳攪拌保溫2小時， 保溫溫度為58-60°C，離心分離活性炭，料液濃縮得到表博醇脫色半成品，2體積95%乙醇 攪拌保溫2小時，保溫溫度為58-60°C，使其充分溶解，冷卻水緩慢降溫至30°C，再用冰水冷 卻到15°C析晶，離心分離得到表博醇精制半成品，70°C，-0. 07MPa，干燥12小時，得到表博 醇精制成品。
【文檔編號】C12N1/20GK105886418SQ201410717368
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年12月1日
【發明人】陳美華
【申請人】陳美華